韓熙淵,韓麗紅

1.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院肝膽胰微創(chuàng)中心，內(nèi)蒙古包頭 014030；2.包頭醫(yī)學(xué)院基因診斷研究所，內(nèi)蒙古包頭 014060

*病理研究*

胃癌與mTOR信號通路的相關(guān)性研究

韓熙淵1,韓麗紅2

1.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院肝膽胰微創(chuàng)中心，內(nèi)蒙古包頭 014030；2.包頭醫(yī)學(xué)院基因診斷研究所，內(nèi)蒙古包頭 014060

目的 研究胃癌與mTOR信號通路的相關(guān)性。 方法 選取2014年1月—2015年12月在包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院診治的50例胃癌患者，采用免疫印跡技術(shù)及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，就其癌旁胃組織及癌組織實施檢測，另選取同期50例非胃癌患者，就其mTOR相應(yīng)表達(dá)狀況予以檢測；且對mTOR表達(dá)與臨床參數(shù)關(guān)系予以分析。 結(jié)果mTOR在胃癌組織中的表達(dá)水平高于正常胃組織及癌旁胃組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；mTOR mRNA在胃癌組織相應(yīng)表達(dá)當(dāng)中呈現(xiàn)為正相關(guān)，而其在正常胃組織及癌旁胃組織表達(dá)當(dāng)中也呈現(xiàn)為正相關(guān)。mTOR mRNA在胃癌組織當(dāng)中相應(yīng)表達(dá)水平，則相關(guān)于有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期等，而不相關(guān)于性別及腫瘤直徑等。 結(jié)論 針對胃癌患者，mTOR信號通路在其組織當(dāng)中特異性激活，而mTOR信號通路可能作用于胃癌的發(fā)生及發(fā)展。

胃癌；mTOR信號通路；免疫印跡

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位于第3位。目前，手術(shù)仍是唯一根治性的胃癌治療手段，但是大部分患者在初次診斷時已處于疾病的進(jìn)展期，失去手術(shù)機會。近年來研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR)是雷帕霉素的靶蛋白,是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶?？梢栽诙喾N因素的活化下參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯起始、核糖體生物合成、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能,是細(xì)胞生長、分化的中心調(diào)控者[1]。它不僅在正常細(xì)胞的生長增殖中起著極其重要的作用,而且與正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及癌細(xì)胞的生長增殖密切相關(guān)。在許多人類腫瘤均呈高表達(dá),與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。該次研究通過選取2014年1月—2015年12月在包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院診治的50例胃癌患者，就mTOR信號通路與胃癌組織相關(guān)性予以分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月—2015年12月在包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院院行手術(shù)根治切除的50例新鮮胃癌患者，于手術(shù)前均未采用化療及放療經(jīng)歷，且均為首次手術(shù)，收集胃癌組織、癌旁組織(腫瘤邊緣4 cm處)；另選取同期50例非胃癌患者，均為胃十二指腸潰瘍，且均采取胃大部切除術(shù)治療，取其組織，均防止于液氮罐內(nèi)，實施冷凍保存。所選取觀察組胃癌患者中，男性患者為37例，女為13例，年齡39～75歲，平均年齡為48.8歲，病程1～5年，患者均經(jīng)相關(guān)病理學(xué)診斷確診病癥類型。對照組患者男性患者為32例，女為18例，年齡42～71歲，平均年齡為45.6歲，病程1～5年。兩組患者性別、年齡、病程等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 RT-PCR檢測

依據(jù)總RNA提取試劑盒相應(yīng)說明書，就胃癌組織總RNA實施提?。欢笠罁?jù)RT-PCR試劑盒相應(yīng)說明書，開展逆轉(zhuǎn)錄操作，最終合成cDNA；PCR相應(yīng)反應(yīng)過程為93℃2 min預(yù)變性，93℃ 25 s，61℃ 30 s，72℃ 60 s，且經(jīng)持續(xù)循環(huán)反應(yīng)30個。取出3 μL產(chǎn)物，將其放置于濃度為2%瓊脂糖凝膠電泳之中，以做結(jié)果分析之用，（目的基因灰度值-背景灰度值）/（基因灰度值-背景灰度值）=目的基因表達(dá)相對水平。

