周 慧， 周偉強(qiáng)

(沈陽醫(yī)學(xué)院 1. 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室、2. 病原生物學(xué)教研室，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110034)

組蛋白去乙?；敢种苿┱{(diào)控p21WAF1/CIP1啟動子乙?；接绊懭橄侔㎝CF-7細(xì)胞周期

周 慧1， 周偉強(qiáng)2

(沈陽醫(yī)學(xué)院 1. 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室、2. 病原生物學(xué)教研室，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110034)

目的研究組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACI)調(diào)控p21WAF1/CIP1啟動子乙?；?，調(diào)節(jié)乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期的分子機(jī)制。方法采用實(shí)時定量PCR、Western blot和DNA-ChIP方法測定SAHA對乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的影響；應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)技術(shù)探究SAHA調(diào)控p21WAF1/CIP1啟動子乙?；降那闆r。結(jié)果SAHA明顯影響乳腺癌細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)；在針對p21WAF1/CIP1基因功能的篩查中發(fā)現(xiàn)，SAHA可明顯誘導(dǎo)p21WAF1/CIP1mRNA和蛋白的表達(dá)，并且可調(diào)節(jié)p21WAF1/CIP1啟動子乙?；健＝Y(jié)論SAHA通過影響p21WAF1/CIP1啟動子乙?；潭日{(diào)節(jié)乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期的進(jìn)程。

乳腺癌；雌激素受體陽性細(xì)胞；MCF-7；SAHA；p21WAF1/CIP1；乙?；?/p>

乳腺癌是乳腺上皮組織細(xì)胞發(fā)生癌變所形成的，近年來其發(fā)病率逐年上升，并有年輕化的趨勢[1]。乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展與雌激素受體(estrogen receptor, ER)表達(dá)密切相關(guān)。雌激素信號經(jīng)ER介導(dǎo)，刺激癌基因的表達(dá)，抑制抑癌基因的功能，引起癌變。臨床上大多數(shù)乳腺癌患者為ER陽性，約占總發(fā)病率的70%以上。但是ER在乳腺癌中的作用機(jī)制還不是很明確，通過對ER的研究，闡明其在乳腺癌中的發(fā)病機(jī)制，并探究其在預(yù)防及治療乳腺癌中的意義都十分重要[2-3]。

p21WAF1/CIP1屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitor，CKI)家族，定位于6p21.2染色體，基因全長8.6 kb，編碼164個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。p21WAF1/CIP1可以促使細(xì)胞周期停滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[4]。

大量研究表明，組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)的異?？梢l(fā)乳腺癌。而通過抑制HDAC的功能可以起到治療腫瘤的目的[5-6]。辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)為一種廣譜HDAC抑制劑，近年來的研究證明其可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并引起細(xì)胞凋亡[7]。本文以乳腺癌ER陽性細(xì)胞系MCF-7為研究對象，探討SAHA對ER陽性乳腺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由本實(shí)驗(yàn)室凍存；RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素以及鏈霉素，購自美國Thermo公司；SAHA、人重組Leptin蛋白，購自美國Sigma-Aldrich公司；EZ ChIP 試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；HRP偶聯(lián)多克隆抗體、抗β-actin抗體，購自美國Abcam公司；抗HDAC1單克隆抗體、抗乙?；M蛋白H4多克隆抗體、抗組蛋白H4多克隆抗體、抗乙?；M蛋白H3多克隆抗體、抗組蛋白H3多克隆抗體等購自美國Millipore 公司；其他化學(xué)試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。

1.2.2全細(xì)胞RNA提取和實(shí)時定量PCR 將5×108·L-1乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種于6孔板各孔中，細(xì)胞無血清同步化處理后，加入0.625 nmol·L-1Leptin和10 μmol·L-1SAHA與MCF-7細(xì)胞孵育24 h。Rneasy mini kit提取全細(xì)胞RNA，第一條鏈cDNA合成后，應(yīng)用SYBR Green方法，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)。25 μL反應(yīng)體系中包含1×SYBR Green Supermix試劑12.5 μL, 0.1 μmol·L-1上、下游引物各0.5 μL，2 μL cDNA(10 ng)和9.5 μL雙蒸水。實(shí)時定量PCR擴(kuò)增參數(shù)為：50℃ 2 min，95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，60℃延伸1 min，延伸后檢測熒光信號，共40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，mRNA相對表達(dá)量按照2-△△Ct法計(jì)算。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Prime sequence of real-time PCR

