王辰，劉杰，2，李倩，李斯雯，張鈺

（1.吉林化工學院材料科學與工程學院，吉林吉林132022；2.鄭州大學材料科學與工程學院，河南鄭州450001）

金納米棒包覆鎢酸鈉釔粉體的制備及光熱診療性能研究

王辰1，劉杰1，2，李倩1，李斯雯1，張鈺1

（1.吉林化工學院材料科學與工程學院，吉林吉林132022；2.鄭州大學材料科學與工程學院，河南鄭州450001）

為了擴展低長徑比金納米棒在信息、生物及醫(yī)學等領域的應用范圍，通過水熱合成法摻雜稀土元素在金納米棒表面包覆鎢酸鈉釔，制備出了熒光GNRs@NaY（WO4）2粉體。其相組成、顯微組織形貌、發(fā)光性能、光熱能力分別通過X射線衍射儀（XRD）、透射電鏡（TEM）、熒光光譜儀（PL）和光熱成像儀（PTI）進行檢測。結果表明：熒光GNRs@NaY（WO4）2粉體的相組成、尺寸及形貌均勻一致；在980 nm激光激發(fā)下，Yb3+/Er3+共摻雜使樣品呈現(xiàn)很強的綠光（4S3/2，2H11/2→4I15/2）和紅光（4F9/2→4I15/2）；由于熒光共振能量遷移（FRET）機制影響，樣品在紅光區(qū)的發(fā)射強度下降，但其表面溫度隨時間的延長不斷增加；與此同時，該粉體具有良好的生物相容性、低溶血性和一定的抗癌能力。

金納米棒；鎢酸鈉釔；水熱合成；納米材料；光熱診療；生物相容性；抗癌

金納米棒（GNRs）因其具有很多特有的理化性質，現(xiàn)已廣泛應用于生物醫(yī)學領域[1-3]，但在癌癥及腫瘤治療方面仍存在一些不足。首先，GNRs在合成過程中，不可避免地會殘留表面活性劑（如十六烷基三甲基溴化銨、聚乙烯基吡咯烷酮等），這些表面活性劑往往具有一定的毒性，會對體內健康組織造成不同程度的傷害[4]。其次，為使GNRs有利于生物細胞組織吸收吞噬，制得GNRs的長徑比往往較低（＜3）[5]。GNRs長徑比的降低導致其吸收峰藍移，激發(fā)波長由近紅外、紅光區(qū)向綠光區(qū)移動[6-7]。但若激發(fā)波長在綠光區(qū)，相比于紅光區(qū)激發(fā)，其組織穿刺深度將顯著下降，這會影響其激發(fā)效果，甚至完全失效[8]。為此，本次試驗設計利用鎢酸鈉釔上轉換熒光材料，對GNRs表面進行包覆處理。該方案不僅可以降低其毒性，同時還可以將穿透性強的近紅外光轉換為能夠被長徑比低的GNRs吸收的綠光和黃光，增強GNRs的光熱轉換能力[9-12]。作為一種被大家熟知的無機材料，鎢酸鈉釔用于生物診療材料的表面改性有很多優(yōu)勢。首先，無機物的體內性狀相對金屬及有機物更加穩(wěn)定，毒性較小。其次，鎢酸鹽是一種良好的熒光基質材料，有利于稀土離子活化及能量傳遞。最后，工藝成熟穩(wěn)定、可控性好、不易產生副產物。以GNRs為核鎢酸鹽為殼的結構設計，可以有效發(fā)揮GNRs的光熱特性，并且工藝相對簡單，易于滿足其成像及光熱治療的要求[13-15]。

1 試驗

1.1 試劑

未經提純直接使用的有十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），硝酸銀（AgNO3），四水氯金酸（HAuCl4· 4H2O），硼氫化鈉（NaBH4），抗壞血酸，二水鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O），六水硝酸釔（Y（NO3）3·6H2O），油胺，油酸，環(huán)己烷，無水乙醇（C2H5OH）。此外，氯化鐿（YbCl3）和氯化鉺（ErCl3）水溶液則是通過在稀鹽酸中對應溶解氧化鐿（Yb2O3）和氧化鉺（Er2O3），并在高溫下干燥，隨后用在真空下蒸發(fā)水的方法來制備。

