陳冉冉，朱娉慧，賈博為，宋雪薇，王子君，李佶娜，李強(qiáng)，丁曉東，朱延明

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

堿脅迫應(yīng)答基因GsARHP的克隆及轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的耐堿性分析

陳冉冉**，朱娉慧**，賈博為，宋雪薇，王子君，李佶娜，李強(qiáng)，丁曉東，朱延明*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

本研究基于實(shí)驗(yàn)室前期野生大豆堿脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出一個(gè)堿脅迫下上調(diào)表達(dá)的假定蛋白基因，暫命名為GsARHP(alkali stress related hypothetical protein gene)。首先利用Real-time PCR方法驗(yàn)證了GsARHP基因受堿脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼一個(gè)含有130個(gè)氨基酸的親水蛋白，含有信號(hào)肽但無跨膜結(jié)構(gòu)域；構(gòu)建了GsARHP植物超量表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)侵染法轉(zhuǎn)化肇東紫花苜蓿，通過PCR，Southern Blot和RT-PCR方法檢測(cè)獲得了3個(gè)超量表達(dá)GsARHP基因的轉(zhuǎn)基因株系，并對(duì)其耐堿性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在0，100和150 mmol/L NaHCO3處理14 d后，非轉(zhuǎn)基因株系明顯萎蔫、黃化甚至死亡，而轉(zhuǎn)基因株系則長(zhǎng)勢(shì)良好；進(jìn)一步分析其生理指標(biāo)顯示，相對(duì)質(zhì)膜透性與丙二醛含量均顯著低于非轉(zhuǎn)基因株系(P<0.01)，而葉綠素含量與CAT活性顯著高于非轉(zhuǎn)基因株系(P<0.01)，說明GsARHP基因的超量表達(dá)可以增強(qiáng)紫花苜蓿的耐堿能力。

野生大豆；GsARHP基因；堿脅迫；紫花苜蓿；遺傳轉(zhuǎn)化

目前，世界各地主要的農(nóng)作物減產(chǎn)是由非生物脅迫造成的[1]。植物長(zhǎng)期處于不良環(huán)境中，會(huì)使植物體內(nèi)產(chǎn)生相關(guān)生理代謝反應(yīng)，致使植物機(jī)體產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)斐刹豢赡娴膿p傷，導(dǎo)致整個(gè)植株死亡[2]。其中，鹽堿脅迫是影響植物生長(zhǎng)最主要的環(huán)境因素之一，大面積的鹽堿化土地嚴(yán)重限制了農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的恢復(fù)，制約著全世界作物產(chǎn)量[3]。鹽堿對(duì)土壤的危害是由于土壤中對(duì)作物有害的陰、陽離子富集所致，如CO32-、HCO3-、Cl-等陰離子和Na+、Ca2+等陽離子[4]。土壤內(nèi)積累大量鹽分會(huì)引起土壤肥力降低，有機(jī)質(zhì)含量減少，理化性狀改變等現(xiàn)象，研究表明土壤鹽分的積累，會(huì)擾亂植物體內(nèi)離子平衡，破壞植物正常的新陳代謝機(jī)能，阻礙蛋白質(zhì)的合成與水解，引起可溶性鹽離子在體內(nèi)的積聚，從而產(chǎn)生離子毒害，危及植物的生長(zhǎng)發(fā)育[5]，導(dǎo)致植物代謝受阻，生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，進(jìn)一步萎蔫甚至死亡[6]。合理開發(fā)利用鹽堿化土地成為推動(dòng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展、改善生態(tài)環(huán)境的重要任務(wù)之一[2-7]。目前，關(guān)于鹽堿脅迫，研究較集中在中性鹽(NaCl)對(duì)植物的危害[8-13]，但是，堿土除了具有中性鹽的脅迫特征外，還具有高pH特征，堿土高度離散，濕時(shí)膨脹，干時(shí)板結(jié)，通透性很差，嚴(yán)重妨礙作物的生長(zhǎng)發(fā)育，比中性鹽的危害更嚴(yán)重，因此對(duì)堿性鹽的研究更具有現(xiàn)實(shí)意義。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是一種世界性廣泛種植的優(yōu)良牧草，富含蛋白質(zhì)、多種維生素和礦物質(zhì)，是營(yíng)養(yǎng)豐富的飼料植物[14]。紫花苜蓿具有較強(qiáng)的抗逆性，擁有抗寒、耐旱、耐鹽堿等特性[1]，是改良和開發(fā)鹽堿地的重要作物之一。牧草作物一般具有發(fā)達(dá)的根系，在鹽堿化土地上種植可以使土壤惡化的理化性質(zhì)逐漸得到改善，減輕鹽堿化土地對(duì)植物的危害，可以在培育牧草的過程中達(dá)到改善鹽堿土地的目的[14-16]。但紫花苜蓿有限的耐堿能力[17]，限制了它的栽種范圍，所以亟需對(duì)其耐堿性狀進(jìn)行改良，培育耐堿性強(qiáng)的紫花苜蓿新品種，增強(qiáng)其在鹽堿地區(qū)的生長(zhǎng)能力，擴(kuò)大種植范圍，以期充分開發(fā)利用鹽堿化土地資源。采用傳統(tǒng)的育種方法，培育耐鹽堿新品種進(jìn)展緩慢耗時(shí)耗力。目前，利用基因工程技術(shù)向植物導(dǎo)入抗逆相關(guān)的目的基因，提高植物的耐鹽堿性，已成為提高農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)，培育抗逆新品種的重要途徑。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)東北野生大豆(Glycinesoja)Gs07256轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，堿脅迫下對(duì)照組與不同時(shí)間點(diǎn)處理組的表達(dá)差異，從野生大豆根中篩選出3380個(gè)堿脅迫應(yīng)答基因[18]，在分析野生大豆鹽堿脅迫應(yīng)答的差異表達(dá)基因時(shí)，篩選出一個(gè)堿脅迫后上調(diào)表達(dá)的假定蛋白基因GsARHP，假定蛋白是指因功能未知而未被鑒定的新基因編碼的蛋白[19]，其在堿脅迫基因表達(dá)圖譜中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)[18]，因此推測(cè)GsARHP很可能也參與了植物對(duì)堿脅迫的響應(yīng)。

