賈東旭，陳鐵男，周佳鋒，牛坤，秦海彬，金利群

1(浙江工業(yè)大學(xué)，浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州，310014) 2(浙江工業(yè)大學(xué)，生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，浙江 杭州， 310014)

不同醛脫氫酶對(duì)重組克雷伯氏菌生產(chǎn)3-羥基丙酸的影響

賈東旭1,2*，陳鐵男1,2，周佳鋒1,2，牛坤1,2，秦海彬1,2，金利群1,2

1(浙江工業(yè)大學(xué)，浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州，310014) 2(浙江工業(yè)大學(xué)，生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，浙江 杭州， 310014)

PCR擴(kuò)增CupriavidusnecatorGabD4和AzospirillumbrasilenseKGSADH醛脫氫酶基因，分別與經(jīng)改造獲得卡那霉素抗性的pUC19質(zhì)粒(pUC19Kan)連接，再轉(zhuǎn)化至KlebsiellapneumoniaeDSM2026，獲得重組菌KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4。經(jīng)搖瓶發(fā)酵，KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4的最高3-羥基丙酸(3-HP)產(chǎn)量分別為3.66與2.56 g/L，與未導(dǎo)入醛脫氫酶的K.pneumoniae對(duì)照菌相比，分別提高了352%與216%。對(duì)其他產(chǎn)物的研究表明，2株重組菌的1,3-丙二醇(1,3-PDO)的產(chǎn)量低于對(duì)照菌，而2,3-丁二醇(2,3-BD)和乙酸產(chǎn)量高于對(duì)照菌。該研究首次將C.necatorGabD4醛脫氫酶基因?qū)隟.pneumoniae，并對(duì)比了KpKan/KGSADH與KpKan/GabD4的3-HP產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)中確定的性能優(yōu)良的發(fā)酵菌株為繼續(xù)提高3-HP產(chǎn)量提供了幫助。

克雷伯氏菌；甘油；醛脫氫酶；3-羥基丙酸

3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-HP)是一種重要的平臺(tái)化合物，可用于合成1,3-丙二醇(1,3-PDO)、丙烯酸、丙二酸和丙烯酰胺等化合物[1]，已被美國(guó)能源部列為當(dāng)今世界上最具開發(fā)潛力的12種化工產(chǎn)品之一[2]。目前，生產(chǎn)3-HP的方法主要是化學(xué)合成法，隨著生物柴油產(chǎn)業(yè)的興起，每生產(chǎn)10 t生物柴油就會(huì)得到1 t副產(chǎn)物甘油[3]，合理利用甘油通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)3-HP可以有效緩解甘油過(guò)剩的壓力。

除了甘油[4]，生物法合成3-HP所用底物還有葡萄糖[5]，但其轉(zhuǎn)化過(guò)程繁瑣。相比之下，甘油轉(zhuǎn)化過(guò)程只需通過(guò)甘油脫水酶(DhaB)與醛脫氫酶(AldH)2步反應(yīng)即可生成產(chǎn)物3-HP(圖1)?？梢姡视褪前l(fā)酵法生產(chǎn)3-HP的首選底物。常用的3-HP發(fā)酵系統(tǒng)包括E.coli和K.pneumoniae。在3-HP的合成途徑中，DhaB須有輔酶維生素B12參與才能表現(xiàn)出活力并將甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛(3-HPA)。E.coli系統(tǒng)自身無(wú)法合成維生素B12，需要在發(fā)酵的過(guò)程中人為添加，這樣會(huì)使3-HP的生產(chǎn)成本大幅提高。與之相比，K.pneumoniae存在著完整的維生素B12合成體系，并能夠高效利用甘油，甘油同化率高[6]，是3-HP的理想生產(chǎn)菌。但K.pneumoniae自身體系的醛脫氫酶活性低，需要導(dǎo)入異源醛脫氫酶至K.pneumoniae提高酶活，才能實(shí)現(xiàn)3-HP的合成。

圖1 K. pneumoniae利用甘油的部分代謝路徑Fig.1 The partial glycerolmetabolic pathway in K. pneumoniae

