李 亞 石鳳芹 朱陵群 田劭丹 董 青 侯 麗

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院血液腫瘤科，北京，100700； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100700)

新加良附方抑制人胃癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制

李 亞1石鳳芹1朱陵群2田劭丹1董 青1侯 麗1

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院血液腫瘤科，北京，100700； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100700)

目的：探討新加良附方及其主要成分薯蕷皂苷藥物血清對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖抑制作用及可能的作用機(jī)制。方法：制備新加良附方及薯蕷皂苷藥物血清，并作用于胃癌細(xì)胞株BGC-823，使用MTS方法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率；采取實(shí)時(shí)PCR方法觀察新加良附方及薯蕷皂苷藥物血清對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823中caspase-3及p53表達(dá)的影響；采取實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)胃癌細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平。結(jié)果：新加良附方藥物血清及薯蕷皂苷藥物血清對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823有明顯的增殖抑制作用，并且其作用與時(shí)間正相關(guān)。新加良附方對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用在48 h、72 h高于其主要成分薯蕷皂苷；人胃癌BGC-823細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)明顯低于其在正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中的水平，p53基因表達(dá)水平高于正常GES-1細(xì)胞中的p53表達(dá)水平。新加良附方藥物血清及薯蕷皂苷藥物血清作用于BGC-823細(xì)胞后其caspase-3表達(dá)水平均明顯上升，且隨著時(shí)間增加其表達(dá)量升高；p53基因表達(dá)水平下降，并且與時(shí)間負(fù)相關(guān)。新加良附方與其主要成分薯蕷皂苷相比較，兩者對(duì)caspase-3、p53的調(diào)控作用無明顯差異；胃癌細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1。結(jié)論：新加良附方及其主要成分薯蕷皂苷可以顯著抑制胃癌BGC-823細(xì)胞的生長，新加良附方對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用高于其主要成分薯蕷皂苷。新加良附方及薯蕷皂苷抑制胃癌細(xì)胞增殖作用可能與增加凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)，抑制突變型p53表達(dá)相關(guān)。miR-34a可能發(fā)揮癌基因的作用，應(yīng)明確其作用并進(jìn)行下一步研究。

新加良附方；胃癌；caspase-3；p53；miR-34a

我國是一個(gè)胃癌大國，多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期，喪失手術(shù)根治可能?；熓侵型砥谖赴┲饕闹委煷胧?，但療效不容樂觀，且伴有顯著的治療相關(guān)毒性。中醫(yī)藥在胃癌治療中扮演著重要角色，可以改善患者生命質(zhì)量、控制臨床癥狀、提高緩解率、減低治療相關(guān)并發(fā)癥、延長生存時(shí)間等，讓患者從治療中受益，具有多角度多靶點(diǎn)的綜合療效優(yōu)勢(shì)。課題組前期對(duì)167例進(jìn)展期胃癌研究分析顯示脾胃虛寒、氣滯血瘀型是本病最基本的證型，因此陳信義教授結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)及長期臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)提出胃癌發(fā)病的關(guān)鍵病機(jī)是為“脾陽不振、聚濕生痰”，進(jìn)而導(dǎo)致寒痰凝滯胃脘、阻滯氣機(jī)，氣機(jī)不暢，氣滯血瘀，終至形成積聚癥瘕，并確立胃癌的基本治療法則“溫中散寒、行氣活血”，在經(jīng)典名方良附丸基礎(chǔ)上加穿山龍組成“新加良附方”(高良姜：香附：穿山龍為1∶1∶2)用于治療胃癌[1-2]。

前期研究發(fā)現(xiàn)新加良附方的抑瘤作用可能與其調(diào)節(jié)caspase-3、Bcl-2、Akt、Survivin、Fas/FasL等表達(dá)有關(guān)[3-9]，但是關(guān)于caspase-3上游基因在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及與新加良附方、主要成分薯蕷皂苷的關(guān)系并未涉及，作用機(jī)制和靶點(diǎn)尚未明確。因此為進(jìn)一步明確新加良附方抗胃癌的效應(yīng)機(jī)制，我們將從凋亡入手進(jìn)一步研究其對(duì)caspase-3、p53及與miR-34a相關(guān)的通路的影響，探討可能的機(jī)制，為臨床治療胃癌提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 6周齡SD雄性大鼠10只，體重(300±20)g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物于國家藥物安全評(píng)價(jià)中心SPF級(jí)別實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周，飼養(yǎng)條件為(22±3)℃，光暗周期12 h/12 h，自由攝食飲水。人胃癌細(xì)胞株BGC-823及人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤細(xì)胞庫。

