漆啟華, 李 晨, 肖 強, 鄧 亮, 張遂輝, 樂 旸, 董謝平

(江西省人民醫(yī)院骨二科，江西 南昌 330006)

吡咯烷二硫代氨基甲酯抑制TNF-α和MMP-9表達延緩大鼠頸椎間盤退變及機制研究

漆啟華, 李 晨, 肖 強, 鄧 亮, 張遂輝, 樂 旸, 董謝平

(江西省人民醫(yī)院骨二科，江西 南昌 330006)

目的觀察吡咯烷二硫代氨基甲酯(PDTC)對大鼠頸椎動力失衡模型頸椎間盤組織形態(tài)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達的影響，探討PDTC抑制頸椎間盤退變作用及其機制。方法54只SD大鼠隨機分為3組，切斷大鼠頸后部淺、深肌群構(gòu)建頸椎間盤退變動物模型。PDTC給藥組(A組)：造模術(shù)后腹腔每日注射PDTC溶液。模型組(B組)：造模術(shù)后腹腔每日注射生理鹽水。假手術(shù)組(C組)：手術(shù)切開大鼠頸后部皮膚后立即縫合并每日腹腔注射生理鹽水。術(shù)后10、12、16周分批處死動物，獲取C5/6椎間盤組織，光鏡下觀察椎間盤形態(tài)改變，q-PCR檢測椎間盤組織中TNF-α mRNA、MMP-9 mRNA表達；Western blot檢測椎間盤組織中TNF-α、MMP-9蛋白表達變化。結(jié)果PDTC給藥組(A組)椎間盤結(jié)構(gòu)破壞減輕，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)排列有序。模型組(B組)TNF-α、MMP-9 基因表達量隨實驗時間的延長而增多，早期增速較快，后期逐漸緩慢，在12周達高峰，而蛋白表達量在術(shù)后10周即達到較高水平，與12周、16周時間點比較無明顯差異(P>0.05)。各時間點PDTC給藥組TNF-α mRNA、MMP-9 mRNA及蛋白表達量較模型組(B組)明顯降低(P<0.01)，但明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)。結(jié)論TNF-α、MMP-9是參與大鼠頸椎間盤退變過程的重要炎性因子，TNF-α、MMP-9可能通過NF-κB信號通路參與大鼠頸椎間盤退變，PDTC有望成為頸椎間盤退變的防治藥物。

吡咯烷二硫代氨基甲酯(PDTC)；頸椎間盤退變；腫瘤壞死因子α；基質(zhì)金屬蛋白酶9；頸椎動力失衡；NF-κB信號通路

頸椎間盤切除植骨融合內(nèi)固定術(shù)是治療椎間盤源性頸椎病的有效手段之一[1]，現(xiàn)研究已證實，除局部生物力學環(huán)境的改變參與頸椎間盤退變外，炎性介質(zhì)被認為是參與頸椎間盤退變的重要因素[2]。但目前關(guān)于退變頸椎間盤中炎性介質(zhì)表達變化規(guī)律及調(diào)控機制尚不十分清楚，吡咯烷二硫代氨基甲酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是NF-κB特異性抑制劑，被認為是一種抗炎，抗氧化劑，主要用來治療金屬中毒。,我們通過動物模型模擬頸椎間盤退變過程，并觀察PDTC對大鼠頸椎動力失衡模型頸椎間盤組織形態(tài)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達的影響，以尋找一種可以早期干預頸椎間盤退變的藥物，為頸椎間盤退變的防治尋找新的途徑。