近年來(lái)，出現(xiàn)了很多宿主菌表達(dá)DhaB和搭配不同AldH利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)3-HP的報(bào)道。KO等[7]將AldH導(dǎo)入E.coli，發(fā)酵的3-HP產(chǎn)量達(dá)31 g/L。RATHNASINGH等[8]使用E.coli表達(dá)KGSADH得到38.7 g/L的3-HP。ASHOK等[9]利用宿主K.pneumoniae表達(dá)PuuC，并敲除1,3-PDO途徑關(guān)鍵酶，使產(chǎn)量達(dá)28.1 g/L。CHU等指出來(lái)自Cupriavidusnecator中的succinate-semialdehyde dehydrogenase GabD4是目前活力最高的AldH[10]，本實(shí)驗(yàn)室測(cè)得GabD4的Km、Vmax分別為6.86 mmol/L和20.6 μmol/(min·mg protein)[11]，運(yùn)用該酶的改造、導(dǎo)入與基因敲除技術(shù)，在E.coli中生產(chǎn)3-HP的產(chǎn)量高達(dá)71.9 g/L[10]。另外，田平芳等[12]在K.pneumoniae表達(dá)PuuC的基礎(chǔ)上，敲除了調(diào)控乳酸和乙酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，使3-HP產(chǎn)量到達(dá)了目前最高的83.8 μg/L。

本研究選擇文獻(xiàn)報(bào)道活性最高的醛脫氫酶CupriavidusnecatorGabD4，首次將其克隆至pUC19質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)化K.pneumoniaeDSM2026，并與導(dǎo)入高效醛脫氫酶AzospirillumbrasilenseKGSADH[7]的K.pneumoniae進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比，考察3-HP和其他產(chǎn)物的變化情況，所確定發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株為進(jìn)一步提高3-HP產(chǎn)量提供可能性。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1 菌體與質(zhì)粒

連接在pET28b上的醛脫氫酶C.necatorGabD4和A.brasilenseKGSADH基因、質(zhì)粒pKD13、帶有酶切位點(diǎn)XhoⅠ和SpeⅠ的質(zhì)粒pUC19Mut、宿主菌E.coliJM109均由本實(shí)驗(yàn)室保存。肺炎克雷伯桿菌K.pneumoniaeDSM2026由韓國(guó)Park團(tuán)隊(duì)饋贈(zèng)。

1.1.2 試劑

氨芐霉素(Ampicillin，Amp)和卡那霉素(Kanamycin，Kan)購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；BamhⅠ、PstⅠ、XhoⅠ，SpeⅠ等限制性內(nèi)切酶購(gòu)于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；T4DNA連接酶與TaqDNA聚合酶購(gòu)自Thermo生物公司；Ligation high Ver.2 DNA連接酶購(gòu)自東洋紡(上海)生物科技有限公司；DNA marker和Loading Buffer等購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；引物合成和測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)購(gòu)于北京經(jīng)科宏達(dá)生物有限公司上海分公司；二硫蘇糖醇(Dithiothreito，DTT)、1,3-PDO、3-HP等購(gòu)于北京百靈威科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 所用引物

本研究進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)所用引物如表1所示。

表1 PCR中所用到的引物

注：引物序列中的下劃線為限制性酶切位點(diǎn)，已在序列后的括號(hào)中標(biāo)明。

1.1.4 培養(yǎng)基配方

種子(LB)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 10，固體培養(yǎng)基需添加20 g/t瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：參照實(shí)驗(yàn)室[13]的培養(yǎng)基配方并做修改。具體為：甘油 30、酵母膏4、(NH4)2SO43.2、NaCl 1、MgSO4·7H2O 0.25、Na2HPO4·12H2O 22.7、KH2PO43、FeSO4·7H2O 0.001、CaCl20.004、微量元素溶液2 mL/L。

微量元素溶液(g/L)：ZnCl20.07、CuCl2·2H2O 0.02、MnCl2·4H2O 0.1、NiCl2·6H2O 0.025、H3BO30.06、Na2MO4·2H2O 0.035、CoCl2·2H2O 0.2。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分子生物學(xué)操作

提取質(zhì)粒參照AxyPrep質(zhì)粒小量提取試劑盒(康寧生命科學(xué)吳江有限公司)說(shuō)明書；其他參見《實(shí)用生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[14]。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