1.1.2 藥物 新加良附方由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院制劑室提供，實(shí)驗(yàn)用藥采用同一批號(hào)藥物，薯蕷皂苷購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司(20 mg/支，批號(hào)：151106)。

1.1.3 試劑與儀器 RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司，胎牛血清購自天津康源公司，胰蛋白酶、Trizol購自美國Sigma公司，MTS購自Promega公司，氯仿、異丙醇、無水乙醇購自北京化工廠，DEPC水購自GenStar公司，miR-34a莖環(huán)引物及p53、caspase-3、β-actin、miR-34a、U6的實(shí)時(shí)PCR引物購自北京擎科新業(yè)公司，Oligo DT、AMV Buffer、5×AMV Buffer、dNTP、RNA inhibitor、SYBR Premix Ex Taq購自大連寶生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 將10只6周齡SD雄性大鼠隨機(jī)分為新加良附方組(新加良附方顆粒劑)、薯蕷皂苷組，每組5只。

1.2.2 給藥方法 參考前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，新加良附方組大鼠以新加良附方每天5 g/(kg鼠重)灌胃，薯蕷皂苷組以薯蕷皂苷每天0.45 g/9 kg鼠重)灌胃，1次/d，連續(xù)5 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1)藥物血清的制備：10只6周齡SD雄性大鼠于末次給藥次日無菌條件下腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心15 min、4 ℃離心分離血清，56 ℃滅活30 min，用0.22 μm針頭濾器滅菌后分裝，置于-20 ℃冰箱保存，備用。2)MTS實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)箱常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞，以含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×105細(xì)胞/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL/孔，設(shè)置調(diào)零組、對(duì)照組、新加良附方組和薯蕷皂苷組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)過夜后換為無血清培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)藥物分組向每孔加入受試血清10 μL，藥物作用于細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，每孔加MTS溶液20 μL，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～4 h后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在波長490 nm處讀取吸光度(A值。按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率(IR)=[1-(實(shí)驗(yàn)組A490 nm值-空白組A490 nm值)/(對(duì)照組A490 nm值-空白組A490 nm值)]×100%。3)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法：檢測(cè)新加良附方及薯蕷皂苷藥物血清對(duì)caspase-3及p53表達(dá)的影響：首先檢測(cè)未經(jīng)藥物作用的細(xì)胞中caspase-3及p53表達(dá)水平。收集對(duì)數(shù)生長的BGC-823及GES-1細(xì)胞5×105個(gè)，提取總RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA，在包含上下游引物、cDNA、SYBR Premix Ex Taq等的反應(yīng)體系中，以β-actin為內(nèi)參，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。caspase-3引物序列如下：F：TTCAGAGGGGATGTTGTAGA，R：AATAACCAGGTGCTGTGGAGTA；p53引物序列如下：F：CTCTGACTGTACCACCATCCAC，R：CAAACATGCACCTCAAAGCT；β-actin引物序列如下：F：GACATCCGCAAAGACCTG，R：AACGCTTCACGAATTTGCGT。進(jìn)一步檢測(cè)藥物作用后胃癌細(xì)胞中caspase-3及p53表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)藥物分為3組：對(duì)照組、新加良附方藥物血清組和薯蕷皂苷藥物血清組。取對(duì)數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞，以含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5×105細(xì)胞/2 mL，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2 mL/孔。置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后棄掉舊培養(yǎng)基，將無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基1 800 μL加入細(xì)胞中，按實(shí)驗(yàn)藥物分組向每孔加入受試血清200 μL，分別收集藥物作用24 h、48 h前后細(xì)胞，檢測(cè)caspase-3及p53在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，方法同前。進(jìn)一步我們檢測(cè)胃癌細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平：收集對(duì)數(shù)生長的BGC-823及GES-1細(xì)胞5×105個(gè)，提取總RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA，在包含上下游引物、cDNA、SYBR Premix Ex Taq等的反應(yīng)體系中，以U6為內(nèi)參，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。miR-34a引物序列如下：F：GCGTGGCAGTGTCTTAGCT，R：TGGGTTCATTTCTGGGTCTT；U6引物序列如下：F：CTCGCTTCGGCAGCACA，R：AACGCTTCACGAATTTGCGT。實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的定量校正和判定分析：采用比較Ct值方法來定量caspase-3、p53及miR-34a表達(dá)水平，用β-actin/U6作為內(nèi)參，將每個(gè)樣本的Ct值與內(nèi)參照的Ct值相減，即△Ct=檢測(cè)基因△Ct值-內(nèi)參基因△Ct值，計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量2-△△CT值。