1 材料與方法

1.1材料PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酯)為Sigma公司產(chǎn)品，TRIzol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，cDNA第一鏈合成試劑盒(美國 Thermo Fisher K1622)，Braford蛋白含量檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司 KGA801)，TNF-α、MMP-9、GAPDH引物由南京金斯瑞科技有限公司合成，全蛋白抽提試劑盒、Western blot檢測試劑盒、ECL檢測試劑盒為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品，TNF-α、MMP-9、GAPDH抗體、羊抗兔IgG-HRP為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品產(chǎn)品。其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。熒光定量PCR循環(huán)儀為美國ABI公司產(chǎn)品，蛋白凝膠電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)為美國伯樂Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2動物分組及模型構(gòu)建選擇6月齡，♀，體質(zhì)量為220～240 g，SD大鼠54只(南昌大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，清結(jié)級)，隨機分為3組，每組18只。參照郝永強等[3]方法構(gòu)建大鼠頸椎間盤退變模型，A組、B組：氯氨酮( 100 mg·kg-1) 腹腔注射麻醉后，切斷頸后部淺肌群及深肌群，其中淺肌群包括頸斜方肌、菱形??；深肌群包括頸部夾肌、最長肌、頭半棘肌，棘上、棘間韌帶一并切斷(C5/6間隙)，手術(shù)操作均在無菌條件下完成。假手術(shù)組(C組)：頸后部正中切開皮膚后間斷縫合。動物術(shù)后d 1即按分組開始腹腔注射，直至動物處死。PDTC給藥組(A組)：按體重每天30 mg·kg-1PDTC溶液腹腔注射，模型組(B組)、假手術(shù)組(C組)：按體重每天對應(yīng)體積生理鹽水腹腔注射。分別在給藥后10、12、16周行放血法處死動物，每次每組處死動物6只，立即切取頸椎(C5、C6椎體及C5/6椎間盤)，去除軟組織后在手術(shù)顯微鏡下沿上、下軟骨板切下C5/6椎間盤，液氮速凍保存。整個椎間盤組織分為3份，分別行組織學觀察、基因表達檢測、蛋白定量分析。

1.3組織形態(tài)學觀察各標本以10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚4 μm，取部分切片常規(guī)HE染色后，光鏡下觀察椎間盤結(jié)構(gòu)及纖維環(huán)形態(tài)學改變，并對椎間盤退變程度進行記錄[4]。

1.4q-PCR檢測TNF-α、MMP-9基因表達按TRIzol抽提試劑說明書進行提取組織樣本中總RNA，cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為：2×Real time PCR Master Mix(SYBR Green)：10 μL；上、下游引物(各10 μmol·L-1)，各1 μL；cDNA模板1 μL；加入滅菌蒸餾水使總反應(yīng)體積至20 μL。標準對照物為GAPDH。引物序列見Tab 1。擴增程序為：95 ℃，5 min，1個循環(huán)；(95 ℃，15 s；60 ℃，20 s，72 ℃ 40 s)×40個循環(huán)。按照2-△△CT相對定量計算公式計算各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，分析目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異。

1.5Westernblot檢測TNF-α、MMP-9蛋白表達取50 mg椎間盤組織，用眼科剪剪碎，超聲碎裂組織，按全蛋白提取試劑盒提取椎間盤組織中蛋白，待測樣品用Bradford法測定蛋白含量后，SDS-PAGE凝膠電泳，電泳濕轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果，并確定蛋白分子量標準的位置。含5%脫脂奶粉TBST液封閉2h，孵育一抗1 ∶200，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次,加二抗1 ∶2 000，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，用Western blot發(fā)光檢測試劑盒顯影，凝膠成像系統(tǒng)收集圖像并對Western blot結(jié)果進行吸光度掃描，分析結(jié)果。以上實驗均重復3次，每次設(shè)兩個復孔。

2 結(jié)果

2.1光鏡下觀察椎間盤結(jié)構(gòu)假手術(shù)組各期光鏡下可見椎間盤周圍纖維環(huán)纖維排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整。模型組術(shù)后10周出現(xiàn)椎間盤組織纖維環(huán)排列紊亂，并可見纖維間裂隙形成。術(shù)后12周可見椎間盤、終板軟骨交界處軟骨細胞明顯增生肥大，排列無規(guī)律。術(shù)后16周見髓核皺縮，纖維軟骨終板開裂。

