孔令環(huán)，劉 穹，邢明雨，韓 梅，肖中平，王新梅

(吉林省人民醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

急性白血病病人外周血NK細(xì)胞檢測(cè)的臨床意義

孔令環(huán)*，劉 穹，邢明雨，韓 梅，肖中平，王新梅

(吉林省人民醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

目的探討急性白血病病人外周血NK(CD3-CD16+CD56+)細(xì)胞檢測(cè)的臨床意義。方法用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)18例正常對(duì)照及54例急性白血病病人外周血NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比，NK細(xì)胞膜活化性受體NKG2D和抑制性受體NKG2A及穿孔素、顆粒酶的表達(dá)。結(jié)果(1)白血病初治組NK細(xì)胞數(shù)量顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)，緩解組、復(fù)發(fā)組與正常對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；(2)初治組、復(fù)發(fā)組活化性受體NKG2D均顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)；初治組、緩解組、復(fù)發(fā)組抑制性受體NKG2A與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。(3)初治組、復(fù)發(fā)組的穿孔素表達(dá)均顯著低于正常對(duì)照(P<0.05)。結(jié)論NK細(xì)胞數(shù)量減少及NKG2D、穿孔素表達(dá)減少可能與白血病病人發(fā)病及復(fù)發(fā)有關(guān)。

白血病；急性；NK細(xì)胞；受體；穿孔素；顆粒酶

(ChinJLabDiagn,2017,21:1311)

急性白血病是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫功能紊亂有關(guān)[1,2]；而導(dǎo)致白血病難以治愈和容易復(fù)發(fā)的原因也與機(jī)體免疫功能的低下及免疫逃逸機(jī)制形成有關(guān)。NK(CD3-CD16+CD56+)細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成成分，不需要抗原致敏，即可非特異殺傷靶細(xì)胞。本研究通過(guò)檢測(cè)外周血NK細(xì)胞數(shù)量及活化性受體及抑制性受體的表達(dá)，來(lái)探討NK細(xì)胞數(shù)量、功能的變化在急性白血病發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取本院2016年1-12月急性白血病住院病人54例為研究對(duì)象，其中初治組22人，緩解組16人，復(fù)發(fā)組16人。初治組男13例，女9例，年齡22-68歲，ALL 6例，M26例，M56例，M34例，均經(jīng)MICM 分型確診。對(duì)照組18例，均為本院健康體檢者，男10例，女8例，年齡31-53歲。標(biāo)本的留取均獲得知情同意。

1.2 試劑和儀器

單抗購(gòu)自BCM公司，鼠抗人CD3-ECD、CD16-PC5 、CD56-PC5、CD314-FITC(活化性受體NKG2D)、CD159- PE(抑制性受體NKG2A)、胞質(zhì)蛋白perforin-FITC(穿孔素)、granzyme β-PE(顆粒酶β)、同型對(duì)照、溶血素、破膜劑；流式細(xì)胞儀為美國(guó)貝克曼公司的多參數(shù)EPICS XL型流式細(xì)胞儀，應(yīng)用EXPO32ADCXL4 Color軟件分析，在FSC-SSC散點(diǎn)圖上選定淋巴細(xì)胞群，結(jié)果以百分率表示。