2結(jié)果

2.1 新加良附方及薯蕷皂苷藥物血清對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用 通過MTS方法檢測(cè)新加良附方及其主要成分薯蕷皂苷對(duì)BGC-823細(xì)胞的增殖抑制影響，結(jié)果顯示新加良附方及薯蕷皂苷藥物血清對(duì)細(xì)胞增殖抑制率在24 h(23.67±0.79)%、(21.12±2.88)%;48 h(45.50±1.43)%、(35.79±5.13)%;72 h(65.91±2.35)%、(44.28±3.41)%;明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；新加良附方對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制率在24 h、48 h、72 h各時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，新加良附方對(duì)胃癌細(xì)胞增殖抑制率隨時(shí)間的增加而升高；薯蕷皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制率在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，薯蕷皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制率與時(shí)間正相關(guān)。新加良附方藥物血清對(duì)細(xì)胞增殖抑制率在48 h、72 h高于薯蕷皂苷藥物血清，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 藥物對(duì)胃癌細(xì)胞增殖抑制率

注：P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.2 胃癌細(xì)胞中caspase-3及p53表達(dá)水平 實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞BGC-823中caspase-3相對(duì)表達(dá)量約為人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞的(0.289 5±0.054 7)倍，顯著低于其在GES-1細(xì)胞中的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；p53在胃癌細(xì)胞BGC-823中相對(duì)表達(dá)量為GES-1細(xì)胞的(1.176 9±0.040 0)倍，高于其在人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 藥物作用后胃癌細(xì)胞caspase-3表達(dá)水平變化 新加良附方藥物血清作用于BGC-823細(xì)胞24 h、48 h后caspase-3相對(duì)表達(dá)量約為對(duì)照組(3.886 3±0.759 9)倍、(15.002 7±0.816 6)倍，24 h與48 h比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示新加良附方可上調(diào)caspase-3的表達(dá)，與時(shí)間正相關(guān)；薯蕷皂苷藥物血清作用于BGC-823細(xì)胞24 h、48 h后 caspase-3相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組(3.455 3±0.555 4)倍、(11.968 5±1.900 8)倍，24 h與48 h比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示薯蕷皂苷可上調(diào)caspase-3表達(dá)水平，與時(shí)間正相關(guān)；2組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但新加良附方對(duì)caspase-3表達(dá)水平的調(diào)控顯示出優(yōu)于其主要成分薯蕷皂苷的趨勢(shì)。見圖2。

2.4 藥物作用后胃癌細(xì)胞p53表達(dá)水平變化 新加良附方藥物血清作用于BGC-823細(xì)胞24 h、48 h后p53相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組(0.580 7±0.112 3)倍、(0.271 2±0.077 5)倍，24 h與48 h比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示新加良附方可下調(diào)p53表達(dá)水平，作用與時(shí)間負(fù)相關(guān)。薯蕷皂苷藥物血清作用于BGC-823細(xì)胞24 h、48 h后p53相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組(0.600 3±0.181 3)倍、(0.299 9±0.007 1)倍，24 h與48 h比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示薯蕷皂苷可下調(diào)p53表達(dá)水平，作用與時(shí)間負(fù)相關(guān)。2組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但新加良附方對(duì)p53表達(dá)調(diào)控顯示出優(yōu)于其主要成分薯蕷皂苷的趨勢(shì)。見圖3。

圖2 藥物作用后caspase-3表達(dá)水平

圖3 藥物作用后p53表達(dá)水平

2.5 胃癌細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平 實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)胃癌細(xì)胞系BGC-823和正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中miR-34a的表達(dá)情況，BGC-823細(xì)胞中miR-34a相對(duì)表達(dá)量約為GES-1細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平的(30.71±7.934 4)倍，較GES-1細(xì)胞miR-34a表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 miR-34a表達(dá)水平

