王向輝， 黃江平， 崔豐和， 錢海云

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院心胸大血管外科， 湖北 荊州 434020)

微小 RNA-138-5p抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的機(jī)制研究

王向輝△， 黃江平， 崔豐和， 錢海云

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院心胸大血管外科， 湖北 荊州 434020)

目的： 探討微小RNA-138-5p(miR-138-5p)抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的相關(guān)機(jī)制。方法: 以肺癌細(xì)胞A549和H460作為研究對(duì)象，分別轉(zhuǎn)染miR-NC(對(duì)照組)或miR-138-5p(實(shí)驗(yàn)組)；生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)miR-138-5p的靶基因；RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-138-5p、叉頭框蛋白C1(FOXC1)mRNA和波形蛋白(vimentin) mRNA的相對(duì)表達(dá)量；Western blot法檢測(cè)FOXC1、vimentin、E-cadherin、N-cadherin和β-catenin蛋白表達(dá)變化；MTS法和集落形成實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。結(jié)果: miR-138-5p過(guò)表達(dá)顯著降低FOXC1和vimentin的mRNA及蛋白的表達(dá)(P<0.05)，E-cadherin和β-catenin蛋白表達(dá)上調(diào)，N-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(P<0.05)。結(jié)論: miR-138-5p 可以通過(guò)靶向干擾FOXC1和vimentin的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，可能是肺癌基因治療的潛在靶點(diǎn)。

微小RNA-138-5p; 叉頭框蛋白C1； 波形蛋白； 肺癌

肺癌是世界死亡率最高的癌癥之一，盡管診斷方法、外科手術(shù)和放化療技術(shù)近年來(lái)有很大的進(jìn)展，但由于肺癌細(xì)胞具有高度的增殖、轉(zhuǎn)移能力導(dǎo)致肺癌患者的預(yù)后依舊很差[1]。有效的分子靶向治療成為肺癌研究的熱點(diǎn)[2]。越來(lái)越多的證據(jù)表明微小RNA(microRNA，miRNA)的失調(diào)在各種腫瘤發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。 miR-138-5p是miR-138 家族成員之一[4]，其對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究以人肺癌細(xì)胞A549和H460為研究對(duì)象，觀察 miR-138-5p對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。

材料和方法

1材料

肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H460購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)(上海)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone)；miR-138-5p 模擬物和miR-NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(Invitrogen)；RT-qPCR試劑盒和MTS細(xì)胞活力試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司)；抗GAPDH、叉頭框蛋白C1(forkhead box protein C1，F(xiàn)OXC1)、波形蛋白(vimentin)、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體(Cell Signaling)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗(武漢博士德生物有限公司)；ECL發(fā)光液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

2方法

2.1miR-138-5p靶基因預(yù)測(cè) 通過(guò)miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站microRNA.org(http://www.microrna.org/microrna/home.do)和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_61/)并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[4]，我們認(rèn)為miR-138-5p可能的靶基因?yàn)镕OXC1和vimentin，具體序列互補(bǔ)見(jiàn)圖1。

Figure 1. The binding site of miR-138-5p in the target gene 3’UTR.

圖1miR-138-5p與目的基因3’UTR的結(jié)合位點(diǎn)

2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 采用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549和H460，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞為轉(zhuǎn)染對(duì)象，根據(jù)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書分別轉(zhuǎn)染miR-NC(對(duì)照組)和miR-138-5p(實(shí)驗(yàn)組)至肺癌細(xì)胞。12 h后更換新鮮培養(yǎng)基。

2.3RT-qPCR檢測(cè)mRNA 的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h，按照TRIzol試劑說(shuō)明書提取總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，以U6或GAPDH為內(nèi)參照，使用RT-qPCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增并采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各組細(xì)胞miR-138-5p、FOXC1 mRNA和vimentin mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2.4Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑的裂解液冰上裂解 30 min，提取總蛋白。依次完成10% SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%牛血清白蛋白封閉，4 ℃下 I 抗孵育過(guò)夜，室溫下 II 抗孵育1 h，ECL顯影檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平。

2.5MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 轉(zhuǎn)染后24 h，消化吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以每孔3 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板。于鋪板后1、2、3、4和5 d分別采用MTS細(xì)胞活力試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，繪制生長(zhǎng)曲線。具體方法為每孔加入110 μL MTS稀釋液，放回培養(yǎng)箱孵育2 h；清除氣泡，酶標(biāo)儀讀取每孔在490 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)。

2.6集落形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后24 h，消化吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。以每孔1 000個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)10 d后，采用多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色，空氣干燥后計(jì)數(shù)。集落形成率=集落數(shù)/接種的細(xì)胞數(shù)×100%。