(1)構(gòu)建質(zhì)粒pUC19Kan

以pKD13為模板，使用引物1和2(表1)擴(kuò)增Kan抗性基因，所用酶為Taq DNA聚合酶。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，(95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min)30循環(huán)，72 ℃ 10 min?；厥誅NA片段與pGEM-T載體連接得到pGEM-T/Kan，并與pUC19Mut同時(shí)進(jìn)行XhoⅠ、SpeⅠ雙酶切，連接得到重組質(zhì)粒pUC19Kan。

(2)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pUC19Kan/KGSADH和pUC19Kan/GabD4

分別以pET28b/KGSADH和pET28b/GabD4為模板，使用引物3和4擴(kuò)增KGSADH基因，使用引物5和6擴(kuò)增GabD4基因。反應(yīng)條件：95 ℃ 5min，(95 ℃ 15 s，60 ℃ 15s，72 ℃ 2 min)30循環(huán)，72 ℃ 10 min?；厥誅NA片段分別與pGEM-T載體連接，獲得重組質(zhì)粒再分別與pUC19Kan同時(shí)進(jìn)行PstⅠ、BamhⅠ雙酶切并連接，得到重組質(zhì)粒pUC19Kan/KGSADH和pUC19Kan/GabD4。

1.2.3 制備K.pneumoniaeDSM2026感受態(tài)與電轉(zhuǎn)化

將甘油管保藏的K.pneumoniaeDSM2026劃線于LB平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單菌落至裝有4 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12h；按1%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接于40 mL LB發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD6000.4～0.6，冰浴培養(yǎng)物30 min，于4 ℃、7 000 r/min離心收集菌體。用30 mL滅菌超純水洗滌菌體，用100 μL無(wú)菌水重懸，并轉(zhuǎn)移至冰浴的1.5 mL的EP管中待用。

將上述感受態(tài)細(xì)胞分裝至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯(間距0.2 cm)，同時(shí)加入1 μL預(yù)冷的質(zhì)粒，按條件(10 kV/cm、5 ms)電轉(zhuǎn)化；隨后加入600 μL預(yù)冷的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)2 h，涂布至含50 μg/mL Kan的LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)12 h。

1.2.4K.pneumoniae重組菌搖瓶發(fā)酵

以1%(v/v)接菌量將重組菌接種于含50 μg/mL Kan的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150r/min、培養(yǎng)12 h；再以2%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接至含50 μg/mL Kan的100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min、連續(xù)發(fā)酵64 h，定時(shí)取樣檢測(cè)相關(guān)產(chǎn)物。

1.2.5 醛脫氫酶活力檢測(cè)

參照前期研究[11]，體系包括：2 mmol/L乙醛、2 mmol/L NAD+、1 mmol/L DTT和適量的酶液，用100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)將體系補(bǔ)至1 mL。使用SpectraMax M5酶標(biāo)儀在340 nm處，37 ℃條件下測(cè)定吸光值變化。酶活定義：1 min生成1 μmol NADH [ε340=6.22×103(mol/L)-1·cm-1]所需的酶量定義為1個(gè)活力單位(U)。

1.2.6 產(chǎn)物與分析

采用Waters1515高效液相色譜(美國(guó))測(cè)定3-HP、乙酸、1,3-PDO和2,3-BD等發(fā)酵代謝物。色譜柱Amines HPX-87H(Bio-Rad，美國(guó))，柱溫65 ℃，流動(dòng)相5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min。使用示差折光及紫外檢測(cè)器，繪制樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線并定量檢測(cè)樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1質(zhì)粒pUC19Kan的構(gòu)建與驗(yàn)證

本研究的出發(fā)質(zhì)粒pUC19Mut見圖2，將醛脫氫酶基因?qū)攵嗫寺∥稽c(diǎn)(multiple clone site，MCS)，再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌K.pneumoniaeDSM2026便能實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)。但是，宿主菌K.pneumoniaeDSM2026和pUC19Mut自身均攜帶Amp抗性，導(dǎo)致無(wú)法用該抗性篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。因此，為了讓重組轉(zhuǎn)化子獲得新的抗性，本研究將pUC19Mut的Amp抗性替換為Kan抗性，改造的新質(zhì)粒pUC19Kan如圖2所示。

