張 郡，楊利麗，劉欽毅，孟憲榮，劉 睿，王瑞強(qiáng)，田海清，萬(wàn) 騰

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041)

P-15肽促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制及體內(nèi)成骨作用研究

張 郡，楊利麗，劉欽毅，孟憲榮*，劉 睿，王瑞強(qiáng)，田海清，萬(wàn) 騰

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041)

目的通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)P-15肽能有效激活、促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和向軟骨細(xì)胞分化，但是否在體內(nèi)仍有類似作用尚不明確。因此，本研究旨在探討P-15肽可能如何激活、促進(jìn)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞增殖分化，同時(shí)在體內(nèi)功能狀態(tài)。方法培養(yǎng)鼠間充質(zhì)干細(xì)胞在含有和不含有P-15肽的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6小時(shí)后，兩組細(xì)胞均用α5整合素抗體和pFAK抗體染色，進(jìn)行免疫熒光染色，同時(shí)進(jìn)行蛋白免疫印跡分析；在維斯塔小白鼠腹部皮下注射250 μl含有P-15+rhBMP-2或單純r(jià)hBMP-2的基質(zhì)膠建立小鼠皮下異位骨化模型，術(shù)后12天處死小鼠，分離取下腹部基質(zhì)膠行Micro CT及組織學(xué)檢查。結(jié)果①與對(duì)照組相比，P-15肽培養(yǎng)組pFAK和α5整聯(lián)蛋白的表達(dá)較對(duì)照組均有顯著性增高(P<0.05)；②Micro CT掃描、組織切片染色及免疫組織化學(xué)均提示P-15肽組基質(zhì)膠周邊軟骨沉積，發(fā)現(xiàn)肥大軟骨細(xì)胞沉積在外圍區(qū)域。結(jié)論①P-15肽可能通過(guò)激活pFAK通路并上調(diào)α5整聯(lián)蛋白的表達(dá)促進(jìn)MSCs向軟骨細(xì)胞分化；②P-15肽能促進(jìn)局部組織軟骨沉積，進(jìn)而出現(xiàn)組織骨化。

P-15肽；軟骨細(xì)胞；軟骨內(nèi)骨化；分化；α5整合蛋白/pFAK信號(hào)通路

(ChinJLabDiagn,2017,21:1429)

脊柱融合手術(shù)是當(dāng)前治療胸腰椎骨折最廣泛接受的手術(shù)方式[1]。在骨折愈合過(guò)程中，骨細(xì)胞形成是骨折愈合的關(guān)鍵因素，促進(jìn)骨細(xì)胞形成能提高骨折愈合率、縮短愈合進(jìn)程[2-4]。在骨細(xì)胞形成過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)有重要作用，因此影響成骨率的一個(gè)關(guān)鍵因素是相互作用間質(zhì)細(xì)胞的表面細(xì)胞外基質(zhì)[5,6]。研究顯示P-15肽能促進(jìn)纖維母細(xì)胞和骨母細(xì)胞增殖、粘附以及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌[7,8]，也能促進(jìn)骨組織的形成[8,9]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了P-15肽能有效激活、促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和向軟骨細(xì)胞分化。本研究旨在研究P-15肽促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制及體內(nèi)成骨作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及免疫熒光染色

實(shí)驗(yàn)選用鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium)中，37℃，5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。將第6代細(xì)胞分為兩組：P-15肽組和空白對(duì)照組分別接種于均勻鋪有P-15肽的培養(yǎng)皿和空白培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)6小時(shí)后，兩組細(xì)胞均用α5整合素抗體和pFAK抗體進(jìn)行免疫熒光染色。

1.2 大鼠皮下異位骨化模型建立

所有關(guān)于大鼠手術(shù)操作過(guò)程均提交托馬斯杰弗森大學(xué)倫理委員會(huì)審議并通過(guò)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為8-12周雄性維斯塔小白鼠，由查爾斯實(shí)驗(yàn)室提供。小鼠在飼養(yǎng)室預(yù)適應(yīng)2天后被分為兩組：P-15肽組和rhBMP-2組，P-15肽組注射含有P-15+ rhBMP-2的BD基質(zhì)膠；rhBMP-2組注射含有rhBMP-2的BD基質(zhì)膠。