2.7劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 消化收集各組細(xì)胞，接種 6 孔板，待細(xì)胞鋪滿孔底，用200 μL槍頭小心在孔底劃痕，PBS 洗滌 3 次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于0 h、12 h和24 h觀察拍照。劃痕愈合率(%)=(0 h 劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2.8Transwell實(shí)驗(yàn) 消化收集各組細(xì)胞，分別使用無(wú)血清培養(yǎng)基制成濃度為1×108cells/L的細(xì)胞懸液，在Transwell 小室的上室中加入細(xì)胞懸液200 μL，下室中加入600 μL含 10% 胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。 取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿膜細(xì)胞和基質(zhì)膠，甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min。鏡下(×100)隨機(jī)選取4個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-138-5p、FOXC1mRNA和vimentinmRNA的表達(dá)

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中miR-138-5p的表達(dá)量分別為1.03±0.28和18 513.12±8 391.65 (t=4.41,P<0.01)，實(shí)驗(yàn)組中FOXC1和vimentin的mRNA表達(dá)分別降低約45.5%(t=3.40,P<0.05)和27.1%(t=3.03,P<0.05)；對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組H460細(xì)胞中miR-138-5p的表達(dá)量分別為1.01±0.16和25 629.68±4 610.69 (t=11.12,P<0.01)，實(shí)驗(yàn)組中FOXC1和vimentin的mRNA表達(dá)分別降低約65.6%(t=3.61,P<0.05)和52.7% (t=3.53,P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The mRNA expression levels of FOXC1 and vimentin. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖2FOXC1和vimentin的mRNA表達(dá)水平

2靶基因及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-138-5p后，肺癌細(xì)胞中FOXC1、vimentin和N-cadherin蛋白的表達(dá)均明顯降低，E-cadherin和β-catenin蛋白的表達(dá)明顯升高，見(jiàn)圖3。

3MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化

與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-138-5p的A549和H460細(xì)胞活力在第5天均有顯著差異(t=2.84,P<0.05；t=4.74,P<0.01)，提示miR-138-5p能抑制肺癌細(xì)胞活力，見(jiàn)圖4。

4集落形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞的集落形成率分別為0.94%±0.36%和1.89%±0.48%(t=3.12,P<0.05)，H460細(xì)胞的集落形成率分別為1.38%±0.23%和2.18%±0.51%(t=2.86,P<0.05)。過(guò)表達(dá) miR-138-5p組細(xì)胞集落形成率明顯降低，結(jié)合細(xì)胞活力的變化，表明miR-138-5p能抑制肺癌細(xì)胞的體外增殖能力，見(jiàn)圖5。

5劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中A549細(xì)胞的劃痕愈合率分別為66.73%±16.30%和37.87%±10.18%(t=3.00,P<0.05)，H460細(xì)胞的劃痕愈合率分別為60.36%±9.07%和33.06%±14.03%(t=3.27,P<0.05)。過(guò)表達(dá) miR-138-5p組細(xì)胞劃痕愈合率明顯降低，表明miR-138-5p能抑制肺癌細(xì)胞的體外遷移能力，見(jiàn)圖6。

6Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為85±19和28±14 (t=4.91,P<0.05)，H460細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為64±19和24±9 (t=3.72,P<0.05)。過(guò)表達(dá) miR-138-5p組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低，表明miR-138-5p能抑制肺癌細(xì)胞的體外侵襲能力，見(jiàn)圖7。

討 論

miRNA是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，miRNA的產(chǎn)生首先由初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pri-miRNA)在細(xì)胞核中被RNase III (Drosha)切割形成前體 miRNA(pre-miRNA)，經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin 5轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，再由RNase III Dicer切割形成成熟的 miRNA[5]。miRNA通過(guò)不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合于靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3’UTR)，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，抑制mRNA的翻譯或者直接誘導(dǎo)mRNA的降解[6]。miRNA 廣泛參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等多種生物學(xué)行為，在近些年的生命科學(xué)研究中，miRNA的研究已經(jīng)成為生命科學(xué)最熱門的研究領(lǐng)域之一[7]。研究發(fā)現(xiàn)miR-138-5p可抑制多種腫瘤的惡性生物學(xué)行為，比如miR-138-5p可通過(guò)靶向干擾SIRT1的表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞的自噬[8]。在膀胱癌細(xì)胞中，miR-138-5p可通過(guò)干擾凋亡抑制蛋白家族成員survivin的表達(dá)抑制細(xì)胞的增殖和侵襲能力[9]。miR-138-5p可逆轉(zhuǎn)包括白血病細(xì)胞、肺癌細(xì)胞的多藥耐藥性[10-11]。在肝癌細(xì)胞中，miR-138-5p通過(guò)干擾SOX9的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)展，抑制肝癌細(xì)胞的增殖[12]。miR-138-5p對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及分子機(jī)制值得研究。

Figure 3. The expression levels of miR-138-5p target proteins and EMT-related proteins. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsmiR-NC group.