圖2 重組質(zhì)粒pUC19Kan/KGSADH和pUC19Kan/GabD4的簡(jiǎn)要構(gòu)建過(guò)程Fig.2 Brief construction process of plasmid pUC19Kan/KGSADH and pUC19Kan/GabD4

以質(zhì)粒pKD13為模板，PCR擴(kuò)增Kan目的基因，結(jié)果見圖3(泳道1)，擴(kuò)增條帶的大小與Kan理論值(約1 162 bp)基本相符。將擴(kuò)增片段與pGEM-T載體連接后測(cè)序，將測(cè)序正確的Kan片斷與pUC19Mut同時(shí)進(jìn)行XhoⅠ和SpeⅠ雙酶切并連接，獲得質(zhì)粒pUC19Kan。為驗(yàn)證質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，將質(zhì)粒pUC19Kan再用XhoⅠ和SpeⅠ進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3(泳道2)。經(jīng)XhoⅠ和SpeⅠ雙酶切，pUC19Kan出現(xiàn)2條特異條帶，其大小分別位于1 500～2 000 bp和1 000～1 500 bp，不含抗性基因的pUC19Mut和Kan基因正好位于該大小區(qū)間，說(shuō)明重組質(zhì)粒pUC19Kan構(gòu)建成功。

M-蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-PCR擴(kuò)增Kan基因；2-pUC19Kan雙酶切圖3 PCR擴(kuò)增Kan抗性基因和重組質(zhì)粒的雙酶切Fig.3 PCR amplification of Kan gene and double enzymatic digestion of pUC19Kan

2.2重組質(zhì)粒pUC19Kan/KGSADH和pUC19Kan/GabD4的構(gòu)建與驗(yàn)證

以pET28b/GabD4質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增目的基因GabD4，結(jié)果見圖4(泳道1)，擴(kuò)增條帶大小與GabD4的理論值(約1428 bp)基本相符。

M-蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-PCR擴(kuò)增GabD4；2-PCR擴(kuò)增KGSADH；3-pUC19Kan/GabD4雙酶切；4-pUC19Kan/KGSADH雙酶切圖4 PCR擴(kuò)增醛脫氫酶基因和重組質(zhì)粒的雙酶切Fig.4 PCR amplification of two aldehyde dehydrogenase genes and double enzymatic digestion of two recombinant plasmids

將片段與pGEM-T載體連接并測(cè)序，將測(cè)序正確的GabD4片斷與pUC19Kan同時(shí)進(jìn)行PstⅠ和BamhⅠ雙酶切并連接。為驗(yàn)證構(gòu)建情況，將質(zhì)粒pUC19Kan/GabD4以PstⅠ、BamhⅠ進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖4(泳道3)。如圖4所示，酶切獲得的酶基因片段為1 000～1 500 bp，載體片段約為3 000 bp，與GabD4和pUC19Kan實(shí)際大小基本相符，說(shuō)明重組質(zhì)粒pUC19Kan/GabD4構(gòu)建成功。另一個(gè)醛脫氫酶KGSADH的基因長(zhǎng)度為1 446 bp，按照同樣克隆過(guò)程，經(jīng)基因測(cè)序和瓊脂糖凝膠電泳分析(圖4、泳道2和4)，結(jié)果表明重組質(zhì)粒pUC19Kan/KGSADH構(gòu)建成功。

2.3電轉(zhuǎn)化K.pneumoniae與篩選轉(zhuǎn)化子

通過(guò)1.2.3的電轉(zhuǎn)化方法，將重組質(zhì)粒pUC19Kan/GabD4、pUC19Kan/KGSADH和pUC19Kan分別轉(zhuǎn)化至K.pneumoniaeDSM2026。將各轉(zhuǎn)化子接種于50 μg/mL Kan的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。雖然K.pneumoniaeDSM2026無(wú)Kan抗性，但導(dǎo)入的重組質(zhì)粒pUC19Kan/GabD4、pUC19Kan/KGSADH和pUC19Kan能夠賦予重組菌抵抗Kan的能力，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子可生長(zhǎng)于含Kan的LB固體培養(yǎng)基，隨機(jī)挑選各陽(yáng)性菌株并分別命名為KpKan/KGSADH、KpKan/GabD4和KpKan。