為確定該基因在堿脅迫應(yīng)答中的作用，本研究以紫花苜蓿為受體材料，構(gòu)建由強(qiáng)組成型啟動(dòng)子CaMV35S調(diào)控的超量表達(dá)GsARHP基因的植物表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌EHA105對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過PCR，Southern Blot，RT-PCR的方法鑒定轉(zhuǎn)基因植株。分析轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)發(fā)育狀況和耐堿能力，初步確定該假定蛋白基因在堿脅迫應(yīng)答中的功能。本研究為進(jìn)一步研究假定蛋白基因GsARHP在堿脅迫應(yīng)答調(diào)控中的作用機(jī)制奠定了重要的理論基礎(chǔ)，對(duì)于建立紫花苜蓿分子育種技術(shù)體系，培育耐堿功能顯著的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿新株系，充分利用并改良我國(guó)鹽堿地資源，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和廣闊的開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

野生大豆(Gs07256)，采自吉林省白城市鹽堿地。大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105菌株與植物表達(dá)載體pCAMBIA330035Su均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；轉(zhuǎn)化受體為肇東紫花苜蓿，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所提供。

1.2GsARHP基因的克隆與表達(dá)模式分析

根據(jù)野生大豆與大豆的高度同源性，利用同源克隆技術(shù)，根據(jù)GsARHP在栽培大豆中的同源基因(Glyma17g07720)序列設(shè)計(jì)特異的PCR引物(GsARHP-S:5′-ATGGCCGCTACTATGAAG-3′；GsARHP-AS:5′-TTACTTTCCATTACCACCG-3′)，以野生大豆cDNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因的完整CDS區(qū)。

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的3周齡的野生大豆幼苗，置于50 mmol/L NaHCO3條件下處理0，1，3，6，12，24 h后迅速剪取根尖部分，提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以野生大豆GAPDH基因作為內(nèi)參，結(jié)合基因特異性引物進(jìn)行Real-time PCR，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)以及3次技術(shù)重復(fù)，分析目的基因在堿脅迫處理下的表達(dá)模式。

1.3GsARHP基因生物信息學(xué)分析

通過ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)查找序列的開放閱讀框，最終確定基因GsARHP完整的全長(zhǎng)序列。通過TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)親疏水性與蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域；經(jīng)SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)基因產(chǎn)物信號(hào)肽；TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位；分析蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)。利用GOR4(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，MotifScan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)軟件尋找蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域；確定該假定蛋白基本特性。

1.4植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的培育

采用基于USERTM克隆技術(shù)的pCAMBIA330035Su載體作為植物超量表達(dá)載體。根據(jù)GsARHP基因序列設(shè)計(jì)的基因特異PCR擴(kuò)增引物，在其上游引物中添加GGCTTAAU接頭，在下游引物中添加GGTTTAAU接頭。采用PfuTurbo Cx Hotstart DNA polymerase，PCR擴(kuò)增GsARHP基因[20-21]。構(gòu)建由煙草花葉病毒CaMV35S強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控，Bar基因作為篩選標(biāo)記基因的高水平組成型植物表達(dá)載體。利用凍融法將植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，用于紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化。

采用農(nóng)桿菌侵染子葉節(jié)的方法進(jìn)行紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化[22]。種子經(jīng)滅菌萌發(fā)后，將培養(yǎng)8 d的無菌苗從子葉節(jié)下部約1 mm膨大處剪取子葉節(jié)，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后，接種于含有100 μmol/L乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3～5 d，除菌后，將外植體接種到添加草甘膦(0.5 mg/L)的固體篩選培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，當(dāng)抗性芽約2 cm長(zhǎng)以后，進(jìn)行生根處理并將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，2周左右生根，馴化2～3 d后移栽。獲得抗性再生植株。

1.5再生植株的分子生物學(xué)檢測(cè)

再生植株的分子生物學(xué)檢測(cè)分為基因水平的PCR檢測(cè)，Southern Blot檢測(cè)和轉(zhuǎn)錄水平的RT-PCR檢測(cè)。提取抗性植株的總DNA，利用篩選標(biāo)記基因Bar基因的特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽性對(duì)照為含有目的基因的重組質(zhì)粒DNA，陰性對(duì)照為未轉(zhuǎn)基因植株的總DNA，初步確定目的基因已整合入再生植株的基因組中。對(duì)PCR陽性的再生植株進(jìn)行Southern Blot檢測(cè)，制備基因特異性探針，確定目的基因的整合及基因拷貝數(shù)。為檢測(cè)已整合的目的基因在再生植株中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，對(duì)Southern Blot陽性植株進(jìn)行RT-PCR半定量檢測(cè)，選取Southern Blot陽性轉(zhuǎn)基因植株，紫花苜蓿GAPDH基因作為內(nèi)參基因(GeneBank登錄號(hào)為MTR_4G131180)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析。

1.6堿脅迫下轉(zhuǎn)基因植株生理指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)于2016年8—10月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站溫室內(nèi)進(jìn)行，設(shè)置3次重復(fù)。