1.2 GNRs的合成

將5 mL的CTAB溶液（0.2 mol/L）與5 mL的HAuCl4（0.0005mol/L）溶液混合，隨后快速注入0.6mL，0.01 mol/L的NaBH4溶液（冰浴）。劇烈攪拌2 min后，溶液由棕黃色逐漸變?yōu)榈S色。攪拌結束后，保持種子溶液穩(wěn)定在25℃?zhèn)溆谩?/p>

將5 mL的CTAB溶液（0.2 mol/L），0.20 mL的硝酸銀溶液（0.004 mol/L）和5 mL的HAuCl4溶液（0.001 mol/L）混合后，輕微攪拌30 s。隨后，向溶液中加入70 μL的抗壞血酸（0.078 8 mol/L），使生長溶液的顏色由深黃色變?yōu)闊o色。最后，將12 μL的種子液注入生長溶液中。在30℃條件下，生長溶液靜置過夜，待第二天溶液變?yōu)樯罴t色后，將所得溶液用超純水離心清洗三次，濃縮溶液至1 mL。

1.3 NaY（WO4）2及粉體的合成

將2 mL含3 mol%Yb3+和1 mol%Er3+摻雜的Y（NO3）3溶液（0.15 mol/L），2 mL油酸，1.783 g油胺和20 mL C2H5OH置于燒杯中用玻璃棒進行簡單混合，隨后劇烈攪拌30 min使其形成澄清溶液。完成上述步驟后，向燒杯中加入0.198 g（約0.6 mmol）的Na2WO4·2H2O，并在室溫下連續(xù)攪拌1 h。攪拌過后，將溶液密封于50 mL特氟隆不銹鋼高壓釜中，升溫至160℃，保持12 h。待高壓釜自然冷卻至室溫后，收集容器的底部產物，用環(huán)己烷和C2H5OH洗滌數(shù)次，去除多余的表面活性劑。最后，將產物在80℃的烘箱中干燥8 h后取出獲得含Yb3+/Er3+共摻雜的NaY（WO4）2∶Yb3+/Er3+（簡寫為NaY（WO4）2，下同）粉體。

為了對比，重復以上合成過程，并進一步添加1 mL的GNRs濃縮液至反應釜中，制備出了GNRs@NaY（WO4）2粉體。

1.4 測試與表征

利用X射線衍射儀（Rigaku D/max-TTR-Ⅲ，CuKα，λ=0.15405nm）對試樣進行X射線衍射（XRD）測試。利用透射電子顯微鏡（JEOL-3100，200 kV）對試樣進行顯微組織形貌觀察（TEM）。采用紅外熱像儀（TiX660，F(xiàn)LUKE）拍攝試樣在980 nm激光（0.6 W/cm2，16 min）激發(fā)下的紅外熱像，測試其溫度變化及光熱成像能力。使用980 nm LD模塊（K98D08M-30W）作為激發(fā)源，用熒光光譜儀（波長范圍400～700 nm，R955，HAMAMATSU）檢測試樣的發(fā)射光譜。以上所有的檢測工作均在室溫下進行。利用標準MTT法和細胞試驗對試樣的生物相容性和毒性等進行測試。一般地，根據(jù)試驗需求，將L929/HeLa細胞種于96孔板內，37℃培養(yǎng)過夜。利用培養(yǎng)基將納米顆粒稀釋到15.625μg/mL、31.25μg/mL、62.5 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL，留出1組空白對照組，其余7組對應添加不同濃度的納米顆粒溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入20 μL、5 mg/mL的 MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)后，每孔加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），10 min后利用酶標儀測試其吸光度值。

2 結果與分析

2.1 GNRs@NaY（WO4）2粉體的相組成及顯微組織形貌

通過將所有試樣的XRD圖譜與標準PDF卡片比對分析可知，NaY（WO4）2及GNRs@NaY（WO4）2粉體可以采用一步水熱法合成制備，其晶型與PDF衍射峰對應整齊（如圖1）。由于GNRs的加入，GNRs@NaY（WO4）2粉體與NaY（WO4）2粉體相比，明顯地多出了Au的對應衍射峰（如圖1中JCPDS No. 65-2870所示）。通過對GNRs及GNRs@NaY（WO4）2粉體的透射電鏡圖像進行觀察可知，GNRs@NaY（WO4）2粉體的內核為金納米棒，外層包覆有鎢酸鈉釔層，殼層包覆厚度約為2～3 nm（如圖2所示）。此外，GNRs@NaY（WO4）2粉體包覆均勻，分散性良好，為其在催化及生物領域應用打下基礎。