1.3 蛋白免疫印跡試驗

將各個實驗組相應(yīng)病理組織實施收集，依據(jù)蛋白提取試劑盒相應(yīng)說明書，將細(xì)胞總蛋白予以提取，采用Brad-ford蛋白分析儀器，將蛋白濃度完成測定，且將濃度為9%SDS-聚丙烯酰胺凝膠予以灌制，然后則依次實施電泳及轉(zhuǎn)膜操作，最后封閉，時間控制在1 h，將一抗（1∶500）加入，且控制溫度（4℃）環(huán)境下，開展孵育過夜，然后將二抗（1：5 000）加入，且于室溫環(huán)境下，實施孵育，時間控制于1 h，最后將ECL加入，開展暗室顯影。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)處理所得數(shù)據(jù)，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示計量資料，對其實施t檢驗，采用直線相關(guān)分析兩因素的相關(guān)性，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mTOR在正常胃組織、癌旁組織及胃癌中的表達(dá)情況分析

mTOR在胃癌組織當(dāng)中相應(yīng)表達(dá)水平高于正常胃組織及癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 mTOR在正常胃組織、癌旁組織及胃癌中的表達(dá)的相關(guān)性（±s）

表1 mTOR在正常胃組織、癌旁組織及胃癌中的表達(dá)的相關(guān)性（±s）

組別 mTOR r P胃癌組織（n=50）癌旁組織（n=50）非胃癌胃組織（n=50）0.602±0.117 0.420±0.101 0.376±0.065 0.536 0.590 0.625 0.019 0.003 0.010

2.2 非胃癌胃組織、癌旁胃組織及胃癌組織當(dāng)中pmTOR表達(dá)的關(guān)系分析

基于mRNA水平相應(yīng)mTOR，其在非胃癌胃組織（r= 0.625，P=0.010）、癌旁組織（r=0.590，P=0.003）及胃癌（r= 0.536，P=0.019）當(dāng)中，呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)。同見表1。

2.3 mTOR在胃癌中的相應(yīng)表達(dá)及臨床病理特征關(guān)系分析

mTOR在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相應(yīng)胃癌組織當(dāng)中的表達(dá)相比于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中mTOR的相應(yīng)表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；至此，mTOR mRNA在胃癌組織相應(yīng)表達(dá)當(dāng)中呈現(xiàn)為正相關(guān)，而其在正常胃組織及癌旁胃組織表達(dá)當(dāng)中也呈現(xiàn)為正相關(guān)。mTOR mRNA在胃癌組織當(dāng)中相應(yīng)表達(dá)水平，則相關(guān)于有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期等，而不相關(guān)于性別及腫瘤直徑等。見表2。

表2 mTOR在胃癌中的相應(yīng)表達(dá)及臨床病理特征關(guān)系（±s）

表2 mTOR在胃癌中的相應(yīng)表達(dá)及臨床病理特征關(guān)系（±s）

臨床參數(shù)mTOR mRNA性別男（n=37）女（n=13）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有（n=39）無（n=11）病理分期Ⅰ～Ⅲ期（n=29）Ⅳ期（n=21）腫瘤直徑（cm）＜4（n=17）≥4（n=33）年齡（歲）＜60（n=35）≥60（n=15）0.618±0.149 0.577±0.150 0.778±0.169 0.527±0.166 0.500±0.187 0.725±0.158 0.569±0.233 0.610±0.135 0.638±0.188 0.580±0.135

3 討論

mTOR對細(xì)胞正常生長、增殖、分化等起著極其重要的作用,且與正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及癌細(xì)胞的生長增殖密切相關(guān)[4-6]。乳腺癌、胃癌、白血病、胃腸道間質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、腎癌、肺癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)存在通路的異常激活[7-9]。