由于紫花苜蓿異花授粉和生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，利用有性生殖進(jìn)行擴(kuò)繁存在耗時(shí)及不穩(wěn)定等問題。因此，本研究采用扦插擴(kuò)繁的方式來獲得扦插苗，選取轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)化程度較高且均勻一致的莖段進(jìn)行扦插擴(kuò)繁，剪取帶有2～3個(gè)生長(zhǎng)節(jié)點(diǎn)的莖段，采用生根粉浸泡2 h處理，待莖段生根后，移栽到含有蛭石∶珍珠巖=1∶1的小缽(直徑5 cm，高6 cm，每缽1株)中，1000 lx光照，16 h/8 h的光照/黑暗周期，26 ℃/18 ℃晝夜溫度的條件下培養(yǎng)4周后，挑選生長(zhǎng)狀態(tài)一致的轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)基因的扦插苗，分別用含有0，100和150 mmol/L NaHCO3的1/8 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理，營(yíng)養(yǎng)液每2 d更換一次，期間觀察記錄表型，14 d后取出植株，洗凈珍珠巖，利用刻度尺測(cè)量植株根長(zhǎng)與株高。

采用80%丙酮研磨提取葉綠素，比色法[23]檢測(cè)葉綠素含量，采用電導(dǎo)法[24-25]檢測(cè)相對(duì)質(zhì)膜透性。利用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[23]測(cè)定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量，采用過氧化氫法[26]檢測(cè)過氧化氫酶(catalase,CAT)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1GsARHP基因的篩選與克隆

2.1.1基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的GsARHP篩選 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)東北野生大豆Gs07256轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，從中選取在NaHCO3脅迫處理下根中表達(dá)量顯著上調(diào)的基因GsARHP，結(jié)果見圖1A。從圖中可以看出，GsARHP在根中脅迫處理6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高值。采用Real-time PCR方法分析堿脅迫處理下不同時(shí)間點(diǎn)GsARHP基因在野生大豆中轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量的變化(圖1B)，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，在50 mmol/L NaHCO3脅迫處理下，GsARHP基因根中的表達(dá)量在12 h達(dá)到峰值。

圖1 堿脅迫下GsARHP基因表達(dá)特性分析Fig.1 GsARHP gene expression characteristics analysis under alkali stress A: GsARHP基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果RNA-seq result of GsARHP； B:GsARHP 基因Real-time PCR結(jié)果Real-time PCR result of GsARHP.

與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果比較來看，雖然GsARHP基因

圖2 GsARHP基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of GsARHP gene

對(duì)脅迫響應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)有所推后，但變化趨勢(shì)仍然基本一致。確定該基因?yàn)閴A脅迫應(yīng)答候選基因。

2.1.2GsARHP基因的克隆 提取野生大豆總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板，利用目的基因特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如圖2所示，克隆得到長(zhǎng)約390 bp的DNA條帶(圖2)。將回收得到的PCR產(chǎn)物連接到載體pCAMBIA330035Su上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，采用PCR技術(shù)鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，將陽性克隆送交測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明序列正確，成功的克隆得到GsARHP基因。

2.2GsARHP基因生物信息學(xué)分析

2.2.1GsARHP基因序列分析 對(duì)GsARHP基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行序列分析，根據(jù)Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)上提供全序列分析GsARHP基因全長(zhǎng)cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列，如圖3所示，該基因全長(zhǎng)為846 bp，包含127 bp 5′端非編碼區(qū)序列(5′-UTR)與326 bp 3′端非編碼區(qū)序列(3′-UTR)，將測(cè)序所得到的序列在NCBI“ORF finder”預(yù)測(cè)開放閱讀框(ORF)，預(yù)測(cè)最長(zhǎng)ORF為393 bp，編碼130個(gè)氨基酸，與預(yù)期結(jié)果一致。因此，根據(jù)以上結(jié)果，認(rèn)為此克隆序列已包含目的基因GsARHP的完整ORF?？梢杂糜谙乱徊綄?shí)驗(yàn)。

圖3 假定蛋白基因GsARHP全長(zhǎng)cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 Full-length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of GsARHP

2.2.2GsARHP蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 采用ProtParam軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)。假定蛋白基因共編碼130個(gè)氨基酸，其中，甘氨酸的含量最高(29.2%)，其次為絲氨酸(23.1%)、丙氨酸(14.6%)和亮氨酸(6.2%)。分子質(zhì)量11.428 kD，等電點(diǎn)7.91，不穩(wěn)定指數(shù)32.13，表明GsARHP為一個(gè)穩(wěn)定蛋白。通過Protscale軟件預(yù)測(cè)氨基酸的親水性和疏水性，利用Hphob./Kyte&Doolittle算法得到如圖4所示結(jié)果：該蛋白親水性氨基酸均勻分布在整個(gè)肽鏈中且多于疏水性氨基酸。證明該基因編碼蛋白是一種親水性蛋白。

經(jīng)GOR4預(yù)測(cè)，GsARHP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由如下3個(gè)部分組成：無規(guī)卷曲共89個(gè)氨基酸，占68.46%，延伸片段共23個(gè)氨基酸，占17.69%，α螺旋共18個(gè)氨基酸，占13.85%。用TMHMM 2.0預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)，表明該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，用SignalIP 4.1預(yù)測(cè)信號(hào)肽及可能的切割位點(diǎn)，表明該多肽鏈含有信號(hào)肽，多肽鏈上信號(hào)肽的切割位點(diǎn)可能是第19～20位氨基酸殘基。經(jīng)TargetP預(yù)測(cè)，該蛋白可能是經(jīng)分泌通路信號(hào)肽引導(dǎo)的胞外蛋白；用MotifScan軟件尋找蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，未發(fā)現(xiàn)功能結(jié)構(gòu)域。

2.3GsARHP基因?qū)ψ匣ㄜ俎５倪z傳轉(zhuǎn)化

2.3.1植物表達(dá)載體構(gòu)建 植物表達(dá)載體構(gòu)建如圖5，將送交測(cè)序并確定構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒采用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定，與陽性重組質(zhì)粒相比，均擴(kuò)增出約390 bp的片段，表明攜帶該目的基因的重組質(zhì)粒已成功導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中，可用于下一步的農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染子葉節(jié)法轉(zhuǎn)化紫花苜蓿。