圖1 粉體試樣的XRD圖譜Fig.1XRD patterns of the powder sample

2.2 鎢酸鈉釔粉體的熒光性能

在眾多用于稀土離子熒光活化的載體中，鎢酸鹽作為一種良好的基質材料，廣泛用于熒光、催化及生物醫(yī)學等領域。為了使鎢酸鹽的獲得上轉換熒光，提高激發(fā)波長，增加組織穿刺深度，采用Yb3+/Er3+共摻雜的方式，完成上轉換能量傳遞，具體能量傳遞機制如圖3所示。其中，2H11/2→4I15/2和4S3/2→4I15/2為綠光發(fā)射，4F9/2→4I15/2為紅光發(fā)射。在NaY（WO4）2基體中，Yb3+/Er3+將980 nm激光利用上轉換熒光傳遞的方式，使綠光區(qū)和紅光區(qū)均有一定的發(fā)射強度，其發(fā)射光譜如圖4所示。由于GNRs的吸收光區(qū)恰好與此發(fā)射光區(qū)相吻合，故添加GNRs后制備的GNRs@NaY（WO4）2粉體，其綠光及紅光的發(fā)射強度均有大幅度下降，其綠光發(fā)射區(qū)和紅光發(fā)射區(qū)的降幅分別達到了69.84%和86.73%。這說明部分熒光發(fā)射被金納米棒局域等離子體共振所吸收，實現(xiàn)了熒光能量共振轉移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET），這為其光熱轉換過程提供了能量基礎[12]。

圖2 金納米棒及金納米棒包覆鎢酸鈉釔粉體的透射電鏡照片F(xiàn)ig.2TEMimagesofGNRsandGNRs@NaY（WO）42compositepowder

圖3 Yb3+/Er3+共摻雜在980nm激發(fā)下的能量傳遞機制Fig.3EnergytransfermechanismofYb3+/Er3+co-dopedunder980nm laser excitation

圖4 鎢酸鈉釔和金納米棒包覆鎢酸鈉釔粉體的發(fā)射光譜Fig.4EmissionspectrumofNaY（WO）42andGNRs@NaY（WO4）2powder

2.3 粉體顆粒在水溶液中的光熱能力

將GNRs@NaY（WO4）2粉體轉水后溶于裝有2mL水的離心管中，并且用980 nm激光對其進行照射。從開始照射記錄時間，每隔2 min用紅外熱像儀對離心管進行紅外攝影，其紅外熱像如圖5所示。從圖中我們可以看出，隨著激光束照射時間的推移，試樣的溫度越高。由于激光束是從上至下對溶液進行照射的，受擴散作用影響，溶液最高溫度所在區(qū)域逐漸由離心管口（熱像圖上部）向離心管中心（熱像圖中部）遷移。其溫度從照射開始時的27.3℃，照射16min以后，逐漸升高至51.5℃。溶液溫度的大幅度上升，說明GNRs@NaY（WO4）2粉體的光熱轉換能力較強。

圖5 980nm激發(fā)下GNRs@NaY（WO4）2粉體在不同時間的紅外熱像Fig.5Infrared thermal images of GNRs@NaY（WO）42powder with 980 nm laser excitation at different times