PDTC給藥組術(shù)后10周光鏡下表現(xiàn)與模型組相似，但椎間盤髓核基質(zhì)成分增多，術(shù)后12周終板軟骨細胞周圍基質(zhì)增多，軟骨細胞排列有序。術(shù)后16周實驗組纖維環(huán)排列較整齊，軟骨終板連續(xù)性好(Fig 1、2)。

Tab 1 Primer sequence and PCR product length

2.2椎間盤組織中TNF-αmRNA、MMP-9mRNA表達變化在所有組織中均可見TNF-α mRNA、MMP-9 mRNA的表達，假手術(shù)組(C組)各時間點TNF-α mRNA、MMP-9 mRNA表達無明顯變化。PDTC給藥組(A)及模型組(B)TNF-α mRNA、MMP-9 mRNA表達量隨實驗時間的推移而增多，但增速早期較快，后期逐漸緩慢。PDTC給藥組12周時TNF-α mRNA表達較10周組明顯升高(P<0.01)，但與16周組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。術(shù)后10、12、16周各時間點模型組與假手術(shù)組TNF-α mRNA、MMP-9 mRNA表達差異明顯(P<0.01)。給藥后10、12、16周各時間點PDTC組TNF-α mRNA、MMP-9 mRNA表達量較模型組明顯降低(P<0.01)，但各時間點PDTC給藥組表達量仍明顯高于假手術(shù)組(P<0.01) ,見Fig 2、3。

Fig 1 The disc structure of saline group(HE ×100)

① 10 weeks after surgery: disc fiber ring slightly irregular arranged; ② 12 weeks after surgery: chondrocyte proliferation in cartilage endplate arranged irregularly; ③ 16 weeks after surgery: fiber ring without disturbance but the cartilage endplate crack slightly.

2.3各組各個時間點椎間盤組織中TNF-α、MMP-9蛋白表達變化各時間點假手術(shù)組(C組)都可見TNF-α、MMP-9蛋白表達，各組表達量都較低，各時間點間比較差異(P>0.05)。PDTC給藥組(A組)TNF-α、MMP-9蛋白表達量隨時間延長，蛋白表達量降低越明顯。在10周,12周,16周時間點上PDTC給藥組(A組)蛋白表達量明顯低于模型組(B組)(P<0.01)。PDTC給藥組各時間點間TNF-α、MMP-9蛋白表達量差異(P>0.05)。見Fig 3、4，Tab 4、5。