2.3.2GsARHP基因?qū)ψ匣ㄜ俎５倪z傳轉(zhuǎn)化 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)侵染方法對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化(圖6)。經(jīng)過無菌苗培育、子葉節(jié)預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、不定芽誘導(dǎo)分化、伸長(zhǎng)及草甘膦篩選培養(yǎng)(0.5 mg/L)、生根培養(yǎng)等組織培養(yǎng)階段，最終獲得抗性植株。共得到了37株抗性植株。

2.4轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的分子生物學(xué)檢測(cè)

2.4.1PCR檢測(cè)與Southern Blot檢測(cè) 利用篩選標(biāo)記基因Bar基因引物對(duì)抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，部分PCR鑒定結(jié)果如圖7所示，轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增出約450 bp片段，與陽性對(duì)照一致，篩選得到14株P(guān)CR陽性植株，初步證明目的基因已整合到紫花苜?；蚪M中。對(duì)14株P(guān)CR陽性植株進(jìn)行Southern Blot鑒定(圖8)，結(jié)果顯示共獲得3株Southern Blot陽性植株，其中#2為3個(gè)拷貝，#12為1個(gè)拷貝，#21為2個(gè)拷貝(圖8)。證明目的基因已成功整合到紫花苜?；蚪M中。

圖4 GsARHP蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of GsARHP protein structure A:GsARHP蛋白疏水性、親水性分析Hydrophilicity, hydrophobicity analyze of GsARHP;B:GsARHP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) Secondary structure of prediction of GsARHP.

圖5 GsARHP植物超量表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.5 Construction of GsARHP plant over expression vector LB:左界 Left border;TNOS:T-DNA復(fù)制原點(diǎn) Ori of T-DNA;Bar:篩選標(biāo)記基因 Selectable marker gene;PNOS:啟動(dòng)子復(fù)制原點(diǎn)Ori of promoter;P35S:35S強(qiáng)啟動(dòng)子35S promoter;RB：右邊界 Right border.

圖6 紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生Fig.6 Genetic transformation and plant regeneration of alfalfa A：8日齡無菌苗Germination 8 days of aseptic seedling;B：農(nóng)桿菌侵染子葉節(jié)Infection;C：共培養(yǎng)Co-cultivation;D：不定芽誘導(dǎo)Adventitious bud induction;E：抗性芽伸長(zhǎng)Resistant shoot elongation;F：抗性苗生根馴化Root plantlets and domestication.

2.4.2RT-PCR檢測(cè) 為確定轉(zhuǎn)基因植株在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，對(duì)篩選得到的3株Southern Blot陽性植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析。半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示(圖9)，3株Southern Blot陽性植株在轉(zhuǎn)錄水平均可正常表達(dá)。

圖7 轉(zhuǎn)GsARHP基因抗性植株P(guān)CR檢測(cè) Fig.7 The PCR identification of resistant plants with GsARHP M：DL 15000；+：陽性對(duì)照Positive control；-：水對(duì)照Water control；CK：非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誄ontrol check；1～30：轉(zhuǎn)GsARHP基因抗性植株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR amplification products of transgenic plants with GsARHP gene.

圖8 轉(zhuǎn)基因植株的Southern Blot鑒定Fig.8 Southern Blot identification of the transgenic alfalfa

圖9 轉(zhuǎn)基因植株的半定量RT-PCR鑒定Fig.9 Semi-RT PCR of transgenic resistant plants with GsARHP

2.5轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿堿脅迫生物學(xué)分析

圖10 轉(zhuǎn)GsARHP基因紫花苜蓿堿脅迫表型分析Fig.10 Alkali stress phenotype analysis of GsARHP transgenic alfalfa

2.5.1堿脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的表型分析 堿脅迫會(huì)導(dǎo)致植物產(chǎn)生一系列生理響應(yīng)，抑制其各器官及組織的生長(zhǎng)，從而抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)植物造成傷害。為研究堿脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿生長(zhǎng)發(fā)育的影響，本研究選取Southern Blot檢測(cè)呈陽性的2個(gè)轉(zhuǎn)基因植株#2和#21及未轉(zhuǎn)基因(CK)紫花苜蓿進(jìn)行扦插擴(kuò)繁，獲得扦插苗后，以100和150 mmol/L NaHCO3作為脅迫濃度，模擬堿脅迫條件，對(duì)轉(zhuǎn)基因與未轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行耐堿性分析。結(jié)果顯示在正常未處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)GsARHP基因紫花苜蓿與非轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的長(zhǎng)勢(shì)良好，無明顯差異(圖10)。在經(jīng)150 mmol/L NaHCO3處理14 d后，與明顯發(fā)生萎蔫、黃化的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗迪啾?，轉(zhuǎn)基因株系#2和#21生長(zhǎng)良好且能維持正常的生物學(xué)形態(tài)(圖10)。對(duì)轉(zhuǎn)基因與未轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)發(fā)育情況進(jìn)行分析得知，隨著堿脅迫處理濃度的增加，所有株系的株高與根長(zhǎng)均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)；經(jīng)統(tǒng)計(jì)，在150 mmol/L NaHCO3處理?xiàng)l件下，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的株高和根長(zhǎng)均顯著高于非轉(zhuǎn)基因株系(P<0.01)(圖11)。由此可以說明與非轉(zhuǎn)基因株系相比，轉(zhuǎn)GsARHP基因紫花苜蓿在堿脅迫下能更好地維持生長(zhǎng)發(fā)育，抵御堿脅迫造成的危害。

2.5.2堿脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的生理指標(biāo)檢測(cè) 通過檢測(cè)轉(zhuǎn)基因與對(duì)照非轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量，如圖12A所示，發(fā)現(xiàn)隨著NaHCO3脅迫處理濃度的增加，轉(zhuǎn)GsARHP基因紫花苜蓿株系和對(duì)照株系的葉綠素含量均呈現(xiàn)出不同程度的降低趨勢(shì)，但在相同濃度的NaHCO3脅迫處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量高于對(duì)照株系，尤其在150 mmol/L NaHCO3脅迫處理?xiàng)l件下，與對(duì)照株系相比，轉(zhuǎn)基因株系#21的葉綠素含量顯著升高(P<0.01)(圖12A)，顯然轉(zhuǎn)GsARHP基因紫花苜蓿株系在堿脅迫條件下能更好維持葉綠體的穩(wěn)定性，從而維持植株正常的生長(zhǎng)發(fā)育。

圖11 堿脅迫對(duì)紫花苜蓿株高和根長(zhǎng)的分析Fig.11 Shoot and root length analysis of transgenic alfalfa with GsARHP under alkali stress 圖柱上方不同大寫字母表示在 P<0.01水平上差異顯著。下同。Bars with different capital letters are significant differences at P<0.01.The same below.