2.4K.pneumoniae重組菌發(fā)酵與醛脫氫酶活性測(cè)定

分別將重組菌KpKan/KGSADH、KpKan/GabD4和KpKan接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃發(fā)酵12 h，收集菌體破壁后進(jìn)行醛脫氫酶活力檢測(cè)。對(duì)照菌KpKan的醛脫氫酶活力為1.05 U/mL，說(shuō)明對(duì)照菌自身存在一定數(shù)量的醛脫氫酶；重組菌KpKan/KGSADH與KpKan/GabD4的醛脫氫酶活力分別為2.24和1.56 U/mL，與KpKan相比分別提高113%與48.6%。該結(jié)果說(shuō)明導(dǎo)入KGSADH和GabD4后，K.pneumoniae表達(dá)的醛脫氫酶活力得以提高，其中KpKan/KGSADH的酶活提高更為明顯。PARK團(tuán)隊(duì)于2012年的研究表明,野生型K.pneumoniae中的醛脫氫酶酶活較難測(cè)得，而導(dǎo)入外源基因PuuC與EaldH，2重組菌的酶活分別提高至4與1.8 U/mg，證明了外源基因的導(dǎo)入會(huì)使醛脫氫酶的酶活得到提高[7]。本研究結(jié)果與PARK團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果一致。

2.5搖瓶發(fā)酵過(guò)程中甘油的消耗

甘油作為碳源，是組成培養(yǎng)基的主要成分，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供必需的能量[15]。K.pneumoniae作為一種革蘭氏陰性菌，具備較為完整的甘油代謝系統(tǒng)，不僅可在有氧和無(wú)氧的環(huán)境下快速利用甘油，還能高效生產(chǎn)酸和醇，如3-HP、1,3-PDO、2,3-BD和乙酸等[16]。KpKan/KGSADH、KpKan/GabD4和KpKan發(fā)酵過(guò)程中的甘油消耗見圖5。培養(yǎng)基中甘油的初始質(zhì)量濃度均為30 g/L，當(dāng)發(fā)酵至16 h，KpKan的甘油消耗速率最快，僅剩0.75 g/L；KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4的甘油剩余量分別為4.45和10.44 g/L，明顯高于KpKan。當(dāng)發(fā)酵至24 h，KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4的甘油量降至低于4 g/L的水平。以上結(jié)果表明發(fā)酵24 h，3者的甘油已基本消耗殆盡。李清等[17]發(fā)現(xiàn)間歇性補(bǔ)加甘油，使其濃度保持在20～30 g/L，發(fā)酵26 h的3-HP產(chǎn)量為47.2 g/L，甘油轉(zhuǎn)化率0.35 mol/mol。對(duì)于本研究，今后可以通過(guò)恒定底物甘油濃度來(lái)進(jìn)一步提高3-HP產(chǎn)量。

圖5 搖瓶發(fā)酵過(guò)程中甘油的消耗Fig.5 The glycerol consumption of three strains during shake-flask fermentation process

2.6搖瓶發(fā)酵過(guò)程中3-HP和1,3-PDO的變化

3-HP產(chǎn)量的高低決定重組菌株的應(yīng)用前景，KpKan/KGSADH、KpKan/GabD4和KpKan的搖瓶發(fā)酵過(guò)程的3-HP產(chǎn)量見圖6(a)。發(fā)酵至64 h，對(duì)照菌株KpKan的3-HP產(chǎn)量緩慢增加至0.81 g/L。KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4的3-HP產(chǎn)量呈現(xiàn)明顯提高之勢(shì)，終產(chǎn)量為3.66與2.56 g/L，比KpKan分別提高352%與216%。在2.4中已證實(shí)，KpKan/KGSADH的醛脫氫酶活比KpKan/GabD4酶活高43.6%，較高的酶活力可能使KpKan/KGSADH催化中間物的能力變強(qiáng)[18]，從而提高3-HP產(chǎn)量。張曉梅[19]等詳細(xì)優(yōu)化了甘油濃度對(duì)E.coliJM109生產(chǎn)3-HP的影響，當(dāng)甘油濃度為40 g/L，3-HP產(chǎn)量最高為3.37 g/L。KO[7]等將EaldH、PuuC和KGSADH分別導(dǎo)入DhaT缺陷型、YqhD缺陷型和野生型K.pneumoniae宿主菌，通過(guò)搖瓶發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)K.pneumoniaeΔdhaT/KGSADH的產(chǎn)量最高為5.8 g/L。KpKan/KGSADH在沒有進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化和基因敲除的情況下，已經(jīng)取得可觀的3-HP產(chǎn)量，說(shuō)明該菌已經(jīng)展示出重要的工業(yè)應(yīng)用前景。