1.3 方法

受試者于清晨空腹采靜脈血2 ml，EDTA抗凝。

1.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞膜蛋白 1號(hào)Falcom管加入抗體CD3-ECD、CD16- PC5、CD56-PC5、NKG2A-PE、NKG2D-FITC各20 μl用于標(biāo)記NK細(xì)胞和NKG2A、NKG2D；再加100 μl外周血，充分混勻，室溫避光孵育15 min，加入溶血?jiǎng)?00 μl，混勻，室溫避光10 min，加入適量PBS，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加500 μl PBS，上機(jī)分析NK細(xì)胞及受體表達(dá)率。由此檢出的NK細(xì)胞包含CD16低表達(dá)CD56bright 亞型和CD16高表達(dá)的CD56dim亞型。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞質(zhì)蛋白 2號(hào)Falcom管加入抗體CD3-ECD、CD16- PC5、CD56-PC5各20 μl，再加100 μl外周血,充分混勻，室溫避光孵育15 min,加入Reagent A 100 μl，混勻，室溫避光10 min，1倍溶血素2 ml，混勻避光10 min，離心，去上清，再將50 μl Reagent B加入上述溶血后的試管中，室溫避光10 min，破膜、固定，加PBS液1 ml洗1次，離心棄上清，依次加入perforin-FITC、granzyme β- PE單抗各20 μl，4℃避光孵育15 min，加PBS液1 ml洗滌2遍，加500 μl PBS，上機(jī)分析NK細(xì)胞胞漿內(nèi)穿孔素、顆粒酶-β表達(dá)陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

由SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件完成統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性白血病病人外周血NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比

急性白血病病人初治組外周血NK(CD3-CD16+CD56+)細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)；急性白血病病人緩解組及復(fù)發(fā)組外周血NK(CD3-CD16+CD56+)細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.2 急性白血病病人NK細(xì)胞膜活化性受體、抑制性受體表達(dá)

急性白血病病人初治組、復(fù)發(fā)組活化性受體NKG2D均顯著低于正常對(duì)照(P<0.05)；緩解組活化性受體NKG2D與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。急性白血病病人初治組、緩解組、復(fù)發(fā)組抑制性受體NKG2A與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.3 急性白血病病人外周血NK細(xì)胞胞質(zhì)穿孔素、顆粒酶-β表達(dá)

急性白血病病人初治組、復(fù)發(fā)組的穿孔素表達(dá)均顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)；緩解組的穿孔素表達(dá)與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。急性白血病病人初治組的顆粒酶-β的表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)；緩解組、復(fù)發(fā)組的顆粒酶-β的表達(dá)與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 外周血NK細(xì)胞及表面受體及胞質(zhì)蛋白表達(dá)(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)%

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05

3 討論

自然殺傷(NK)細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成成分，不需要抗原致敏即可非特異殺傷靶細(xì)胞。正常情況下NK細(xì)胞約占外周血的10%-20%，有研究報(bào)道[3，4]，NK細(xì)胞數(shù)量減少可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降，往往與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。賀建霞等報(bào)道[5]，非霍奇金淋巴瘤初治患者外周血NK細(xì)胞數(shù)低于健康人；鄭淑霞等[3]報(bào)道，AML急性期和淋巴瘤急性期NK細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比有顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)，急性白血病初治組NK細(xì)胞數(shù)量減低，與正常對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)；緩解組、復(fù)發(fā)組NK細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照無(wú)顯著性差異，與報(bào)道一致。

NK細(xì)胞的抗腫瘤活性與其表面受體的表達(dá)水平有密切聯(lián)系，NK細(xì)胞的表面受體有許多種，根據(jù)其功能可分為活化性受體和抑制性受體。其中活化性受體NKG2D是C型凝集素樣受體，是NKG2家族中免疫活性最強(qiáng)的活化性受體，也是目前公認(rèn)的在抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用的受體，表達(dá)于絕大多數(shù)NK細(xì)胞表面，其表達(dá)水平幾乎決定了機(jī)體NK細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱，在抗腫瘤免疫中起重要作用[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，白血病初治組、復(fù)發(fā)組的NK細(xì)胞活化性受體NKG2D均顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)；緩解組活化性受體NKG2D與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 初治組、緩解組、復(fù)發(fā)組抑制性受體NKG2A與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。因此，考慮白血病病人的免疫功能降低與NKG2D表達(dá)減少有關(guān)，可能是白血病病人發(fā)病及復(fù)發(fā)的原因,與報(bào)道一致[7]。緩解組NKG2D表達(dá)明顯提高，提示經(jīng)過(guò)化療后病人的免疫功能得到恢復(fù)，與顧科峰[8]等報(bào)道一致。

