趙素華，魏 磊

①

（1.宿州職業(yè)技術(shù)學院，安徽 宿州 234101；2.毫州學院 生物與化學工程系，安徽 亳州 236800；3.中國科學院 動物研究所動物生態(tài)和保護生物學院重點實驗室，國家野生動物疫病研究中心，北京 100101）

內(nèi)蒙古地區(qū)布氏田鼠種群MHCⅡ類基因第二外顯子的遺傳分析

趙素華1，魏 磊2,3

①

（1.宿州職業(yè)技術(shù)學院，安徽 宿州 234101；2.毫州學院 生物與化學工程系，安徽 亳州 236800；3.中國科學院 動物研究所動物生態(tài)和保護生物學院重點實驗室，國家野生動物疫病研究中心，北京 100101）

以MHCⅡ類基因第二外顯子（MHC classⅡ exon 2）為分子標記，用限制性酶切多態(tài)性和直接測序的方法對分布于內(nèi)蒙古地區(qū)的8個布氏田鼠種群共460個個體進行種群遺傳結(jié)構(gòu)的分析.結(jié)果顯示，酶切共檢測到6個等位基因，13個酶切多態(tài)性位點，卡方檢驗顯示，各種群在6個酶切多態(tài)性位點上基因型頻率不符合Har?dy-Weinberg平衡.序列分析顯示，在長度261 bp的核苷酸序列中，有57個變異位點，定義21種單倍型，其中有1個單倍型為不同區(qū)域種群所共享，其余20個單倍型均為各區(qū)域種群所特有.7個地理種群的單倍型多樣性和核苷酸多樣性較高，1個地理種群較低.譜系分析顯示，8個布氏田鼠地理種群分為3個進化分支，分別與采集的地理種群相吻合：同一地理種群內(nèi)單倍型之間遺傳差異小，而不同地理來源的單倍型之間存在較大區(qū)別. Mentel檢測表明，布氏田鼠的遺傳分化與地理距離呈現(xiàn)正相關(guān).AMOVA分析結(jié)果同樣表明地理種群之間存在差異：各區(qū)域類群間變異組分占總變異比率的60.48%，區(qū)域內(nèi)種群間變異組分占總變異比率的7.78%，種群內(nèi)個體間變異組分占總變異比率的28.14%；遺傳分化系數(shù)和基因流分析顯示，布氏田鼠種群出現(xiàn)一定程度的分化，但正鑲白旗種群與其他種群之間遺傳分化顯著.布氏田鼠的這種遺傳結(jié)構(gòu)特點可能是該物種穩(wěn)定的地下生活環(huán)境和有限的遷移造成的，且渾善達克沙漠形成布氏田鼠分化最強烈的隔離因素.

布氏田鼠；MHCⅡ類基因；遺傳分化

0 引言

內(nèi)蒙古地理環(huán)境復雜，獨特的地形、地貌和地質(zhì)歷史對物種結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大的影響.布氏田鼠（Lasiopodomys brandtii）是內(nèi)蒙古草原具有一定代表性的小型哺乳動物，具有擴散能力弱，對環(huán)境依賴性強的特點，因此是研究復雜環(huán)境對種群遺傳特性影響的典型物種代表.Wang等［1］基于微衛(wèi)星標記對內(nèi)蒙古4個布氏田鼠地理種群分析表明，棲息地的破碎化、沙漠化、環(huán)境隔離使種群間基因交流減少、存在近交繁殖現(xiàn)象，從而影響著布氏田鼠的種群遺傳結(jié)構(gòu).張曼等［2］采用微衛(wèi)星標記對連續(xù)三代布氏田鼠封閉群遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性進行分析，通過平均有效雜合度和多態(tài)信息含量測定，該布氏田鼠種群傳代過程中具有穩(wěn)定的雜合度.MHCⅡ類基因包括經(jīng)典DR、DQ和DP等亞區(qū)、非經(jīng)典DO、DM和DN等亞區(qū)，MHCⅡ類基因各經(jīng)典的亞區(qū)間包含有很大的差異，推測其原因是因為不同物種在進化中積累的特異性復制造成的［3］.本文嘗試以MHCⅡ類基因第二外顯子為分子標記，分析布氏田鼠種群的遺傳結(jié)構(gòu)特征，及遺傳距離與地理距離之間的關(guān)系，探討環(huán)境因素對物種進化的影響，具有重要的進化理論研究價值.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集來自于正鑲白旗（42°25.611′N，115°16.331′E；n=62）、二連浩特（43°53.245′N，112°23.564′E；n=65）、錫林浩特（44°50.351′N，115°13.673′E；n=68）、東烏珠穆沁旗（44°59.454′N，116°10.846′E；n=54）、西烏珠穆沁旗（44°5.211′N，117°57.324′E；n=53）、新巴爾虎右旗（48°21.625′N，118°22.573′E；n=50）、新巴爾虎左旗（49°18.152′N，118°03.776′E；n=56）、陳巴爾虎旗（49°32.652′N，119°44.735′E；n=52），共8個種群460只布氏田鼠，各采樣點之間的直線距離均在100 km以上.