3 討論

退變頸椎間盤所處的異常力學環(huán)境及產(chǎn)生過量的炎性介質(zhì)是導致椎間盤失去正常功能的兩大主因[5]，兩大因素相互影響，相互促進，加重頸椎間盤退變，引起臨床癥狀。頸椎間盤切除植骨融合術(shù)被認為是頸椎病治療的金標準，但該手術(shù)因可能產(chǎn)生嚴重并發(fā)癥而令很多頸椎病患者顧慮重重[6-7]。能否有一種治療方式，不但免除手術(shù)治療，而且可以取得同樣的治療效果。藥物治療一定程度上是一種比手術(shù)治療更優(yōu)越的治療方法，在尋找藥物有效確切的作用靶點時，透徹的分析疾病的發(fā)生、發(fā)展過程十分重要，因此建立一個理想的椎間盤退變實驗動物模型，對研究椎間盤退變機制是必要的[8]。以往研究一般通過脊柱前方穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的破壞來建立椎間盤退變模型[9]，猴、豬、犬等大型動物是常用的造模對象，但是這類動物價格高，制備模型方法復雜，難度大，試驗周期長，難以滿足需要[10]。我們采用的頸椎動態(tài)失衡造模方法，動物死亡率低，獲得組織形態(tài)學滿意，能很好的模擬頸椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展。我們在該動物模型中觀察到造模術(shù)后隨著時間的延長，頸椎間盤退變越來越嚴重，從纖維環(huán)結(jié)構(gòu)紊亂，直到術(shù)后16周出現(xiàn)軟骨終板的破裂，這與頸椎間盤切除術(shù)中的觀察一致[11]。TNF-α是一種常見的炎性因子，是很多炎性因子的始動因子，被認為是很多炎癥信號通路的上游[12]。目前有很多研究發(fā)現(xiàn)退變頸椎間盤中有大量異常表達的炎性介質(zhì)，但對炎性介質(zhì)的表達規(guī)律尚無詳細的描述。我們發(fā)現(xiàn)TNF-α基因的表達隨時間延長，表達量逐漸增多，在術(shù)后16周表達達到高峰，但TNF-α蛋白的表達在術(shù)后10周表達趨于穩(wěn)定，該炎性因子的基因與蛋白表達有一定的差異性。正常椎間盤內(nèi)膠原的代謝率緩慢而穩(wěn)定,膠原酶多處于潛伏狀態(tài)。椎間盤內(nèi)的產(chǎn)生的TNF-α可以激活潛伏狀態(tài)的膠原酶,使膠原酶活性增加[13]?；|(zhì)金屬蛋白酶是一族依賴鋅離子降解細胞外基質(zhì)蛋白酶系，大量研究表明椎間盤退變MMPs的含量和活性密切相關(guān)[14]。MMP-9的通過分解膠原纖維發(fā)揮破壞纖維結(jié)構(gòu)，該基質(zhì)金屬蛋白酶成為椎間盤退變發(fā)生的最終執(zhí)行者之一。在模型組中MMP-9基因隨時間延長表達量遞增，在術(shù)后16周達到最高值，而MMP-9蛋白在術(shù)后10周表達量相差無幾，作為膠原纖維水解的執(zhí)行者，蛋白的表達決定了其功能的發(fā)揮，術(shù)后10周MMP-9蛋白一直處于較高的水平可能與炎癥后期組織纖維結(jié)構(gòu)的破壞改建有關(guān)。結(jié)合椎間盤退變程度，其與基因表達的變化具有較高的一致性， TNF-α、MMP-9基因在轉(zhuǎn)錄后水平如：作用多種miRNA、lncRNA，參與椎間盤退變的調(diào)控[15]。

Fig 2 The disc structure of PDTC group(HE×100)

① 10 weeks after surgery: disc fiber ring slightly irregular arranged，but matrix increased obviously; ②12 weeks after surgery: chondrocyte proliferation with much matrix around arranged regularly; ③ 16 weeks after surgery: fiber ring without disturbance and the cartilage endplate without crack.

Tab 2 Expression of TNF-α gene at interval time of each group (2-ΔΔCT, ±s,n=6)

**P<0.01vseach group at the same time point;△△P<0.01vs10 wk.

Tab 3 Expression of MMP-9 gene at interval time of each group (2-ΔΔCT, ±s, n=6)

**P<0.01vseach groups at the same time point;△△P<0.01vs10 wk.

Fig 3 The expression of TNF-α proteinlane 1: blank group；lane 2：model group；lane 3：PDTC group

Fig 4 Expression of MMP-9 proteinlane 1: blank group; lane 2: model group; lane 3: PDTC group

Group10wk12wk16wkBlank0.11±0.0160.05±0.030.06±0.02Model0.72±0.083**0.69±0.029**△0.73±0.063**PDTC0.51±0.0170.40±0.06△0.34±0.12Fvalue232.53346.11108.59Pvalue0.0000.0000.000

**P<0.01vseach groups at the same time point

Tab 5 Expression of MMP-9 protein at interval time of each group(gray ratio, ±s，n=6)