1.2.3Western blot檢測 上述Leptin和SAHA處理后的MCF-7細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化、離心后，取細(xì)胞團(tuán)塊經(jīng)M-PER裂解液裂解，應(yīng)用BCA法檢測蛋白濃度。取20 μg各樣品組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜后，加入1 ∶1 000稀釋的羊抗HDAC1單克隆抗體、羊抗乙?；M蛋白H3多克隆抗體、羊抗組蛋白H3多克隆抗體、羊抗乙?；M蛋白H4多克隆抗體、羊抗組蛋白H4多克隆抗體和羊抗p21WAF1/CIP1多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，以羊抗β-actin多克隆抗體作對照。加入1 ∶5 000包被HRP的兔抗羊多克隆抗體，室溫孵育1 h后，化學(xué)發(fā)光法測定蛋白含量。

1.2.4DNA-ChIP 將6×109·L-1的乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中，血清饑餓同步化處理后，加入0.625 nmol·L-1Leptin和10 μmol·L-1SAHA共同培養(yǎng)24 h(培養(yǎng)方法與孵育時間同“1.2.2”)。經(jīng)預(yù)冷PBS沖洗2次后，1 %戊二醛室溫振蕩固定10 min。1×甘氨酸室溫中和5 min后，預(yù)冷PBS沖洗2次。用細(xì)胞鏟刮掉培養(yǎng)皿中細(xì)胞，700×g離心5 min后，用含Micrococcal nuclease (10 unit·μL-1)的細(xì)胞裂解液溶解細(xì)胞。離心后，取上清液，分別與羊抗乙?；M蛋白H3多克隆抗體和羊抗乙?；M蛋白H4多克隆抗體4℃孵育過夜。加入Protein G Agarose和細(xì)胞IP孵育液4℃振蕩作用1 h，5 000×g離心1 min，取Protein G Agarose細(xì)胞IP復(fù)合物，依次經(jīng)低鹽、高鹽、LiCl、TE溶液沖洗后，經(jīng)Elution Buffer洗脫、5 mol·L-1NaCl 65℃去交聯(lián)、DNA柱純化后，所得沉淀即為ChIP 產(chǎn)物。加入2.5 μL ChIP 產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時定量PCR分析，以GAPDH基因啟動子片段為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1SAHA通過調(diào)控乳腺癌細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)因子的表達(dá)而影響乳腺癌細(xì)胞生長Fig 1結(jié)果顯示，將SAHA與乳腺癌MCF-7細(xì)胞作用后發(fā)現(xiàn)，SAHA明顯抑制了乳腺癌細(xì)胞CDK2、CyclinE1、CDK4、CyclinD1 mRNA和蛋白的表達(dá)。經(jīng)SAHA作用后，CDK2、CyclinE1、CDK4、CyclinD1都有不同程度的下降，而Leptin處理后，這些因子的表達(dá)都明顯上升。另外，我們發(fā)現(xiàn)，凋亡調(diào)控因子Bcl-2的表達(dá)也發(fā)生了變化，SAHA抑制了其mRNA和蛋白的表達(dá)，而Leptin則誘導(dǎo)了其表達(dá)。

Fig 1 Effects of SAHA on expressions ofcell cycle regulators in MCF-7 breast cancer cells

A: Quantitative real-time PCR；B: Western blot. B: Basal；B+S: Basal+SAHA；L: Leptin；L+S: Leptin+SAHA.*P<0.05vsbasal

2.2SAHA影響MCF-7細(xì)胞乙?；絊AHA作用MCF-7細(xì)胞后對乙?；降挠绊懀Y(jié)果見Fig 2，SAHA可抑制HDAC1 mRNA和蛋白的表達(dá)。而乙?；M蛋白H3和H4的蛋白表達(dá)量在SAHA的作用下大幅上升，而作為細(xì)胞生長因子的Leptin則有相反的作用效果。DNA-CIhP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SAHA作用后，MCF-7細(xì)胞內(nèi)與乙?；疕3和H4抗體結(jié)合的DNA物質(zhì)大幅升高，而Leptin作用后，與乙酰化H3和H4抗體結(jié)合的DNA量明顯減少。