如圖1所示，在甘油的還原途徑中，甘油通過(guò)DhaB的催化作用生成3-HPA，再在一系列1,3-PDO氧化還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為1,3-PDO[20]。做為甘油還原途徑的代謝產(chǎn)物，1,3-PDO與3-HP有著共同的前體物質(zhì)3-HPA，2者在碳流的利用上存在競(jìng)爭(zhēng)，因此，1,3-PDO是K.pneumoniae發(fā)酵的重要考察指標(biāo)。KUMAR等將含有KGSADH的K.pneumoniaeJ2B靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有甘油與酵母膏的培養(yǎng)基中，在通氣量較低的情況下聯(lián)產(chǎn)1,3-PDO與3-HP，最終產(chǎn)物分別為15.2 g/L與11.3 g/L[21]。本研究搖瓶發(fā)酵產(chǎn)1,3-PDO的結(jié)果如圖6(b)所示。發(fā)酵0～18 h，KpKan/KGSADH、KpKan/GabD4和KpKan的1,3-PDO產(chǎn)量迅速升高，并在發(fā)酵18 h達(dá)到2.35、2.89和3.31 g/L的最高值。值得注意的是，KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4在發(fā)酵各階段的1,3-PDO產(chǎn)量均低于KpKan，原因可能是外源醛脫氫酶與1,3-PDO氧化還原酶存在競(jìng)爭(zhēng)，將3-HPA更多流向合成3-HP方向，導(dǎo)致1,3-PDO的產(chǎn)量降低。

圖6 搖瓶發(fā)酵過(guò)程中3-HP產(chǎn)量Fig.6 The production of 3-HP and 1,3-PDO of three strains during shake-flask fermentation process

2.7搖瓶發(fā)酵過(guò)程中2,3-BD和乙酸的變化

重組菌代謝生成副產(chǎn)物會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性消耗碳流。在K.pneumoniae的氧化途徑中，甘油進(jìn)入TCA循環(huán)并轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸可以在不同的酶催化下轉(zhuǎn)變?yōu)?,3-BD和乙酸等副產(chǎn)物[18]。對(duì)于本研究，發(fā)酵過(guò)程中副產(chǎn)物2,3-BD的變化如圖7(a)所示。當(dāng)發(fā)酵32 h，KpKan/KGSADH的2,3-BD產(chǎn)量升高至4.26 g/L，隨后一直維持該水平。KpKan/GabD4和KpKan分別在發(fā)酵16和8 h，達(dá)到2.51和4.12g/L最高產(chǎn)量，之后產(chǎn)量逐漸下降，最終只有1.51和1.18 g/L。發(fā)酵過(guò)程中乙酸產(chǎn)量如圖7(b)所示。KpKan在發(fā)酵過(guò)程中一直不產(chǎn)乙酸；KpKan/GabD4發(fā)酵32 h，乙酸達(dá)到最高值2.32 g/L，隨后下降；相比之下，KpKan/KGSADH的乙酸產(chǎn)量一直上升，48 h穩(wěn)定在2.37 g/L左右。上述結(jié)果說(shuō)明發(fā)酵中，KpKan/GabD4與KpKan/KGSADH的2,3-BD和乙酸產(chǎn)量均高于KpKan。原因可能是在K.pneumoniae的代謝途徑中，KpKan/GabD4與KpKan/KGSADH高醛脫氫酶活力導(dǎo)致3-HP大量生成，同時(shí)將NAD+轉(zhuǎn)化為NADH，菌體為了維持體系內(nèi)的NADH/NAD+平衡，消耗部分NADH用于合成2,3-BD、乙酸等副產(chǎn)物。