圖12 堿脅迫下轉(zhuǎn)GsARHP基因紫花苜蓿生理指標(biāo)檢測(cè)Fig.12 Physiological indices analysis of transgenic alfalfa with GsARHP under alkali stress

通過檢測(cè)轉(zhuǎn)基因與未轉(zhuǎn)基因株系MDA含量(圖12B)發(fā)現(xiàn)，隨NaHCO3脅迫處理濃度的增加，2個(gè)轉(zhuǎn)GsARHP基因紫花苜蓿株系的MDA含量略有上升，但由數(shù)據(jù)分析可知，非轉(zhuǎn)基因株系MDA含量顯著高于轉(zhuǎn)基因株系(P<0.01)，從而說明超量表達(dá)GsARHP基因能降低NaHCO3脅迫對(duì)細(xì)胞膜造成的脂質(zhì)過氧化傷害，保持細(xì)胞膜正常生理功能。

檢測(cè)轉(zhuǎn)基因與對(duì)照非轉(zhuǎn)基因株系的相對(duì)質(zhì)膜透性，由圖12C所示，在NaHCO3脅迫處理下，相對(duì)質(zhì)膜透性在轉(zhuǎn)GsARHP基因植株和對(duì)照植株中均有升高，但2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)質(zhì)膜透性的增幅均顯著低于對(duì)照株系(P<0.01)，說明在NaHCO3脅迫處理?xiàng)l件下，超量表達(dá)GsARHP基因可降低堿脅迫對(duì)細(xì)胞膜的損傷，維持細(xì)胞膜完整性從而提升耐堿能力。

CAT活性的測(cè)定如圖12D所示，在NaHCO3脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株的CAT活性均提高，而在2個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中CAT活性顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(P<0.01)，由此可見，GsARHP基因超量表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)自由基清除能力，從而降低了堿脅迫下自由基的積累，減少了自由基對(duì)植株核酸、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞膜的傷害。

3 討論

鹽堿脅迫嚴(yán)重制約著作物的生長(zhǎng)發(fā)育，影響其產(chǎn)量及質(zhì)量，Webb[27]首次由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿轉(zhuǎn)化獲得成功之后，在以后的十多年時(shí)間里，紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因取得了很大的進(jìn)展[28]，Winicov等[29]將ALfinl基因轉(zhuǎn)入苜蓿中提高了鹽誘導(dǎo)基因MsPRP2的表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性，Liu等[30]將ScNHX1基因和ScVP基因(液泡無機(jī)焦磷酸酶)轉(zhuǎn)入苜蓿，得到了具有很強(qiáng)耐鹽堿性的轉(zhuǎn)基因苜蓿。Wang等[31]將GsGST14在紫花苜蓿中超量表達(dá)，提升了轉(zhuǎn)基因植株中GST的酶活力，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)堿的抗性。盛慧等[32]將抗?jié)B透脅迫信號(hào)傳導(dǎo)過程中的關(guān)鍵基因DREB2A通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了大量轉(zhuǎn)基因植株。目前，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)向苜蓿中導(dǎo)入具有優(yōu)良性狀的目的基因來提升轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽堿性狀，已成為改良農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)的重要途徑[33]。本研究選用從野生大豆中篩選出的堿脅迫應(yīng)答候選基因GsARHP，轉(zhuǎn)化肇東紫花苜蓿，期望提高轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的耐堿能力。

野生大豆生長(zhǎng)在極其惡劣的生態(tài)環(huán)境中，具有耐鹽堿，抗寒，抗病等優(yōu)良特性，含有豐富的耐逆基因，是我國(guó)珍貴的種質(zhì)資源，本研究從野生大豆堿脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選得到一個(gè)堿脅迫下上調(diào)表達(dá)的假定蛋白基因GsARHP，假定蛋白是經(jīng)測(cè)序翻譯后得到的功能未知的蛋白，推測(cè)可能與野生大豆抗鹽堿的生理活動(dòng)有關(guān)，因此對(duì)該蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該多肽鏈不具備跨膜結(jié)構(gòu)域，但含有信號(hào)肽，可能是經(jīng)分泌通路信號(hào)肽引導(dǎo)的胞外親水蛋白，為穩(wěn)定蛋白；但是并未發(fā)現(xiàn)該蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。為該基因的分子機(jī)制研究奠定了重要的理論基礎(chǔ)。進(jìn)一步在肇東紫花苜蓿中超量表達(dá)GsARHP，驗(yàn)證了該基因在植物堿脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的功能。在37株再生植株中經(jīng)檢測(cè)得到了3株GsARHP基因在轉(zhuǎn)錄水平超量表達(dá)的植株。

在對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)方面，PCR檢測(cè)法是現(xiàn)在使用最普遍也是最簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法[34]，研究表明，利用常規(guī)PCR法檢測(cè)重組載體上標(biāo)記基因如GUS基因[35]，35S啟動(dòng)子[36]等部分片段，最終證明整合了GUS基因，35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植株中可能不含有目的基因片段[37-38]，這可能與外源基因的整合機(jī)制相關(guān)，如染色體的重組、異位等現(xiàn)象的發(fā)生致使目的基因片段的丟失[39-40]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一說法；本研究采取Southern Blot方法設(shè)計(jì)可與目的基因特異性結(jié)合的特異性探針，保證了轉(zhuǎn)基因陽性植株的正確篩選，同時(shí)對(duì)整合目的基因的陽性植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，確定已整合的目的基因在轉(zhuǎn)錄水平上成功表達(dá)可用于進(jìn)一步基因功能驗(yàn)證。