2.3SAHA影響乳腺癌細(xì)胞增殖過程中伴隨著p21WAF/CIP1啟動子功能的上升Fig 3結(jié)果表明，SAHA處理的乳腺癌MCF-7細(xì)胞中p21WAF/CIP1mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組細(xì)胞，而Leptin則抑制了p21WAF/CIP1的功能(Fig 2A、2B)。DNA-ChIP結(jié)果顯示，SAHA作用MCF-7細(xì)胞后，p21WAF/CIP1啟動子區(qū)域與乙?；M蛋白H3、H4結(jié)合的染色質(zhì)物質(zhì)明顯多于未處理細(xì)胞組，而同樣Leptin處理后p21WAF/CIP1啟動子區(qū)域結(jié)合的DNA量明顯減少(Fig 2C、2D)。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率上升趨勢明顯。p21WAF1/CIP1是具有廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期抑制蛋白，與腫瘤的分化、浸潤深度、增生和轉(zhuǎn)移有關(guān)。HDAC 的過度表達(dá)可使核心組蛋白高度去乙?；M(jìn)而染色體發(fā)生凝聚，使相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，引起癌變的發(fā)生[8-9]。HDAC抑制劑因此被視為一類有廣闊應(yīng)用前景的抗癌藥物[10-12]。SAHA作為組蛋白去乙?；敢种苿哂辛己玫目鼓[瘤作用。在本研究中，我們應(yīng)用SAHA與乳腺癌MCF-7細(xì)胞作用，發(fā)現(xiàn)SAHA明顯抑制了乳腺癌細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)，其主要對G1-S期進(jìn)程進(jìn)行調(diào)控，因此SAHA可能通過抑制細(xì)胞周期S期進(jìn)程而發(fā)揮調(diào)控作用。另外，針對p21WAF1/CIP1基因功能的篩查中發(fā)現(xiàn)，SAHA可明顯誘導(dǎo)p21WAF1/CIP1mRNA和蛋白的表達(dá)，并且可調(diào)節(jié)p21WAF1/CIP1啟動子的功能。綜上所述，本文明確了SAHA通過調(diào)控p21WAF1/CIP1啟動子乙酰化水平，影響乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期。

Fig 2 Effects of SAHA on acetylated levels in MCF-7 breast cancer cells

A：Determination of HDAC1 by quantitative real-time PCR；B: Western blot；C: Determination of acetylated histone H3 by ChIP；D: Determination of acetylated histone H4 by ChIP. B: Basal；B+S: Basal+SAHA；L: Leptin；L+S: Leptin+SAHA.*P<0.05vsbasal

Fig 3 SAHA functions on specific regions ofp21WAF/CIP1 to inhibit HDAC1 expressions

A: Quantitative real-time PCR；B: Western blot；C: ChIP for AcH3；D: ChIP for AcH4. B: Basal；B+S: Basal+SAHA；L: Leptin；L+S: Leptin+SAHA.*P<0.05vsbasal

(致謝：衷心感謝沈陽醫(yī)學(xué)院遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室為本實(shí)驗(yàn)提供的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，感謝實(shí)驗(yàn)室全體工作人員對本實(shí)驗(yàn)的大力協(xié)助。)

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SAHAaffectscellcycleofMCF-7breastcancercellsbyregulatingacetylatedlevelsofp21WAF1/CIP1promoter

ZHOU Hui1, ZHOU Wei-qiang2

(1.DeptofHistologyandEmbryology; 2.DeptofPathogenBiology,KeyLabofEnvironmentalPollutionandMicroecologyofLiaoningProvince,ShenyangMedicalCollege,Shenyang110034,China)

AimTo study the regulation mechanisms of deacetylase inhibitor SAHA in p21WAF1/CIP1promoter acetylation in breast cancer MCF-7 cells.MethodsWe used quantitative real-time PCR, Western blot and DNA-ChIP to determine the effects on the regulation of cell cycle with SAHA treatment in MCF-7 cells. By DNA-ChIP, we assessed the acetylation level of p21WAF1/CIP1promoter.ResultsSAHA significantly affected the expression of cell cycle-related factors, and induced the mRNA and protein expression of p21WAF1/CIP1. SAHA could adjust the acetylation level of p21WAF1/CIP1promoter.ConclusionSAHA regulates the cell cycle progression by adjusting the acetylation level of p21WAF1/CIP1promoter in MCF-7 cells.

breast cancer; estrogen receptor positive cell line; MCF-7; SAHA; p21WAF1/CIP1; acetylation

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.018

A

：1001-1978(2017)10-1421-05

R329.24；R329.28；R737.902.2；R977.3

時間：2017-9-5 9:26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.036.html

2017-05-10,

2017-07-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81172509)

周 慧(1982-)，女，博士，講師，研究方向：腫瘤學(xué)，E-mail：zhouhui8013@163.com； 周偉強(qiáng)(1970-)，男，博士，教授，研究方向：乳腺癌發(fā)生與調(diào)控，通訊作者，E-mail：zhouwq@hotmail.com