3討論

新加良附方藥物血清可顯著抑制細(xì)胞增殖，作用呈時(shí)間依賴性，這與課題組前期基礎(chǔ)研究結(jié)果一致。方中主要成分薯蕷皂苷是穿山龍的提取物，亦可明顯抑制細(xì)胞增殖，但是其對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率在48 h、72 h均低于新加良附方藥物血清。這提示我們新加良附方中除了薯蕷皂苷外尚有其他有效成分可以起到抗腫瘤的作用，如有學(xué)者報(bào)道高良姜及香附的提取物可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長。新加良附方作為中藥復(fù)方，成分復(fù)雜，在今后的研究中我們可以進(jìn)一步明確新加良附方中其他有效成分。

半胱天冬酶(caspase)又稱凋亡蛋白酶，是細(xì)胞凋亡執(zhí)行者，是一組對(duì)底物天冬氨酸部位有特異水解作用的蛋白酶，其中心富含半胱氨酸，可以分為啟動(dòng)型和效應(yīng)型，其中后者主要包括caspase-3、6和7。caspase-3是caspase家族最重要的凋亡執(zhí)行者之一，被認(rèn)為是整個(gè)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)[10]，受p53及其靶基因的調(diào)控，可誘發(fā)并加速凋亡的進(jìn)行[11]。本實(shí)驗(yàn)顯示caspase-3表達(dá)水平在胃癌細(xì)胞中較正常人胃黏膜上皮細(xì)胞中低，提示caspase-3表達(dá)的降低與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，新加良附方及主要成分薯蕷皂苷藥物血清作用于胃癌細(xì)胞后其caspase-3水平均升高，提示兩者可提高caspase-3蛋白表達(dá)水平，參與調(diào)控細(xì)胞的凋亡過程。p53基因有野生型和突變型2種，野生型p53是腫瘤抑制基因，它與細(xì)胞的生長阻滯和凋亡有關(guān)。在許多腫瘤細(xì)胞中，有p53的缺失和突變則凋亡過程減弱。突變的p53基因失去正常生物學(xué)活性，不能誘導(dǎo)受損細(xì)胞的凋亡，這些細(xì)胞就成為癌細(xì)胞的前身，通過其靶基因發(fā)揮作用，從而影響細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡過程，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。本實(shí)驗(yàn)顯示胃癌細(xì)胞BGC-823中突變p53表達(dá)水平較正常細(xì)胞GES-1水平增高。新加良附方藥物血清和薯蕷皂苷藥物血清作用于胃癌細(xì)胞后其p53表達(dá)水平降低，提示兩者抑癌作用可能與抑制突變型p53表達(dá)水平有關(guān)。但是對(duì)于caspase-3及p53表達(dá)水平的調(diào)控，新加良附方與薯蕷皂苷相比較并無明顯差異，這提示我們新加良附方對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用除了參與凋亡的調(diào)控，可能仍與細(xì)胞周期及衰老等其他途徑相關(guān)，這也顯示了中藥抗腫瘤的多靶點(diǎn)多途徑作用，因此今后我們將從細(xì)胞周期等多方面進(jìn)行研究。