**P<0.01vseach groups at the same time point

目前尚無治療頸椎病的有效藥物，很多研究者嘗試各種藥物來預防椎間盤退變的發(fā)生，但這類藥物往往無確切的藥物作用靶點，且具體作用機制不明確[16]。NF-κB 作為多種基因表達調(diào)控的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥性疾病的發(fā)病機制中起重要作用。PDTC因較好的抗炎性受到眾多研究者的青睞。PDTC通過阻止抑制性亞單位IκB的降解，阻礙NF-κB的p65、p50亞基向細胞核的轉(zhuǎn)移等機制，阻斷NF-κB激活的信號通路，從而抑制 NF-κB 活化[17]。PDTC組的椎間盤退變程度較生理鹽水組有所緩解，同時我們觀察到TNF-α、MMP-9無論是基因水平還是蛋白水平，在PDTC的干預下表達較模型組明顯降低，但在這些時間點中尚未觀察到最佳藥物作用時間，這可能與藥物代謝及藥物濃度曲線有關(guān)，目前選用的藥物注射劑量也能發(fā)揮較好的抑制作用。有研究也證實PDTC抑制NF-κB活化可減少炎性介質(zhì)產(chǎn)生。在缺氧再給氧時 PDTC 可以下調(diào)血管內(nèi)皮細胞選擇素E的表達[18]，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，PDTC可以通過抑制NF-κB活化而抑制磨損顆粒誘導基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生[19]。 PDTC對TNF-α、MMP-9基因及蛋白表達抑制有較好的一致性，TNF-α有可能是MMP-9主要調(diào)控的上游基因，PDTC可能是通過抑制了NF-κB的活化，降低了TNF-α的產(chǎn)生，最終導致MMP-9合成減少，達到抑制頸椎間盤退變的效果。

大鼠頸椎動力失衡模型能較好的模擬頸椎間盤退變的發(fā)生，TNF-α、MMP-9是參與該退變過程的重要炎性因子，NF-κB信號通路是調(diào)節(jié)上述因子表達變化的重要信號通路，也是抑制TNF-α、MMP-9炎性因子表達的重要作用靶點，PDTC有望成為抑制頸椎間盤退變的防治藥物。

本研究的不足之處：基于對樣本量的考慮，本實驗據(jù)以往經(jīng)驗確定藥物的使用劑量，如能分多組劑量，則更能反映藥物的作用效果。同樣，此實驗的觀察時間有限，且時間間隔較短，如能延長觀察時間，則可以得到較完整的椎間盤退變的病理生理過程。頸椎間盤退變是一個復雜的代謝過程，我們目前只觀察了退變的部分變化規(guī)律及機制，但尚難以完全揭示頸椎間盤退變的過程，MMP-9降解膠原纖維后產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)可能也參與了椎間盤退變的發(fā)生，這需我們進一步的研究。

(致謝: 本實驗主要是在南昌大學醫(yī)學院及江西省人民醫(yī)院中心實驗室完成,感謝實驗室各位老師的幫助。)

[1] Shi J S, Lin B, Xue C,et al. Clinical and radiological outcomes following hybrid surgery in the treatment of multi-level cervical spondylosis: over a 2-year follow-up[J].JOrthopSurgRes, 2015,10(1): 185.

[2] Liu C, Zhang J F, Sun Z Y,et al. Bioinformatic analysis of the gene expression profiles in human intervertebral disc degeneration associated with inflammatory cytokines[J].JNeurosurgSci, 2015，18(2): 412-7.

[3] 郝永強, 施 杞, 鄭松國,等.大鼠頸椎病實驗?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計與建立[J].中國矯形外科雜志, 1999,6(4): 42-4.

[3] Hao Y Q,Shi Q,Zheng S G,et al.The design and establishment of a model of experimental cervical spondylosis in the rat[J].OrthopedicJChin, 1999,6(4): 42-4.

[4] Han B, Zhu K, Li F C, et al. A simple disc degeneration model induced by percutaneous needle puncture in the rat tail[J].Spine, 2008,33(18): 1925-34.

[5] Willems N, Tellegen A R, Bergknut N,et al. Inflammatory profiles in canine intervertebral disc degeneration[J].BmcVetRes, 2016,12(1): 10.