1.2 DNA的提取

以Genbank序列（AJ003232，AF084934，U88933，M73960，BC132163，K0012，AJ634270）作為參考，設(shè)計一對引物，其中上游引物（MF）為5′-GGAATACGGTACATCTGAG-3′，下游引物（MR）為5′-CAACTCTCCGCCGCACAAGG-3′；PCR反應(yīng)體系與條件參照文獻［4］設(shè)置.

1.3 RsaⅠ酶切

按說明書提供的方法，用RsaⅠ（購自寶大連生物工程有限公司）酶切1.2提取的DNA，酶切產(chǎn)物用8%的EB瓊脂糖電泳，拍照并觀察結(jié)果.

1.4 數(shù)據(jù)分析

對各酶切片段進行基因型頻率統(tǒng)計，并作Hardy-Weinberg平衡的卡方適合性檢驗.運用分析軟件DNAstar 5.0中的Editseq、Seqman程序作基因片段拼接，再用ClustalW 1.83排序，然后運用MEGA4軟件分析序列特征，計算遺傳距離（p-distance），并借用UPGMA法構(gòu)建種群分化樹，參數(shù)均采用默認設(shè)置.運用GenAlEx計算地理距離與遺傳距離之間的相關(guān)性（Mantel tests），運用Arlequin 3.1工具計算單倍型多樣度（haplotype diversity，h）和核苷酸多樣度（nucleotide diversity，π）以及各種群間的遺傳分化指標（F-Statis?tics（FST）），并作分子變異分析（analysis of molecular variance，AMOVA）和P-value檢驗分析.

2 結(jié)果

2.1 MHCⅡ類基因第二外顯子酶切單倍型與等位基因型的頻率

在布氏田鼠8個地理種群MHCⅡ類基因第二外顯子的RsaⅠ酶切片段中共檢測到6個等位基因，13個多態(tài)位點，經(jīng)卡方檢驗，6個多態(tài)性位點上基因型頻率不符合Hardy-Weinberg平衡，X2值分別為49.68（P＜0.05）、56.31（P＜0.05）、66.04（P＜0.05）、59.95（P＜0.05）、50.52（P＜0.05）和48.15（P＜0.05）.其中，正鑲白旗地理種群純合子基因型頻率較高（0.064 5～0.112 9），雜合子基因型頻率較低（0.016 2～0.048 4）；其他地理種群純合子基因型頻率與雜合子基因型頻率基本一致（見表1）.

圖1 PCR產(chǎn)物RsaⅠ酶切8%瓊脂糖電泳檢測結(jié)果

表1 布氏田鼠種群MHCⅡ類基因第二外顯子基因型和基因型頻率

2.2 MHCⅡ類基因第二外顯子序列分析

8個地理種群460只布氏田鼠的MHCⅡ類基因第二外顯子的序列均為261 bp，共發(fā)現(xiàn)57個變異位點，定義21個單倍型，其中一個單倍型為8個種群共享（見圖2）.

圖2 布氏田鼠單倍型變異位點，兩端相同的序列被省略

2.3 聚類分析

用UPGMA法對8個布氏田鼠地理種群進行聚類分析，結(jié)果顯示，8個地理種群分為3個進化分支.把這3個進化單元劃分為A、B、C 3個區(qū)域（見圖3）.從圖3可以看出，8個地理種群分為3組，分別對應(yīng)A、B、C 3個區(qū)域（見圖3），正鑲白旗種群（ZB）與其他種群遺傳距離最遠，為單獨一組；XZ、XY、CB被分為一組；ER、XL、XW、DW為一組，其又分為兩個亞組，ER、XL為一亞組，XW、DW為一亞組.ER、XL、XW和DW聚為一類，與ZB之間遺傳距離較遠，但是與XZ、XY和CB有較近的遺傳距離.