堿脅迫條件下，植物會(huì)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生并積累大量的活性氧，破壞了植物體內(nèi)活性氧代謝平衡，從而對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子產(chǎn)生不利影響；導(dǎo)致光合作用相關(guān)元件損傷，影響植物光合作用，從而導(dǎo)致植物失綠甚至死亡；致使膜系統(tǒng)發(fā)生過氧化現(xiàn)象，改變質(zhì)膜透性，產(chǎn)生丙二醛(MDA)，但植物本身存在的活性氧清除保護(hù)機(jī)制可在一定程度上清除活性氧自由基，維持細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝平衡。以上生理指標(biāo)均可用來指示植物在堿脅迫下受到的損傷情況[41-42]。本研究結(jié)果表明GsARHP基因超量表達(dá)的紫花苜蓿，在堿脅迫條件下，能夠保持葉綠素含量，維持光合作用積累有機(jī)物來保證植株正常的生長(zhǎng)發(fā)育；維持細(xì)胞膜的選擇透過性等生理活性，減少丙二醛等有害物質(zhì)的產(chǎn)生，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿對(duì)活性氧自由基的清除能力，保護(hù)細(xì)胞避免因H2O2累積而產(chǎn)生傷害，從而維持了堿脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的氧化還原平衡。說明GsARHP基因的超量表達(dá)可以提高紫花苜蓿的耐堿能力，具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究為深入研究GsARHP基因的功能和培養(yǎng)紫花苜蓿耐鹽堿新品種奠定了基礎(chǔ)。

References：

[1] Qi Z Q, Yu Y X, Hu Y G,etal. Current status and future tasks of theMedicagosativaindustry in China. Acta Prataculturae Sinica, 2008, 17(1): 107-113. 戚志強(qiáng), 玉永雄, 胡躍高, 等. 當(dāng)前我國(guó)苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的形勢(shì)與任務(wù). 草業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 17(1): 107-113.

[2] Hua Y, Cai H, Bai X,etal. Research progress on plant salt stress tolerance genetic engineering. Journal of Northeast Agricultural University, 2010, 41(10): 150-156. 化燁, 才華, 柏錫, 等. 植物耐鹽基因工程研究進(jìn)展. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 41(10): 150-156.

[3] Peng J Q, Liu Y Q, Yang Y F,etal. Importance and technology progress in containing the soil salinization and desertification. Tianjin Agricultural Sciences, 2008, 14(4): 26-29. 彭津琴, 劉永強(qiáng), 楊玉芳, 等. 遏制土壤鹽堿化、荒漠化的必要性及技術(shù)進(jìn)展. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 14(4): 26-29.

[4] Tian C X, Zhang Y M, Wang K,etal. The anatomical structure responses in alfalfa to salinity-alkalinity stress of NaHCO3. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(5): 133-142. 田晨霞, 張?jiān)伱? 王凱, 等. 紫花苜蓿組織解剖結(jié)構(gòu)對(duì)NaHCO3鹽堿脅迫的響應(yīng). 草業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 23(5): 133-142.

[5] Hasegawa P M, Bressan R A, Zhu J K,etal. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Plant Biology, 2000, 51(51): 463-499.

[6] Yang X Y, Yang J S, Liu G M,etal. Changes in soil fertilities and crop growth after transferring paddy soil to upland soil. Chinese Journal of Soil Science, 2006, 37(4): 675-679. 楊曉英, 楊勁松, 劉廣明, 等. 鹽堿地稻田旱作后土壤肥力變化及其對(duì)作物生長(zhǎng)的影響. 土壤通報(bào), 2006, 37(4): 675-679.

[7] Li H W, Ma D M, Xu X,etal. Advance and prospects on salt-tolerant transgenic alfalfa. Northern Horticulture, 2012, (19): 184-188. 李會(huì)文, 麻冬梅, 許興, 等. 苜蓿耐鹽堿轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展與展望. 北方園藝, 2012, (19): 184-188.

[8] Das-Chatterjee A, Goswami L, Maitra S,etal. Introgression of a novel salt-tolerant L-myo-inositol 1-phosphate synthase fromPorteresiacoarctata(Roxb.) Tateoka (PcINO1) confers salt tolerance to evolutionary diverse organisms. FEBS Letters, 2006, 580(16): 3980-3988.

[9] Jing Y X, Yuan Q H. Effects of salt stress on seedling growth of alfalfa (Medicagosativa) and ion distribution in different alfalfa organs. Acta Prataculturae Sinica, 2011, 20(2): 134-139. 景艷霞, 袁慶華. NaCl脅迫對(duì)苜蓿幼苗生長(zhǎng)及不同器官中鹽離子分布的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 20(2): 134-139.

[10] Jin T, Chang Q, Li W,etal. Stress-inducible expression of GmDREB1 conferred salt tolerance in transgenic alfalfa. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 2010, 100(2): 219-227.

[11] Liu J, Cai H, Liu Y,etal. A study on physiological characteristics and comparison of salt tolerance of twoMedicagosativaat the seedling stage. Acta Prataculturae Sinica, 2013, 22(2): 250-256. 劉晶, 才華, 劉瑩, 等. 兩種紫花苜蓿苗期耐鹽生理特性的初步研究及其耐鹽性比較. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 22(2): 250-256.

[12] Zhang L Q, Zhang F Y, Hasi Agula. Research progress on alfalfa salt tolerance. Acta Prataculturae Sinica, 2012, 21(6): 296-305. 張立全, 張鳳英, 哈斯阿古拉. 紫花苜蓿耐鹽性研究進(jìn)展. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 21(6): 296-305.