圖6 發(fā)酵過(guò)程中2,3-BD與乙酸的產(chǎn)量Fig.6 The production of 2,3-BD and acetic acid during shake-flask fermentation process

3 結(jié)論

本研究通過(guò)分子生物學(xué)手段，將C.necatorGabD4和A.brasilenseKGSADH醛脫氫酶分別導(dǎo)入K.pneumoniaeDSM2026，經(jīng)搖瓶發(fā)酵，測(cè)得醛脫氫酶活力分別為2.24和1.56U/mL。發(fā)酵過(guò)程中，KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4的3-HP最高產(chǎn)量分別為3.66與2.56 g/L，說(shuō)明KpKan/KGSADH產(chǎn)3-HP的能力優(yōu)于KpKan/GabD4。動(dòng)態(tài)分析KpKan、KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4副產(chǎn)物變化，發(fā)現(xiàn)2重組菌1,3-PDO產(chǎn)量低于KpKan，2,3-BD和乙酸的產(chǎn)量高于KpKan。本研究首次將C.necatorGabD4表達(dá)于K.pneumoniae，用于生產(chǎn)3-HP，獲得的結(jié)果有助于篩選性能最佳的發(fā)酵菌株，通過(guò)發(fā)酵工程和代謝工程等后續(xù)操作，進(jìn)一步提高3-HP產(chǎn)量。

[1] WANG Yue-peng,SUN Tao,GAO Xing-yan,et al．Biosynthesis of platform chemical 3-hydroxypropionic acid (3-HP) directly from CO2in cyanobacteriumSynechocystissp． PCC 6803[J]．Metabolic Engineering,2015,34:60．

[2] HOLLADAY J E,BOZELL J J．Top value added chemicals from biomass[J]．Nato Advanced Science Institutes,2007(2):263-275．

[3] MEESTERS PAEP,HUIJBERTS GNM,EGGINK G．High-cell-density cultivation of the lipid accumulating yeastCryptococcuscurvatususingglycerol as a carbon source[J]．Applied Microbiology and Biotechnology,1996,45(5):575-579．

[4] KRAUTER H,WILLKER T,VORLOP KD．Production of high amounts of 3-hydroxypropionaldehyde from glycerol byLactobacillusreuteriwith strongly increased biocatalyst lifetime and productivity[J]．New Biotechnology, 2012,29(2):211-217．

[5] KUMAR V,ASHOK S,PARK S．Recent advances in biological production of 3-hydroxypropionic acid[J]．Biotechnology Advances,2013,31(6):945-961．

[6] CELI E．Klebsiella spp．a(chǎn)s a 1,3-propanediol producer:the metabolic engineering approach[J]．Critical Reviews in Biotechnology,2012,32(3):274-288．

[7] KO Y,ASHOK S,ZHOU S,et al．Aldehyde dehydrogenase activity is important to the production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol by recombinantKlebsiellapneumoniae[J]．Process Biochemistry,2012,47(7):1 135-1 143．

[8] RATHNASINGH C, RAJ SM, JO JE,et al．Development and evaluation of efficient recombinantEscherichiacolistrains for the production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol[J]．Biotechnology & Bioengineering,2009,104(4):729-739．

[9] ASHOK S,SANKARANARAYANAN M,KO Y,et al．Production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol by recombinantKlebsiellapneumoniaeΔdhaTΔyqhDwhich can produce vitamin B12naturally[J]．Biotechnology & Bioengineering, 2013,110(2):511-524．

[10] CHU HS,KIM YS,LEE CM,et al．Metabolic engineering of 3-hydroxypropionic acid biosynthesis inEscherichiacoli[J]．Biotechnology & Bioengineering, 2015,112(2):356-364．

[11] 賈東旭,劉東,鄭裕國(guó)．琥珀酸半醛脫氫酶GabD4的表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)分析[J]．食品與發(fā)酵工業(yè),2016，42(5):97-101．

[12] LIYing,WANG Xi,GE Xi-zhen,et al．High production of 3-hydroxypropionic acid inKlebsiellapneumoniaeby systematic optimization of glycerol metabolism[J]． Scientific Reports,2016,6:26 932．

[13] NIU Kun,XIONG Tao,QIN Hai-bin,et al．3-Hydroxypropionic acid production by recombinantEscherichiacoliZJU-3HP01 using glycerol-glucose dual-substrate fermentative strategy[J]．Biotechnol Appl Biochem,2017．DOI:10.1002/BAB.1505.