圖38 個布氏田鼠種群的UPGMA聚類分析

2.4 布氏田鼠種群遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析

種群遺傳多樣性按系譜發(fā)育樹A、B、C 3個區(qū)域來分析.結(jié)果顯示，B區(qū)域種群單倍型多樣度π和核苷酸多樣度h最高，A區(qū)域種群次之，C區(qū)域種群最低（見表2）.內(nèi)蒙古地區(qū)布氏田鼠各種群間的遺傳多樣性差異較大，B區(qū)域的3個種群的遺傳多樣性最高，A區(qū)域的4個種群較高，C區(qū)域種群的遺傳多樣性最低.

表2 布氏田鼠遺傳多樣性

AMOVA分析結(jié)果表明，種群內(nèi)個體間變異組分占總變異比率的28.14%，區(qū)域內(nèi)種群間占總變異比率的7.78%，區(qū)域類群間占總變異比率的60.48%.說明種區(qū)域群間的遺傳多樣性變化較明顯，且核苷酸差異分析表明，C區(qū)域種群與其他區(qū)域種群之間存在顯著的遺傳差異.

區(qū)域種群間的遺傳分化指數(shù)FST值（對角線以下）（見表3）分析顯示，區(qū)域C的正鑲白旗種群與A、B區(qū)域種群的FST值最大，分別為0.823 2、0.834 7，其FSTP值均小于0.05的檢驗水平.各區(qū)域種群間的基因交流均很?。ň∮?），尤其是區(qū)域C種群與區(qū)域A、B種群的Nm值最低，分別為0.083 5和0.078 8.表明區(qū)域C種群具有明顯的遺傳分化，區(qū)域A和區(qū)域B種群間出現(xiàn)分化的趨勢.遺傳分化主要發(fā)生在區(qū)域類群之間.

同時，分析8個地理種群間的遺傳分化指數(shù)FST值和種群間的遺傳距離（見表4），結(jié)果顯示，布氏田鼠種群呈現(xiàn)一定程度的分化，分化程度較低，但正鑲白旗種群與其他種群間的遺傳距離（p-distance）最大，均達到19%以上，分化則較為明顯.與上述遺傳分化的結(jié)果基本一致.

表3 布氏田鼠區(qū)域種群的遺傳分化系數(shù)FST（上三角）和基因流Nm（下三角）

表4 布氏田鼠8個不同地理種群地理距離（上三角）和遺傳距離（下三角）

2.5 Mantal tests分析

運用Mantel檢驗分析，8個小種群的遺傳距離（GD）與地理距離（GGD）之間呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2=0.409 6，且P＜0.05的顯著水平（如圖4）.也就是說，布氏田鼠各種群間的地理距離愈大，遺傳距離也愈大.

圖4 Mantal tests分析結(jié)果

3 討論

3.1 布氏田鼠種群遺傳結(jié)構(gòu)

種群的遺傳結(jié)構(gòu)受突變、基因流、自然選擇和遺傳漂變的影響，或者是取決于種群單位間的擴散規(guī)模［5-7］，研究表明，諸多文獻地理隔離和天然地理屏障可引起種群分化［8-13］.本研究采集的8個布氏田鼠種群形成3個穩(wěn)定的分支，分別與采集的地理種群相吻合：同一地理種群內(nèi)單倍型之間遺傳差異小，而不同區(qū)域種群間的單倍型之間存在較大區(qū)別.根據(jù)AMOVA分析，布氏田鼠地理群體間的變異明顯大于群體內(nèi)的變異，該結(jié)果說明布氏田鼠存在一定的地理分化.遺傳距離、基因流和基因分化系數(shù)分析結(jié)果說明A和B區(qū)域類群間已呈現(xiàn)分化趨勢，而C區(qū)域的正鑲白旗種群與其他種群間的分化較明顯.導致種群分化可能有以下因素：首先，內(nèi)蒙古草原復雜多變的地貌形成的地理隔離在很大程度上影響布氏田鼠的遷徙，從而削弱種群間的基因交流.尤其是渾善達克沙地形成布氏田鼠的遷徙地理屏障，逐漸把C區(qū)域的種群與其他區(qū)域隔離開來，在長期的進化過程中產(chǎn)生遺傳分化，這是引起種群遺傳分化的地理因素.其次，布氏田鼠的分布和生存與區(qū)域氣候、植被、地理等因素有關(guān).內(nèi)蒙古自治區(qū)地形狹長，具有不同地理區(qū)劃內(nèi)的氣候、地形、植被條件［12］.棲息地片段化、草地退化和景觀變化是引起布氏田鼠種群遺傳分化的生態(tài)因素.再次，布氏田鼠是一種營聚集生活的小型哺乳動物，雖然分布區(qū)域廣，繁殖力強，但種群的擴散能力相對較弱，因此可能較易受到距離隔離的影響而限制種群間基因交流，這是產(chǎn)生遺傳分化的物種因素.

