路立花 楊 莉 徐玉榮

(河北省眼科醫(yī)院口腔種植科，邢臺(tái)，054000)

葛根素對(duì)成骨細(xì)胞增殖及骨形態(tài)發(fā)生蛋白的影響

路立花 楊 莉 徐玉榮

(河北省眼科醫(yī)院口腔種植科，邢臺(tái)，054000)

目的：探討葛根素對(duì)成骨細(xì)胞增殖及骨形態(tài)發(fā)生蛋白的影響。方法：采用血清藥理學(xué)方法制備葛根素含藥血清，分為葛根素組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。從SD大鼠乳鼠顱骨獲取成骨細(xì)胞，分別用含藥血清培養(yǎng)分離得到的成骨細(xì)胞。采用CCK-8檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)的表達(dá)；采用微量酶標(biāo)法檢測(cè)堿性磷酸酶的活性。結(jié)果藥物作用24、48和72 h后，葛根素組D值顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，且顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。隨著時(shí)間的增加，葛根素組和陽(yáng)性對(duì)照組D值在藥物作用48 h達(dá)到最高，至72 h后有下降趨勢(shì)。藥物作用3 d和7 d后，葛根素組BMP-2表達(dá)水平均顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，且顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。藥物作用3 d和7 d后，葛根素組BMP-2表達(dá)水平均顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，且顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。藥物作用3 d和7 d后，葛根素組堿性磷酸酶活性均顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，且顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論葛根素可能通過(guò)誘導(dǎo)BMP-2表達(dá)促進(jìn)增殖，活化堿性磷酸酶活性促進(jìn)生物礦化。

骨質(zhì)疏松癥；葛根素；成骨細(xì)胞；增殖；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種常見(jiàn)病，主要表現(xiàn)為骨量的減少，使患者骨折的危險(xiǎn)性不斷的增加，在老年人和絕經(jīng)期婦女中尤為常見(jiàn)[1]。OP主要包括原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥3類[2]。成骨細(xì)胞在骨形成過(guò)程中具有重要作用，具有相關(guān)物質(zhì)的分泌、基質(zhì)的合成和骨組織礦化的作用[3]。當(dāng)成骨細(xì)胞增殖分化程度降低或受抑制時(shí)，容易發(fā)生OP。既往研究顯示，葛根素具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用，然而其確切的機(jī)制還不十分清楚[4-5]。鑒于此，本研究觀察葛根素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)表達(dá)水平的影響，旨在為葛根素臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠30只，體重160～180 g(上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。普通飼養(yǎng)環(huán)境，隨機(jī)分為葛根素組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組(生理鹽水組)，每組10只。出生1～3 d的SD乳鼠10只。

1.2 主要試劑 α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS液，美國(guó)sigma公司)；2.5 g/L胰酶(美國(guó)Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素液(碧云天生物技術(shù)研究所)；細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8，上海邦奕生物科技有限公司)；堿性磷酸酶測(cè)試盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；大鼠BMP-2酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海和序生物科技有限公司)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 Synergy2多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；超凈工作臺(tái)(AIRTECH，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；紫外分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；BS223S型電子天平(北京賽多利斯儀器系列有限公司)；臺(tái)式低溫高速冷凍離心機(jī)(太倉(cāng)市醫(yī)療械廠)。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥物及含藥血清 葛根素為本實(shí)驗(yàn)室制備產(chǎn)品，經(jīng)HPLC驗(yàn)證純度在99.9%以上。40只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，葛根素組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組分別灌胃給藥，2次/d，連續(xù)5 d。第5天末次給藥1 h后，腹腔注射10 mg/L戊巴比妥鈉，采集腹主動(dòng)脈血，4 ℃放置2 h后離心(1 000 r/min×10 min)，分離血清?；旌贤M老鼠所制備的血清，滅活(56 ℃，30 min)，0.22 μm濾膜過(guò)濾后儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱。按人-大鼠體表面積比值法折算計(jì)算大鼠葛根素給藥劑量。