[6] Elder B D, Sankey E W, Theodros D,et al. Successful anterior fusion following posterior cervical fusion for revision of anterior cervical discectomy and fusion pseudarthrosis[J].JClinNeurosci, 2016,24:57-62.

[7] Weber K T, Jacobsen T D, Maidhof R,et al. Developments in intervertebral disc disease research: pathophysiology, mechanobiology, and therapeutics[J].CurrRevMusculoskeletMed, 2015,8(1): 18-31.

[8] Shi Z, Gu T, Xin H,et al. Intervention of rAAV-hTERT-transducted nucleus pulposus cells in early stage of intervertebral disc degeneration: A study in Canine model[J].TissueEngPartA, 2015,21(15-16): 2186-94.

[9] Wei F, Zhong R, Pan X,et al. Computed tomography guided subendplate injection of pingyangmycin for A novel rabbit model of slowly progressive disc degeneration[J].SpineJ, 2015,10(3): 324-31.

[10] 周滿如,李 近,吳敬開,等. 何首烏對潑尼松致大鼠股骨微結(jié)構(gòu)及生物力學改變的預防作用[J]. 中國藥理學通報,2015,31(9):1273-9.

[10] Zhou M R,Li J,Wu J K,et al.Preventive effect of polygonum multiflorum on deteriorated micro-structure and biomechanical properties induced by prednisone[J].ChinPharmacolBull,2015,31(9):1273-9

[11] 趙 凱,徐勝春,吳建賢，等. 淫羊藿對大鼠退變頸椎間盤內(nèi)IL1-β、IL-6、TNF-α含量的影響[J].安徽醫(yī)科大學學報,2008，43(3)：298-300.

[11] Zhao K,Xu S C,Wu J X,et al.Experimental study the effect of epimedium on IL-1,IL-6, TNF-α of degenerated cervical vertebral of rats[J].ActaUnivMedAnhui，2008，43(3)：298-300.

[12] 張瑞瑞,馮麗萍,雍志強,等. 補腎化瘀方對PCOS模型大鼠中TNF-α表達的影響[J]. 中國藥理學通報,2016,32(9):1331-2

[12] Zhang R R,Feng L P,Yong Z Q,et al.Effects of Bushen huayu recipe on TNF-α expression in PCOS rat model[J].ChinPharmacolBull,2016,32(9):1331-2

[13] Sedowofia K A, Tomlinson I W, Weiss J B,et al. Collagenolytic enzyme systems in human intervertebral disc: their control, mechanism, and their possible role in the initiation of biomechanical failure[J].Spine(PhilaPa1976), 1982,7(3): 213-22.

[14] Li Y, Li K, Hu Y,et al. Piperine mediates LPS induced inflammatory and catabolic effects in rat intervertebral disc[J].IntJClinExpPathol, 2015,8(6): 6203-13.

[15] 張瑩瑩,周建斌,曾祥偉,等. 葛根素對成骨細胞增殖能力及靶向Runx2的miRNA的影響[J].中國藥理學通報,2016,32(10):1457-62.

[15] Zhang Y Y,Zhou J B,Zeng X W,et al. Effects of puerarin on proliferation of osteoblasts and Runx2-targeting miRNAs[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(10):1457-62.

[16] Zhang Y, An H S, Tannoury C,et al. Biological treatment for degenerative disc disease: implications for the field of physical medicine and rehabilitation[J].AmJPhysMedRehabil, 2008,87(9): 694-702.

[17] Lauzurica P, Martinez-Martinez S, Marazuela M,et al. Pyrrolidine dithiocarbamate protects mice from lethal shock induced by LPS or TNF-alpha[J].EurJImmunol, 1999,29(6): 1890-900.

[18] 鄭立新, 安 琪, 石應(yīng)康.缺氧-再給氧時PDTC對血管內(nèi)皮細胞選擇素E表達的作用[J].中華胸心血管外科雜志, 2004,16(3): 37-9.