張剛等[10]采用免疫組織化學(xué)法及Westernblot方法檢測P-AKT及P-mTOR在胃癌(100例)、癌旁(80例)及胃組織正常黏膜(100例)中的表達(dá)水平，結(jié)果p-mT0R在胃癌、癌旁及胃組織正常黏膜中的陽性表達(dá)均呈降低趨勢，與Westernblot結(jié)果一致。p-AKT在胃癌中的表達(dá)與腫瘤分化程度有關(guān)，p-mTOR在胃癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。p-AKT及p-mTOR在同一例胃癌患者中表達(dá)呈顯著正相關(guān)。通過該次研究結(jié)果可知，通過運用免疫印跡技術(shù)及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)實施檢測，非胃癌胃組織及癌旁胃組織當(dāng)中的mTOR相應(yīng)表達(dá)水平相比于胃癌組織，均低于后者，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），從中可知，在胃癌組織當(dāng)中所存在的mTOR信號通路，則可能存在被異?；罨癄顩r，此外，當(dāng)mTOR具有越高的表達(dá)水平，mTOR下游相應(yīng)靶點 P70S6K就會具有越高的P70S6K的表達(dá)水平，二者之間呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)。另外，mTOR信號通路在具體的胃癌組織當(dāng)中所具有的表達(dá)，則密切相關(guān)于有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤病理分期，比如mTOR在存有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相應(yīng)胃癌組織當(dāng)中所具有的表達(dá)值為（0.778±0.169），而不存在相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織表達(dá)量則為（0.527±0.166），因此，二者之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，對于腫瘤直徑、性別及年齡等資料而言，則彼此之間不存在相關(guān)性。

綜上所述，胃癌的發(fā)生發(fā)展與mTOR信號通路活化密切相關(guān)，提示mTOR在胃癌組織中的高表達(dá)有可能抑制了細(xì)胞的正常凋亡，使腫瘤細(xì)胞的生存期延長，促進(jìn)胃癌的發(fā)生，使腫瘤的惡性程度和生存能力提高，更容易通過侵襲組織而發(fā)生轉(zhuǎn)移。

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Research on Correlation between the Gastric Cancer and mTOR Signaling Pathway

HAN Xi-yuan1,HAN Li-hong2
1.Hepatobiliary Pancreatic Minimal Invasive Center,Second Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Baotou,Inner Mongolia, 014030 China；2.Institute of gene diagnosis,Baotou Medical College,Baotou,Inner Mongolia,014060 China

Objective To research the correlation between the gastric cancer and mTOR signaling pathway.Methods 50 cases of patients with gastric cancer diagnosed in our hospital from January 2014 to December 2015 were selected and the paracancerous gastric tissue and cancer tissues were tested by the immunoblot assay and reverse transcription-polymerase chain reaction technique,and 50 cases of patients with non-gastric cancer at the same period were selected and the mTOR expression was tested and the correlation between the mTOR expression and clinical parameters was analyzed.Results The expression level of mTOR in the gastric cancer tissue was higher than that of normal gastric tissue and paracancerous gastric tissues,and the difference was statistically significant（P<0.05）, and the mTOR and mRNA in the gastric cancer tissues expression had a positive correlation,and also had a positive correlation in the normal gastric cancer tissues and paracancerous gastric tissue expression,and the corresponding expression levels of mTOR and mRNA in the gastric cancer tissues were related to the lymph node metastasis and pathological stage,but was not related to the gender and tumor diameter.Conclusion For gastric cancer patients,the specificity of mTOR signaling pathway in the tissues is activated,but the mTOR signaling pathway may have an effect on the occurrence and development of gastric cancer.

Gastric cancer;mTOR signaling pathway;Immunoblot

R4

A doi10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.02.07

2017-03-20；

2017-04-05

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)研究項目（NJZY16200),包頭醫(yī)學(xué)院博士啟動基金項目（BSJJ201605)。

韓熙淵（1978-），男，內(nèi)蒙古包頭人，本科，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸道腫瘤的診斷與治療工作。

韓麗紅（1979-），女，內(nèi)蒙古赤峰人，博士，教授，主要從事腫瘤基因診斷研究工作，E-mail：vhanlihong@163.com。