3.2 距離隔離對布氏田鼠種群遺傳結(jié)構(gòu)的影響

根據(jù)Wright距離隔離（isolation by distance）的理論，地理隔離是影響物種遺傳分化的重要因素之一，同時其分化的程度也隨著地理距離的增大而提高［15］.這一觀點已有諸多文獻證實［16-19］.距離隔離對種群遺傳分化影響隨物種改變而改變［20］.在種群間距離2～20 km的范圍內(nèi)，小型哺乳動物可發(fā)生明顯遺傳分化［21-22］.布氏田鼠廣泛分布在內(nèi)蒙古中東部，營地下挖掘生活方式，遷移距離小，種群的自由擴散受到限制.本文研究的3大區(qū)域類群之間的地理距離都在200 km以上，Mantel檢驗分析表明，地理距離與布氏田鼠種群遺傳分化呈正相關(guān)性，表明地理距離是影響布氏田鼠群間遺傳分化的因素之一.本文只對8個布氏田鼠種群進行分析，更大范圍種群遺傳關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)有待于進一步的研究.

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Genetic Analysis of Brandt′s Vole（Lasiopodomys Brandtii）Population Based on MHC ClassⅡexon 2 in Inner Mongolia

ZHAO Suhua1，WEI Lei2,3

（1.Suzhou Vocational and Technical College，234101，Suzhou，Anhui，China；
2.Department of Biological and Chemical Engineering,Bozhou University,236800,Bozhou,Anhui,China; 3.National Research Center for Wildlife Born Diseases，Key Laboratory of Animal Ecology and Conservation Biology，Institute of Zoology，Chinese Academy of Sciences，100101，Beijing，China）

The genetic diversity and genetic structure of 8 geo-populations of Lasiopodomys brandtii were ana?lyzed using PCR-RFLP and sequences analysis based on MHC classⅡexon 2.The Results showed that 6 al?leles and 13 polymorphic loci were detected.The Chi-square test results argued that genotype frequencies in 6 polymorphic loci were not consistent with the Hardy-Weinberg equilibrium.21 haplotypes were defined based on 57 bases mutations，and one haplotype was shared by all populations.Haplotype diversity（H）and nucleotide diversity（πn）of 7 of L.brandtii populations were higher and another was relatively lower.The UP?GMA phylogenetic tree showed that the 8 geo-populations clustered into three groups，corresponding well to their geographical distributions.Mantel test confirmed that genetic differentiation was positively correlated with the geographic distance.Analysis of molecularvariance（AMOVA）similarly recovered the distinct differ?entiation between geographical populations：regional genetic variation accounted for 60.48%，intraregional population variation accounted for 7.78%，and individual variation accounted for 28.14%.Analysis of gene flow and FSTsuggested that genetic differentiation already occurred among the 8 populations，but a high level was detected between the Zhengxiangbaiqi and other populations.The unique genetic structure of this spe?cies was probably the limited dispersal as well as the stable habitats of the subterranean living，and Hun Shan Da Ke Desert played the most important role in population differentiation of L.brandtii.

Lasiopodomys brandtii；MHC classⅡgene；genetic structure

Q 959.837

A

2095-0691（2017）03-0030-07

2017-05-10

安徽省教育廳自然科學研究基金重點項目（KJ2014A253）

趙素華（1966- ），女，安徽蕭縣人，副教授，博士生，研究方向：動物防疫與免疫.通信作者：魏 磊（1971- ），男，河南永城人，教授，博士，研究方向：系統(tǒng)進化，種群地理學.