[13] Jiang J, Yang B L, Xia T,etal. Genetic diversity analysis of salt tolerant germplasm resources of alfalfa. Acta Prataculturae Sinica, 2011, 20(5): 119-125. 姜健, 楊寶靈, 夏彤, 等. 紫花苜蓿耐鹽種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 20(5): 119-125.

[14] Wang J F, Li Y Q, Guo Y Q. Effects of saline alkali soil on saline alkali soil. Shangdong Journal of Animal Science and Veterinary Medicine, 1999, (5): 20-21. 王金芬, 李玉芹, 郭玉泉. 耐鹽堿牧草改良鹽堿土的效果. 山東畜牧獸醫(yī), 1999, (5): 20-21.

[15] Wang X P, Li W Q. A report on the quality inspection and analysis of several different alfalfa varieties. Contemporary Animal Husbandry, 2004, (5): 39. 王學(xué)鵬, 李文全. 幾個(gè)不同品種紫花苜蓿質(zhì)量檢驗(yàn)分析報(bào)告. 當(dāng)代畜牧, 2004, (5): 39.

[16] Tian F P, Wang S M, Guo Z G,etal. Relationship between proline content and water content, single plant dry matter, and drought resistance of alfalfa. Pratacultural Science, 2004, 21(1): 3-6. 田福平, 王鎖民, 郭正剛, 等. 苜蓿脯氨酸含量和含水量、單株干質(zhì)量與抗旱性的相關(guān)性研究. 草業(yè)科學(xué), 2004, 21(1): 3-6.

[17] Zhang H N, Li X J, Li C D,etal. Effects of overexpression of wheat superoxide dismutase (SOD) genes on salt tolerant capability in Tobacco. Acta Agronomica Sinica, 2008, 34(8): 1403-1408. 張海娜, 李小娟, 李存東, 等. 過量表達(dá)小麥超氧化物歧化酶(SOD)基因?qū)煵菽望}能力的影響. 作物學(xué)報(bào), 2008, 34(8):1403-1408.

[18] Duanmu H, Wang Y, Bai X,etal. Wild soybean roots depend on specific transcription factors and oxidation reduction related genes in response to alkaline stress. Functional & Integrative Genomics, 2015, 15(6): 651-660.

[19] Wu P, Liu T, Qin G X,etal. Full-length cDNA cloning and characterization of a hypothetic protein gene responsive to the infection of bombyxmoricytoplasmic polyhedrosis virus. Science of Sericulture, 2010, 36(6): 937-943. 吳萍, 劉挺, 覃光星, 等. 家蠶質(zhì)型多角體病毒感染應(yīng)答的假定蛋白基因全長(zhǎng)cDNA克隆與表達(dá)特征分析. 蠶業(yè)科學(xué), 2010, 36(6): 937-943.

[20] Bitinaite J. USERTMfriendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research, 2007, 35(6): 1992-2002.

[21] Geuflores F, Noureldin H H, Nielsen M T,etal. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research, 2007, 35(7): e55.

[22] Jones H D, Wilkinson M, Doherty A,etal. High throughputAgrobacteriumtransformation of wheat: a tool for functional genomics[C]//Wheat Production in Stressed Environments. Proceedings of the 7th International Wheat Conference, 2007: 693-699.

[23] Cortazar B, Koydemir H C, Tseng D,etal. Field quantification of plant chlorophyll content using Google Glass[C]//SPIE BiOS. International Society for Optics and Photonics, 2015.

[24] Liu T Z, Zhao X P. Study of apricot leaves plasma membrane permeability by electric conductivity method. Journal of Hebei Agricultural Sciences, 2008, 12(1): 33-34. 劉鐵錚, 趙習(xí)平. 電導(dǎo)法測(cè)定杏葉片細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性的研究. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 12(1): 33-34.

[25] Zhang T X, Lin Z J, Cao M H,etal. Study on determination of pepper leaf cell membrane permeability of the electrical conductivity method. Fujian Science & Technology of Tropical Crops, 2013, (1): 19-21. 張?zhí)煜? 林宗鏗, 曹明華, 等. 電導(dǎo)率法測(cè)定甜椒葉片細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性的研究. 福建熱作科技, 2013, (1): 19-21.

[26] Alt D. The cat-method for the chemical analysis of horticultural substrates (refereed). Acta Horticulturae, 1997, 450(450): 87-96.

[27] Webb B L. Response of seedling alfalfa (Medicagosativa) to four postemergence herbicides. Weed Technology, 1991, 5(4): 736-738.

[28] Zhang Y, Liu J, Zhou Y,etal. Enhanced phytoremediation of mixed heavy metal (mercury)-organic pollutants (trichloroethylene) with transgenic alfalfa co-expressing glutathione S-transferase and human. Journal of Hazardous Materials, 2013, 260(6): 1100-1107.

[29] Winicov I, Bastola D R. Transgenic overexpression of the transcription factor alfin1 enhances expression of the endogenousMsPRP2 gene in alfalfa and improves salinity tolerance of the plants. Plant Physiology, 1999, 120(2): 473-480.

[30] Liu L, Fan X D, Wang F W,etal. Coexpression ofScNHX1 andScVPin transgenic hybrids improves salt and saline-alkali tolerance in alfalfa (MedicagosativaL.). Journal of Plant Growth Regulation, 2013, 32(1): 1-8.

[31] Wang Z Y, Song F B, Cai H,etal. Over-expressing GsGST14 fromGlycinesojaenhances alkaline tolerance of transgenicMedicagosativa. Biologia Plantarum, 2012, 56(3): 1-5.