1.5 大鼠成骨細(xì)胞的獲取 1)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品：包括眼科剪、一次性培養(yǎng)板、培養(yǎng)基、消化瓶(20 mL)、細(xì)胞篩、消化液、冰塊。2)取10只出生1～3 d的SD乳鼠，75%醫(yī)用乙醇浸泡后放入潔凈操作臺(tái)。取出顱骨，放入冰冷的D-Hanks液中，剔除附著的結(jié)締組織，PBS清洗3次，放入α-MEM培養(yǎng)基。3)將顱骨用小剪刀剪為0.5～1.0 mm3大小，加入5 mL 2.5 g/L胰酶消化。4)將磁轉(zhuǎn)子放入消化瓶?jī)?nèi)，37 ℃孵箱消化20 min，棄掉上清液。5)繼續(xù)將5 mL消化液加入到消化瓶中，37 ℃孵箱消化20 min，棄掉上清液，加入含有10%的小牛血清的培養(yǎng)基終止消化。6)合并消化液，用200目細(xì)胞篩過(guò)濾離心(1 000 r/min×5 min)，棄上清。加入含體積分?jǐn)?shù)1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基和體積分?jǐn)?shù)12%胎牛血清重懸細(xì)胞，吸管吹打，洗滌沉淀，離心(1 000 r/min×5 min)，棄上清。接種后37 ℃孵箱培養(yǎng)，24 h后換液。7)取出培養(yǎng)瓶，懸浮液于50 mL離心管中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。8)按實(shí)驗(yàn)需求，采用1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將2～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.6 成骨細(xì)胞的鑒定

1.6.1 形態(tài)觀察 培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)。

1.6.2 蘇木精-伊紅(HE)染色 采用HE染色法，BMP-2鑒定心肌細(xì)胞。1)將潔凈載玻片消毒后，事先將用多聚賴氨酸處理過(guò)的蓋玻片置于培養(yǎng)板內(nèi)，將心肌細(xì)胞接種于培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。2)培養(yǎng)72 h后，取出蓋玻片，4 ℃PBS沖洗3次。4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗3次。蒸餾水清洗3次。3)加入10%山羊血清，37 ℃孵育30 min，去除多余血清，加入一抗(兔抗1∶100)，PBS清洗3次。4)加入生物素標(biāo)記的二抗(山羊抗兔)，37 ℃孵育30 min，PBS清洗3次。5)加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素，37 ℃孵育30 min，PBS清洗3次。6)DAB顯色2～5 min。7)自來(lái)水沖洗終止染色。70% ～80% ～95% ～100%的乙醇逐級(jí)脫水，各5 min。8)中性樹(shù)膠封片，晾干后拍照并保存。9)熒光顯微鏡下拍攝圖片。

1.7 CCK-8檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖 取3～4代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，2.5 g/L胰酶消化后，用含體積分?jǐn)?shù)1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基和體積分?jǐn)?shù)12%胎牛血清重懸細(xì)胞，按1×106/L接種于6孔板中，24 h后更換為含體積分?jǐn)?shù)為10%的葛根素組、陽(yáng)性對(duì)照組含藥血清及和陰性對(duì)照組血清培養(yǎng)細(xì)胞，7 d后收集細(xì)胞，取上清檢測(cè)堿性磷酸酶，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.8 BMP-2檢測(cè) 取3～4代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，2.5 g/L胰酶消化后，用含體積分?jǐn)?shù)1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基和體積分?jǐn)?shù)12%胎牛血清重懸細(xì)胞，按1×106/L接種于6孔板中，24 h后更換為含體積分?jǐn)?shù)為10%的葛根素組、陽(yáng)性對(duì)照組含藥血清及和陰性對(duì)照組血清培養(yǎng)細(xì)胞，7 d后收集細(xì)胞，于培養(yǎng)的第3天、7天收集上清，取上清BMP-2表達(dá)水平，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。