[14] 王淳本．實(shí)用生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]．武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社,2003．

[15] MERGULHAO FJM,SUMMERS DK,MONTEIRO G A．Recombinant protein secretion inEscherichiacoli[J]．Biotechnology Advances,2005,23(3):177-202．

[16] 王鳳寰,楊建國(guó),王曉楠,等．利用甘油發(fā)酵耦聯(lián)生產(chǎn)3-羥基丙酸及1,3-丙二醇重組菌的構(gòu)建及篩選[J]．微生物學(xué)通報(bào),2011,38(11):1 611-1 617．

[17] 李清,黃艷娜,李志敏,等．重組肺炎克雷伯菌發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)3-羥基丙酸和1,3-丙二醇[J]．過(guò)程工程學(xué)報(bào),2014,14(1):133-138．

[18] ASHOL S,YEOUNJOO K,RAJ SM,et al．Effect of nitrate on glycerol metabolism and anaerobic production of 3-hydroxypropionic acid by recombinantKlebsiellapneumoniaeoverexpressing PuuC[J]．Metabolic Engineering,2013,15:10-24．

[19] 張曉梅,諸葛斌,許正宏,等．產(chǎn)3-羥基丙酸重組菌的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化甘油的研究[J]．生物技術(shù)通報(bào),2009(8):104-108．

[20] SEO JW,SEO MY,OH BR,et al．Identification and utilization of a 1,3-propanediol oxidoreductase isoenzyme for production of 1,3-propanediol from glycerol inKlebsiellapneumoniae[J]．Applied Microbiology and Biotechnology,2010,85(3):659-666．

[21] KUMAR V,SANKARANARAYANAN M,JAE KE,et al．Co-production of 3-hydroxypropionic acid and 1,3-propanediol from glycerol using resting cells of recombinantKlebsiellapneumoniaeJ2B strain overexpressing aldehyde dehydrogenase[J]．Applied Microbiology and Biotechnology,2012, 96(2):373-383．

Effectofdifferentaldehydedehydrogenasesonproductionof3-hydroxypropionicacidbyrecombinantKlebsiellapneumoniaestrains

JIA Dong-xu1,2*, CHEN Tie-nan1,2, ZHOU Jia-feng1,2,NIU Kun1,2,QIN Hai-bin1,2, JIN Li-qun1,2

1 (Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China) 2 (Engineering Research Center of Bioconversion and Biopurification of the Ministry of Education, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

In this experiment,CupriavidusnecatorGabD4 andAzospirillumbrasilenseKGSADH aldehyde dehydrogenase genes were cloned by polymerase chain reaction (PCR), and the resulting PCR products were ligated to plasmid pUC19Kan whose ampicillin resistance had been modified to kanamycin resistance. Then, the recombinant plasmids were transformed intoKlebsiellapneumoniaeDSM2026, and designated KpKan/KGSADHand KpKan/GabD4. Through shake-flask fermentation, their maximum 3-hydroxy propionic acid (3-HP) yield reached 3.66 and 2.56 g/L respectively, which was 352% and 216% higher than that of the control strain. In addition, analysis of other products showed that 1,3-propylene glycol (1,3-PDO) contents in both recombinant strains were lower whereas 2,3-butylene glycol(2,3-BD) and acetic acid contents were higher than those of the control strain. This is the first report regarding the introduction ofC.necatorGabD4 aldehyde dehydrogenase intoK.pneumoniaeand comparing the 3-HP yield between KpKan/KGSADHand KpKan/GabD4, the obtained results are great interest for further improvement of 3-HP production.

Klebsiellapneumoniae; glycerol; aldehyde dehydrogenase; 3-hydroxypropionic acid

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014580

博士,副教授(本文通訊作者,E-mail:jiadongxu@zjut.edu.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21306173)；浙江省自然科學(xué)基金青年基金(LQ15C010001)

2017-04-19，改回日期：2017-05-05