[18] Zheng L X,An Q,Shi Y K,et al. PDTC reduces E-selectin expression on hypoxia/reoxygenation-stimulated endothelial cells[J].ChinJThoracCardiovascSurg, 2004,16(3): 37-9.

[19] 漆啟華, 戴 閩, 程 濤,等.姜黃素抑制磨損顆粒誘導炎性介質(zhì)產(chǎn)生及作用機制[J].中國藥理學通報, 2009,14(6): 769-72.

[19] Qi Q H,Dai M,Cheng T, et al. Mechanism of curcumin preventing the expression of mediators of inflammation induced by the particulate debris[J].ChinPharmacolBull, 2009,14(6): 769-72.

Pyrrolidinedithiocarbamatealleviatedratcervicalintervertebraldiscdegenerationviareducingtumornecrosisfactorαandmatrixmetalloproteinase9expressionanditsunderlyingmechanism

QI Qi-hua, LI Chen, XIAO Qiang, DENG Liang, ZHANG Sui-hui, LE Yang, DONG Xie-ping

(The2ndDeptofOrthopaedics,JiangxiPeople’sHospital,Nanchang330006,China)

AimTo observe the effect of pyrimidine dithiocarbamate (PDTC) on the variance of disc morphology and the expressions of TNF-α, MMP-9 in the cervical disc in cervical dynamic equilibrium rat models, and to investigate the roles of PDTC in the process of intervertebral disc degeneration and the mechanism involved.MethodsFifty-four SD rats were divided into three groups randomly, then the dynamic equilibrium rat model was established by cutting the nuchal superficial and deep muscle of the rats. The dynamic equilibrium rats with PDTC solution intraperitoneal injection after operations were defined as PDTC group (group A), the models with saline intraperitoneal injection after operations as saline group (group B), the rats of fake operation with saline intraperitoneal injection as blank group (group C), and the animals were sacrificed in batches 10 weeks, 12 weeks, 16 weeks respectively after operation. The C5, C6 vertebrae and C5/6 discs were harvested, and the disc morphology was observed. TNF-α, MMP-9 mRNA expressions were detected by q-PCR and protein expression was observed by Western blot.ResultsCompared with the saline group, the morphology of disc in PDTC group was destructed slightly and fiber ring arranged orderly. TNF-α, MMP-9 gene and protein expressions had no obvious changes (P>0.05) in blank group (group C) at each time point. The expressions of IL-6, MMP-9 mRNA increased with time in group B, but the amount increased fast firstly, and slow lately, reaching peak in 12 weeks. The expression of TNF-α, MMP-9 protein became steady in group B from 10 weeks compared with other time points(P>0.05). TNF-α, MMP-9 genes and proteins expression decreased obviously in PDTC group (group A) compared with saline group (group B) (P<0.01) at each time point, but higher than blank group C(P<0.01) at each time point.ConclusionsTNF-α and MMP-9 are important inflammatory factors involved in rat cervical disc degeneration, PDTC relieves the degeneration of rat cervical disc by reducing the expression of TNF-α and MMP-9 via disturbing the NF-κB signal pathway probably, and PDTC may become potential medicine for disc degeneration.

pyrimidine dithiocarbamate; cervical disc degeneration; tumor necrosis factor α; matrix metalloproteinases 9; cervical dynamic equilibrium; NF-κB signal pathway

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.013

A

：1001-1978(2017)10-1393-06

R-332；R323.4； R681.505；R977.3；R977.6

時間：2017-9-5 9:26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.026.html

2017-05-23，

2017-08-06

江西省科技支撐計劃資助項目(No 20122BBG70118,20151BBG70119)

漆啟華(1983-) 男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：脊柱外科基礎(chǔ)與臨床，E-mial:qqhua1938@126.com； 董謝平(1963-)，男，主任醫(yī)師，博士生導師，研究方向：脊柱外科基礎(chǔ)與臨床，通訊作者，Tel：0791-86895579,E-mail：13576030901@163.com