1.9 堿性磷酸酶活性檢測(cè) 取3～4代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，2.5 g/L胰酶消化后，用含體積分?jǐn)?shù)1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基和體積分?jǐn)?shù)12%胎牛血清重懸細(xì)胞，按1×106/L接種于6孔板中，24 h后更換為含體積分?jǐn)?shù)為10%的葛根素組、陽(yáng)性對(duì)照組含藥血清及和陰性對(duì)照組血清培養(yǎng)細(xì)胞，7 d后收集細(xì)胞，于培養(yǎng)的第3天、7天收集上清，取上清檢測(cè)堿性磷酸酶活性檢測(cè)，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞的鑒定 BMP-2是成骨細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白，圖2為BMP-2單克隆抗體染色的結(jié)果。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，成骨細(xì)胞形態(tài)均呈短梭形、三角形或多邊形，核仁清晰，核藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，為陽(yáng)性反應(yīng)。

圖1 成骨細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定(×100)

2.2 成骨細(xì)胞增殖 藥物作用24、48和72 h后，葛根素組A值顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，且顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。隨著時(shí)間的增加，葛根素組和陽(yáng)性對(duì)照組A值在藥物作用48 h達(dá)到最高，至72 h后有下降趨勢(shì)。

圖2 葛根素含藥血清對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響

2.3 BMP-2表達(dá)水平 藥物作用3 d和7 d后，葛根素組BMP-2表達(dá)水平均顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，且顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 堿性磷酸酶活性 藥物作用3 d和7 d后，葛根素組堿性磷酸酶活性均顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，且顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖3 葛根素含藥血清對(duì)大鼠成骨細(xì)胞 BMP-2表達(dá)水平的影響

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05

圖4 葛根素含藥血清對(duì)大鼠成骨細(xì)胞堿性 磷酸酶活性的影響

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05

3討論

葛根素一種從中藥葛根中提取的異黃酮化合物，屬于植物雌激素，具有保護(hù)缺血心肌、擴(kuò)張血管、改善心腦血管等作用[6]。既往大量研究表明，葛根素具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用，可顯著提高堿性磷酸酶的活性[7-8]。絕經(jīng)后OP是OP的重要類型之一，雌激素替代療法在其治療過(guò)程中具有重要作用，但由于該類藥物存在乳房脹痛、陰道出血、子宮內(nèi)膜增生等嚴(yán)重不良反應(yīng)限制了其進(jìn)一步臨床應(yīng)用[9]。植物雌激素在具備良好的骨細(xì)胞保護(hù)作用前提下，不良反應(yīng)輕，是一種最具潛力的雌激素替代藥物。

本研究采用CCK-8比色法檢測(cè)葛根素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖作用的影響，數(shù)據(jù)顯示，藥物作用24、48和72 h后，葛根素組A值顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，且顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)，表明葛根素對(duì)成骨細(xì)胞的增殖作用具有促進(jìn)作用。同時(shí)，既往研究表明，高藥物濃度的葛根素可能對(duì)成骨細(xì)胞存在一定的細(xì)胞毒作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的增加，葛根素組和陽(yáng)性對(duì)照組A值在藥物作用48 h達(dá)到最高，至72 h后有下降趨勢(shì)，推測(cè)可能也是由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，葛根素可能會(huì)抑制成骨細(xì)胞的增殖，或是產(chǎn)生了細(xì)胞毒作用。張瑩瑩等[11]報(bào)道稱，葛根素干預(yù)成骨細(xì)胞后期堿性磷酸酶活性明顯增加，表明葛根素具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增值和生物礦化的作用。孫玉敏等[12]報(bào)道稱葛根素對(duì)成骨細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用呈劑量依賴性，且作用具有雙向性。本文結(jié)果與以上報(bào)道相似。因此，葛根素對(duì)成骨細(xì)胞的增殖作用具有促進(jìn)作用是有雙向作用的。