[32] Sheng H, Zhu Y M, Li J,etal. Genetic transformation ofDREB2Agene into alfalfa. Pratacultural Science, 2007, 24(3): 40-45. 盛慧, 朱延明, 李杰, 等.DREB2A基因?qū)ψ匣ㄜ俎＿z傳轉(zhuǎn)化的研究. 草業(yè)科學(xué), 2007, 24(3): 40-45.

[33] Yang Z, Zhu Y M, Bai X,etal. Over-expressing GsCBRLK/SCMRP enhances alkaline tolerance and methionine content in transgenicMedicagosativa. Acta Agronomica Sinica, 2014, 40(3): 431.

[34] Yue Y F, Wu G, Wu Y H,etal. Development of qualitative PCR method targeting marker genes in transgenic plants. Chinese Journal of Oil Crop Sciences, 2011, 33(3): 280-289. 岳運(yùn)鋒, 吳剛, 武玉花, 等. 轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因定性PCR檢測(cè)方法研究. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 2011, 33(3): 280-289.

[35] Wang M, Zhang Q, Liu F C,etal. Family-wide expression characterization ofArabidopsisbeta-carbonic anhydrase genes using qRT-PCR and Promoter::GUS fusions. Biochimie, 2014, 97(1): 219-227.

[36] Shang Z M, Gao H W, Wang X L,etal. Extraction of bean DNA and detection of transgenic CaMV35S by PCR method. Journal of Heze University, 2006, 28(2): 73-75. 尚智美, 高宏偉, 王學(xué)亮, 等. 大豆樣品中DNA的提取與外源基因CaMV35S的PCR檢測(cè). 菏澤學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 28(2): 73-75.

[37] García-Pérez R D, Houdt H V, Depicker A. Spreading of post-transcriptional gene silencing along the target gene promotes systemic silencing. Plant Journal, 2004, 38(4): 594-602.

[38] Wang H H, Wu S J, Li F F,etal. Transgene silencing caused by 35S promoter methylation in upland cotton (Gossypiumhirsutum). Cotton Science, 2008, 20(4): 274-280. 王海海, 吳慎杰, 李飛飛, 等. 35S啟動(dòng)子甲基化引起棉花轉(zhuǎn)基因沉默. 棉花學(xué)報(bào), 2008, 20(4): 274-280.

[39] Peng H Y, Li-Jie Y U. Integration pattern and character of exogenous genes in transgenic plants. Heilongjiang Agricultural Sciences, 2011, 95(2): 509-513.

[40] Atsuo K, Yu H, Satoshi O,etal. Site-specific integration of exogenous genes using genome editing technologies in zebrafish. International Journal of Molecular Sciences, 2016, 17(5): 727.

[41] Tang L, Cai H, Ji W,etal. Overexpression of GsZFP1 enhances salt and drought tolerance in transgenic alfalfa (MedicagosativaL.). Plant Physiology & Biochemistry, 2013, 71(71C): 22-30.

[42] Sun M, Sun X, Zhao Y,etal. Ectopic expression of GsPPCK3 and SCMRP inMedicagosativaenhances plant alkaline stress tolerance and methionine content. Plos One, 2013, 9(2): e89578.

IsolationofGsARHPfromGlycinesojaanditsfunctionalanalysisintransgenicalfalfaunderalkalinestress

CHEN Ran-Ran**, ZHU Ping-Hui**, JIA Bo-Wei, SONG Xue-Wei, WANG Zi-Jun, LI Ji-Na, LI Qiang, DING Xiao-Dong, ZHU Yan-Ming*

KeyLaboratoryofAgriculturalBiologicalFunctionalGenes,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China

GsARHP, which encodes hypothetical protein up-regulated by alkaline stress, was identified from RNA-seq data of wild soybean (Glycinesoja) at the early stage of the salt stress response. Real-time PCR analyses showed thatGsARHPwas induced by alkali stress. A bioinformatics analysis showed that the gene encodes a hydrophilic protein consisting of 130 amino acids, with a signal peptide but no transmembrane domain. A plant overexpression vector was constructed and transformed into alfalfa byAgrobacteriumtumefaciens-mediated cotyledonary node infection. Three transgenic lines were identified by PCR, Southern blotting, and RT-PCR analyses. The non-transgenic lines became wilted and yellow or even died under 0, 100, and 150 mmol/L NaHCO3treatment for 14 days, while the transgenic lines grew well under the same conditions. Further analyses showed that the transgenic lines had significantly lower relative plasma membrane permeability and malondialdehyde (MDA) content than did non-transgenic lines (P<0.01), and significantly higher chlorophyll content and CAT activity (P<0.01). These results indicated that overexpression ofGsARHPcould enhance the alkali resistance of alfalfa.

Glycinesoja;GsARHPgene; alkali stress; alfalfa; genetic transformation

10.11686/cyxb2016464

http://cyxb.lzu.edu.cn

陳冉冉, 朱娉慧, 賈博為, 宋雪薇, 王子君, 李佶娜, 李強(qiáng), 丁曉東, 朱延明. 堿脅迫應(yīng)答基因GsARHP的克隆及轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的耐堿性分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(9): 92-103.

CHEN Ran-Ran, ZHU Ping-Hui, JIA Bo-Wei, SONG Xue-Wei, WANG Zi-Jun, LI Ji-Na, LI Qiang, DING Xiao-Dong, ZHU Yan-Ming. Isolation ofGsARHPfromGlycinesojaand its functional analysis in transgenic alfalfa under alkaline stress. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(9): 92-103.

2016-12-08；改回日期：2017-02-11

國(guó)家自然科學(xué)

基金項(xiàng)目(31171578)，黑龍江省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(2011TD005)和東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目—團(tuán)隊(duì)1資助。

陳冉冉(1991-)，女，河北邯鄲人，在讀碩士。E-mail：crr0620@126.com。朱娉慧(1990-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，在讀碩士。E-mail：zhupinghui@outlook.com。**共同第一作者These authors contributed equally to this work.*通信作者Corresponding author. E-mail: ymzhu2001@neau.edu.cn