微小RNA(miRNA)是一類長度約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平沉默基因的表達(dá)，為近年的研究熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)miR-34a受p53直接調(diào)控，是p53重要的靶基因，其可以通過調(diào)控caspase-3、Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞的凋亡過程[13-16]，能夠直接抑制SIRT1從而調(diào)控p53的轉(zhuǎn)錄活性，因此miR-34a在p53基因的調(diào)控通路中發(fā)揮著重要作用[17]。miR-34a作為抑癌基因，在不同腫瘤中呈低表達(dá)[18]，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞BGC-823中miR-34a表達(dá)較GES-1細(xì)胞中表達(dá)水平升高，這與部分報(bào)道不符。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miR-34a作為抑癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用，但另有一些學(xué)者關(guān)于miR-34a起到癌基因還是抑癌基因的作用存在不同意見，如研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中miR-34a的表達(dá)明顯高于正常組織[19]，Osawa等[20]分析手術(shù)后30例胃癌患者腫瘤組織miRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-34a表達(dá)水平高于正常組，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中miR-34a高表達(dá)[21]，并提示可能與機(jī)體增殖與凋亡不平衡有關(guān)，這些研究均提示miR-34a可能發(fā)揮癌基因作用，故miR-34a作用及其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，分析所得結(jié)果，考慮除了miR-34a可能發(fā)揮癌基因作用外，還可能存在以下原因：實(shí)驗(yàn)所需的miR-34a莖環(huán)引物及PCR引物存在非特異性可能，因此應(yīng)繼續(xù)查閱文獻(xiàn)尋找可靠的引物序列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；Cao等[22]、陳艷輝[23]及Yang等[24]發(fā)現(xiàn)在不同胃癌細(xì)胞系中其miR-34a表達(dá)亦不同，分析其結(jié)果可能與細(xì)胞株分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及能否分泌粘液素相關(guān)，因此我們將檢測(cè)多種細(xì)胞系中miR-34a表達(dá)以明確不同細(xì)胞系中其差異性表達(dá)情況。同時(shí)檢測(cè)高表達(dá)miR-34a細(xì)胞對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響以明確其作用。明確miR-34a作用后，我們將繼續(xù)檢測(cè)新加良附方及薯蕷皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞miR-34a表達(dá)水平及甲基化的影響，明確新加良附方及薯蕷皂苷如何從表觀遺傳學(xué)方面調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展并啟動(dòng)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、血管生成等過程，進(jìn)行體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察其作用機(jī)理，為臨床治療胃癌提供依據(jù)。

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(2016-12-15收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄)

MolecularMechanismsofXinjialiangFufanginInhibitingHumanGastricCancerCellProliferation

Li Ya1,Shi Fengqin1,Zhu Lingqun2,Tian Shaodan1,Dong Qing1,Hou Li1

(1DepartmentofOncologyandHematology,DongzhimenHospitalaffiliatedtoBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China; 2KeyLaboratoryofChineseinternalmedicine,Ministryofeducation,Dongzhimenhospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,BeijingKeyLaboratoryofinternalmedicine,Beijing100700,China)

Objective:To explore the inhibitory effect of Xinjialiang Fufang serum and Dioscin serum on the proliferation of human gastric cancer cells BGC-823 and the possible mechanism of their action.Methods:To prepare Xinjialiang FuFang serum and Dioscin serum and act on the human gastric cancer cells BGC-823 and detect the cell proliferation inhibitory rate using MTS assay.To observe the effect of Xinjialiang Fufang serum and Dioscin serum on the expression of caspase-3 and p53 in human gastric cancer cells BGC-823 using RT-PCR method.To detect the expression level of miR-34a in gastric cancer cell using RT-PCR method.Results:Xinjialiang Fufang serum and Dioscin serum have significant cell proliferation inhibitory effect against the human gastric cancer cells BGC-823 and its effect is directly proportional to time.The proliferation inhibitory effect of XinJiaLiangFuFang serum is better than Dioscin serum at 48 h and 72 h.The expression level of caspase-3 in human gastric cancer cells BGC-823 is lower than the normal gastric mucosa epithelial cells GES-1,while its p53 expression level is higher than the normal GES-1 cell.After the XinJiaLiangFuFang serum and Dioscin serum have acted on the BGC-823 cell,its caspase-3 gene expression level significantly increased and the expression level has increased with time,while the p53 gene expression level decreased and is inversely proportional to time.The regulation of caspase-3 and p53 gene between XinJiaLiangFuFang serum and Dioscin serum has no statistical difference.The expression level of miR-34a in gastric cancer cell is higher than the normal gastric mucosa epithelial cells GES-1.Conclusion:Xinjialiang Fufang and Dioscin can significantly inhibit the proliferation of human gastric cancer cells BGC-823 and their effect may be related to the increase of caspase-3 expression and the inhibition of mutated p53 expression.MiR-34a might play a role of oncogene and it is necessary to study further for the next research.

Caspase-3; MiR-34a; P53; Dioscin; Gastric cancer; Xinjialiang Fufang

R289.5；R735.2

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.036

北京中醫(yī)藥大學(xué)面上項(xiàng)目(中青年教師類)(2015-JYB-JSMS063)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81573959)

李亞(1990.08—)，女，在讀博士，住院醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治惡性腫瘤，E-mial：18731971919@163.com；石鳳芹(1982.08—)，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治惡性腫瘤及血液病，E-mial：shifengqinbj@sina.com

侯麗(1969.12—)，女，博士，主任醫(yī)師，教授，科室主任，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治惡性腫瘤，E-mial：houli1203@126.com