2.4 毒理學分析

用標準MTT測試法對GNRs@NaY（WO4）2粉體進行細胞相容性測試，結果如圖6所示。不同濃度的粉體與細胞共同放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，L929體纖維細胞成活率沒有明顯變化，普遍在100%附近，這說明GNRs@NaY（WO4）2粉體對L929體纖維細胞的影響可以忽略不計，具有良好的生物相容性。利用人血紅細胞對不同濃度的GNRs@NaY（WO4）2粉體進行溶血性試驗可知（如圖7），細胞的溶血率在1.2%～2.5%之間變化，溶血率較低，且沒有隨濃度增加而升高的趨勢，這可以證明GNRs@NaY（WO4）2粉體對人血紅細胞不具有特定的殺傷作用。針對GNRs@NaY（WO4）2粉體的毒性測試，我們選用了HeLa細胞輔以980 nm激光照射的方式進行，結果如圖8所示。MTT測試結果顯示，GNRs@NaY（WO4）2粉體濃度越大，HeLa細胞的存活率越低，即殺滅率越高。結合細胞相容性試驗及溶血性試驗可知，粉體濃度升高，殺滅率增加主要是光熱效應對癌細胞產生殺傷所致，并非粉體本身具有毒性。以上結果顯示，GNRs@NaY（WO4）2粉體具有一定的生物醫(yī)學應用潛力。

圖6 與不同濃度金納米棒包覆鎢酸鈉釔粉體共存24 h后的L929體纖維細胞成活率Fig.6L929fibroblastcellviabilityinthepresenceofGNRs@NaY（WO）42powderwithdifferentconcentrationsfor24h

圖7 針對人血紅細胞金納米棒包覆鎢酸鈉釔粉體的溶血性測試Fig.7Hemolytic assay of GNRs@NaY（WO4）2powder to human red blood cells

圖8 980nm激光照射下不同濃度的金納米棒包覆鎢酸鈉釔粉體與HeLa細胞培養(yǎng)24 h后MTT測試結果Fig.8MTT assays results of HeLa cells incubated with GNRs@NaY（WO4）2powder for 24 h at various concentrations with980 nm laser irradiation

3 結論

（1）GNRs@NaY（WO4）2粉體是以金納米棒為內核，外層包覆有2～3 nm的鎢酸鈉釔殼層，形貌均勻，分散性良好。

（2）Yb3+/Er3+共摻雜及GNRs獨特的吸收峰位置，使GNRs@NaY（WO4）2粉體在綠光區(qū)及紅光區(qū)均有熒光能量共振轉移現(xiàn)象；紅外熱像顯示980 nm激光照射下，粉體具有良好的光熱轉換能力。

（3）GNRs@NaY（WO4）2粉體在生物醫(yī)學領域顯示出了良好的生物相容性、低溶血性和低毒性，具有一定的應用潛力。

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Preparation and Photothermal Theranostics Property of Gold Nanorods Coated with Sodium Tungstate Yttrium Powder

WANG Chen1,LIU Jie1,2,LI Qian1,LI Siwen1,ZHANG Yu1
(1.School of Materials Science and Engineering,Jilin Institute of Chemical Technology,Jilin 132022,Jilin,China;2.School of Materials Science and Engineering,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,Henan,China)

The fluorescent GNRs@NaY(WO4)2powders were prepared by coating the sodium tungstate yttrium on the surface of gold nanorods with hydrothermal synthesis and by doping rare earth elements to extend the application range of low-diameter-ratio gold nanorods in the fields of information,biology and medicine.Its phase composition, microstructure morphology,luminous properties,light and heat capacity were measured by XRD,transmission electron microscopy(TEM),fluorescence spectroscopy(PL)and photothermometer(PTI)respectively.The results show that the phase composition,size and morphology of the fluorescent GNRs@NaY(WO4)2powder are uniform.Under the excitation of 980 nm laser,the Yb3+/Er3+co-doping makes the sample show a strong green light(4S3/2,2H11/2→4I15/2) and red light(4F9/2→4I15/2).The emission intensity of the sample in the red region is decreased due to the fluorescence resonance energy migration(FRET)mechanism,but its surface temperature increases with time.At the same time, the powder has good biocompatibility,hemolysis and certain anti-cancer ability.

goldnanorods;sodiumtungstateyttrium;hydrothermalsynthesis;nanomaterials;photothermaltheranostics; biocompatibility;anti-cancer

TF125；TB333

A

（編輯：游航英）

10.3969/j.issn.1009－0622.2017.04.010

2017-07-18

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20130102005JC）；吉林市科技創(chuàng)新發(fā)展計劃項目（20161205）

王辰（1988-），男，遼寧清原人，碩士，主要從事金屬-無機非金屬材料粉末冶金研究工作。

張鈺（1972-），女，吉林吉林人，博士，教授，主要從事材料科學與能源工程研究工作。