研究還發(fā)現(xiàn)，白血病初治組的穿孔素及顆粒酶-β 表達(dá)均顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)，而緩解組病人的穿孔素及顆粒酶-β表達(dá)與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；可能是白血病發(fā)病時(shí)NK細(xì)胞功能不足的一種表現(xiàn)。復(fù)發(fā)組的穿孔素表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)，至于穿孔素在白血病復(fù)發(fā)中有何意義，由于標(biāo)本量少，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，白血病病人初治組NK細(xì)胞數(shù)量減少，初治組、復(fù)發(fā)組活化性受體NKG2D及穿孔素表達(dá)均減少，而緩解期均恢復(fù)正常。表明NK細(xì)胞的這一變化可能與疾病的狀態(tài)有關(guān)，所以，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)以上指標(biāo)可進(jìn)行白血病病情監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷。

[1]齊 紅，石 虹，劉玉俠，等.253例惡性腫瘤患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)及其臨床意義分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，13(11)：1589.

[2]楊德芬.外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)在惡性腫瘤中的應(yīng)用及臨床意義[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，19(10)：1390.

[3]鄭淑霞，謝若騰，官瑞婷，等.惡性血液病患者外周血NK細(xì)胞數(shù)量變化及意義[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2015,23(4)：1133.

[4]Bari A,Marcheselli L,Sacchi S,et al.Prognostic models for diffuse large B-cell lymphoma in the rituximab era:a never-ending story[J].Ann Oncol,2010,21:1486.

[5]賀建霞，趙志強(qiáng)，王艷峰，等.非霍奇金淋巴瘤患者外周血T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞檢測(cè)的臨床意義[J].白血病.淋巴瘤,2013，22(7)：436.

[6]常 鑫，馬 莉，曾小菁，等．白血病患者NK細(xì)胞表面NKG2D受體及其配體MICA/B的研究[J]．中國(guó)免疫學(xué)雜志，2009,25(2):174．

[7]Sun C,Sun H,Zhang C,et al.NK cell receptor imbalance and NK cell dysfunction in HBV infection and hepatocellular carcinoma[J].Cell Mpl Immunol,2015,12(3):292．

[8]顧科峰，陳琳軍，鄧曉輝，等．惡性血液病治療惡性血液病患者治療前后外周血NK細(xì)胞亞群變化的特點(diǎn)及其臨床意義[J]．實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29(13)：2154．

Significanceofnaturalkillcellperipheralbloodofpatientswithacuteleukemia

KONGLing-huan,LIUQiong，XINGMing-yu,etal.

(JilinProvinceHospital,Changchun130021,China)

ObjectiveTo explore The clinical significance of NK(CD3-CD16+CD56+) cell in peripheral blood of acute leukemia.MethodsBy flow cytometry，the percentage of NK cell in peripheral blood lymphocytes was detected in 54 acute leukemia and 18 healty adults .NK cell activation receptor (NKG2D),inhibitory receptor (CD159),perforin and granzyme of patients were also detected.Results(1)The percentage of NK cell in newly diagnosed acute leukemia patients was significantly lower than of normal controls(P<0.05).But it had no significant of the CR group and relapse group than that of normal controls(P>0.05).(2)The expression of NKG2D both in the newly diagnosed group and relapse group were significantly lower than that of normal controls(P<0.05).But the expression of NKG2A among the 3 groups had no significant than that of normal controls(P>0.05).(3)The expression of perforin and granzyme both in the newly diagnosed group and relapsegroup significantly lower than that of normal controls(P<0.05).ConclusionPerhaps,the lowered percentage of NK ,lowered expression of NKG2D and perforin had correlation with pathogenesy and relapse of acute leukemia

Leukemia;Acute;Natural killer cell;Receptor;Perforin;Granzyme

吉林省科技廳項(xiàng)目(20150101145JC)

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1311-03

R733.71

：A

2017-03-04)