葛根素化學(xué)名為4,7-二羥基8-β-D吡喃葡萄糖醛基異黃酮，是葛根提取物的主要成分之一。既往研究對(duì)其促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖作用的機(jī)理展開(kāi)了研究，認(rèn)為葛根素能調(diào)節(jié)成骨特異轉(zhuǎn)錄因子，夠誘導(dǎo)一氧化氮和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的合成，促進(jìn)核因子-κB受體和骨保護(hù)素活化，從而發(fā)揮促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用[13-14]。本組數(shù)據(jù)顯示，藥物作用3 d和7 d后，葛根素組BMP-2表達(dá)水平均顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，且顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)；藥物作用3 d和7 d后，葛根素組堿性磷酸酶活性均顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，且顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)，表明葛根素可能通過(guò)誘導(dǎo)BMP-2表達(dá)促進(jìn)增殖，活化堿性磷酸酶活性促進(jìn)生物礦化。BMP-2是骨形態(tài)發(fā)生蛋白中重要的一種，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β家族。在骨組織形成過(guò)程中，BMP-2通過(guò)旁分泌和自分泌的方式在細(xì)胞間傳遞信息，從而起到調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖的作用[15-16]。堿性磷酸酶是一種成骨細(xì)胞分化的特異性標(biāo)志物，可反映成骨細(xì)胞礦化功能。成骨細(xì)胞通過(guò)分泌鈣鹽結(jié)晶體和堿性磷酸酶到細(xì)胞外基質(zhì)中，高含量的堿性磷酸酶水平促進(jìn)基質(zhì)鈣化[17]。

綜上所述，葛根素可能通過(guò)誘導(dǎo)BMP-2表達(dá)促進(jìn)增殖，活化堿性磷酸酶活性促進(jìn)生物礦化。但這一作用呈劑量依賴性，高濃度葛根素可能對(duì)成骨細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，從而抑制其增殖。

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(2017-05-03收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄)

EffectsofPuerarinonOsteoblastProliferationandBoneMorphogeneticProtein

Lu Lihua,Yang Li,Xu Yurong

(DepartmentofSomatologyofHebeiEyeHospital,Xingtai054000，China)

Objective:To investigate the effect of puerarin on osteoblast proliferation and bone morphogenetic protein.Methods:The serum containing puerarin was prepared by serum pharmacological method,and divided into puerarin group,positive control group and negative control group.Osteoblasts were extracted from SD rat skull,and osteoblasts were cultured with corresponding serum.CCK-8 was used to detect osteoblast proliferation.The expression of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The activity of alkaline phosphatase was detected by micro-enzyme method.Results:The values of D in puerarin group were significantly higher than those of the negative control group at 24,48 and 72 hours (P<0.05),and were significantly lower than those in positive control group (P<0.05).With the increase of time,the D value of puerarin group and positive control group reached the highest at 48 h,and decreased after 72 h.The expression of BMP-2 in puerarin group was significantly higher than that of the negative control group (P<0.05),and was significantly lower than that in positive control group (P<0.05).The expression of BMP-2 in puerarin group was significantly higher than that of the negative control group (P<0.05),and was significantly lower than that of the positive control group (P<0.05).The activity of alkaline phosphatase in puerarin group was significantly higher than that of the negative control group (P<0.05),and significantly lower than that of the positive control group (P<0.05).Conclusion:Puerarin may promote the proliferation and activate alkaline phosphatase activity by promoting BMP-2 expression to promote biomineralization.

Osteoporosis; Puerarin; Osteoblasts; Proliferation; Bone morphogenetic protein 2

R284;R361

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.037

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(14277795D)

路立花(1970.09—)，女，本科，主治醫(yī)生，研究方向：口腔種植修復(fù)，E-mail：69371868@qq.com