圖3miR-138-5p靶蛋白及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

Figure 4. The viability of A459 cells and H460 cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmiR-NC group.

圖4轉(zhuǎn)染后A459和H460細(xì)胞活力的變化

Figure 5. The effect of miR-138-5p on the colony formation capacity of lung cancer cells (crystal violet staining). Mean±SD.n=4.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖5miR-138-5p對(duì)肺癌細(xì)胞集落形成能力的影響

Figure 6. The effect of miR-138-5p on the migration ability of lung cancer cells (×100). Mean±SD.n=4.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖6miR-138-5p對(duì)肺癌細(xì)胞遷移能力的影響

Figure 7. The effect of miR-138-5p on the invasion ability of the lung cancer cells (crystal violet staining, ×100). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsmiR-NC group.

圖7miR-138-5p對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色)

miR-138-5p的靶基因鑒定是其功能研究的關(guān)鍵。我們參考文獻(xiàn)報(bào)道[4]，并結(jié)合miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站microRNA.org和TargetScan，確定miR-138-5p的靶基因?yàn)镕OXC1和vimentin。FOXC1屬于 FOXC 亞族，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[13]。Vimentin能促進(jìn)細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過(guò)程，與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲及耐藥密切相關(guān)[14]。EMT過(guò)程主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞失去自身極性與特性，向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，EMT是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的主要生物學(xué)機(jī)制，E-cadherin和β-catenin蛋白屬于上皮表型，N-cadherin屬于間充質(zhì)表型，均與EMT過(guò)程密切相關(guān)[15-17]。本研究中，過(guò)表達(dá)miR-138-5p后，肺癌細(xì)胞中FOXC1和vimentin蛋白表達(dá)水平明顯下降，MTS實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)顯示肺癌細(xì)胞的活力和增殖能力下降，表明miR-138-5p可能通過(guò)干擾FOXC1的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的增殖。同時(shí)，肺癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白E-cadherin和β-catenin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin表達(dá)下調(diào)，提示肺癌細(xì)胞EMT過(guò)程被抑制；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著下降，表明miR-138-5p可能通過(guò)干擾vimentin的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，miR-138-5p 可能通過(guò)靶向干擾FOXC1和vimentin的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，為以 miR-138-5p為治療靶點(diǎn)的肺癌分子靶向治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。我們下一步將通過(guò)收集臨床肺癌組織標(biāo)本，觀察miR-138-5p表達(dá)水平與患者腫瘤病理分期及預(yù)后的相關(guān)性，研究miR-138-5p在肺癌患者中的生物學(xué)標(biāo)志價(jià)值。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Mechanism of microRNA-138-5p inhibiting proliferation, migration and invasion of lung cancer cells

WANG Xiang-hui, HUANG Jiang-ping, CUI Feng-he, QIAN Hai-yun

(Department of Cardiothoracic Surgery, Jingzhou Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Jingzhou 434020, China. E-mail: jzyywxh@163.com)

AIM: To investigate the mechanism of microRNA-138-5p (miR-138-5p) inhibiting the proliferation, migration and invasion abilities of lung cancer cells.METHODS: The lung cancer A549 and H460 cells were transfected with miR-NC (control group) or miR-138-5p (experimental group). The bioinformatic analysis was performed to predict the target genes of miR-138-5p.The expression levels of miR-138-5p, forkhead box protein C1 (FOXC1) mRNA and vimentin mRNA were detected by RT-qPCR. The protein expression of FOXC1, vimentin, E-cadherin, N-cadherin and β-catenin was determined by Western blot. MTS method and colony formation assay were used to detect cell viability and proliferation ability. Wound healing assay and Transwell assay were used to detect cell migration and invasion ability.RESULTS: Over-expression of miR-138-5p significantly reduced the expression of FOXC1 and vimentin at mRNA and protein levels (P<0.05). The expression of E-cadherin and β-catenin were up-regulated and the expression of N-cadherin was down-regulated. The proliferation, migration and invasion abilities of the lung cancer cells were inhibited by the over-expression of miR-138-5p.CONCLUSION: miR-138-5p inhibits the proliferation, migration and invasion abilities of lung cancer cells by targeting FOXC1 and vimentin. It may be a potential target for lung cancer gene therapy.

MicroRNA-138-5p; Forkhead box protein C1; Vimentin; Lung cancer

1000- 4718(2017)09- 1631- 06

2017- 03- 22 [

] 2017- 06- 20

R734.3； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.016

△通訊作者 Tel： 18107168104； E-mail： jzyywxh@163.com