將小鼠用異氟醚麻醉后，腹部區(qū)域備皮，術(shù)區(qū)消毒，將250 μl混合后基質(zhì)注射進(jìn)小鼠腹部形成皮丘，左側(cè)為P-15肽組，右側(cè)為rhBMP-2組。術(shù)后觀察小鼠生活狀態(tài)，有無(wú)并發(fā)癥。于術(shù)后12天用CO2處死小鼠，將腹部皮丘組織分離取下，進(jìn)行下一步分析研究。

1.3 Micro CT分析

組織標(biāo)本使用4%多聚甲醛固定，按照既往文獻(xiàn)說(shuō)明方法放入Micro CT中掃描[10]。根據(jù)圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行具體骨量分析。

1.4 組織學(xué)分析

動(dòng)物組織標(biāo)本切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。使用鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)單抗來(lái)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。染色切片進(jìn)行定量數(shù)字拍攝。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 P-15肽可以激活p FAK，促進(jìn)α5表達(dá)

與對(duì)照組相對(duì)比：培養(yǎng)基含有P-15肽的MSCs綠色熒光的為α5，紅色熒光的為pFAK，二者共同表達(dá)的區(qū)域?yàn)辄S色熒光(如圖1所示)，表明P-15肽與α5整合蛋白表達(dá)存在相關(guān)性，α5與pFAK的表達(dá)也有明顯相關(guān)性，同時(shí)隨著細(xì)胞數(shù)的增加而熒光強(qiáng)度增加。

圖1 細(xì)胞免疫熒光

2.2 Micro CT檢查

組織固定后行掃描骨定量分析，P-15肽組骨化和軟骨沉積更明顯。

2.3 組織切片染色

組織切片行蘇木精-伊紅染色，如圖2所示P-15肽組整個(gè)基質(zhì)膠周圍細(xì)胞染色較明顯，皮丘周圍軟骨組織沉積已經(jīng)完成，肥大軟骨細(xì)胞沉積于皮丘周圍邊緣。

圖2 蘇木精-伊紅染色

2.4免疫組織化學(xué)染色

免疫組化熒光反應(yīng)如圖3所示：P-15肽復(fù)合物周邊抗酒石酸酸性磷酸酶染色更明顯，發(fā)現(xiàn)更多肥大軟骨細(xì)胞。同時(shí)P-15肽組與對(duì)照組相比在MMP-13和VEGF水平上也有顯著性增加。

3 討論

脊柱骨折后的骨形成過(guò)程是一個(gè)骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)形成的三維組合的復(fù)雜過(guò)程，包括以下兩種機(jī)制：膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。軟骨內(nèi)成骨由骨折端周圍的間充質(zhì)形成與成骨類似的軟骨雛形，繼而出現(xiàn)原發(fā)性骨化位點(diǎn)，由此向兩端延伸進(jìn)而出現(xiàn)骨髓腔。軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)的早期沉積對(duì)組織修復(fù)非常關(guān)鍵，有大量細(xì)胞因子參與，需要通過(guò)上調(diào)特定基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行基質(zhì)重構(gòu)。軟骨細(xì)胞分化成為肥大型軟骨細(xì)胞可以促進(jìn)這樣的過(guò)程，而軟骨細(xì)胞的分化受到細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)的調(diào)控。

圖3 免疫組織化學(xué)染色

既往實(shí)驗(yàn)證明P-15肽通過(guò)α2β1整合素對(duì)骨分化和骨形成發(fā)揮作用，通過(guò)激活細(xì)胞基質(zhì)中的整合素，誘導(dǎo)骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞發(fā)生粘附，遷移，增殖和分化[8,11]。然而研究發(fā)現(xiàn)，在軟骨細(xì)胞形成和分化過(guò)程中，P-15肽并不直接與α2β1整合素蛋白結(jié)合，但卻可以通過(guò)上調(diào)該信號(hào)通路達(dá)到促進(jìn)軟骨內(nèi)骨形成[12]。

有研究證實(shí)α5β1整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞外細(xì)胞基質(zhì)信號(hào)參與軟骨骨化[13,14]。本研究提示α5整聯(lián)蛋白可能在P-15肽作用于MSC細(xì)胞軟骨化進(jìn)程中有舉足輕重的作用。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示P-15肽的作用下α5整聯(lián)蛋白的表達(dá)水平升高。FAK在細(xì)胞外基質(zhì)整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，并調(diào)節(jié)Ⅱ型膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖。Park等認(rèn)為FAK可以調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞中的軟骨糖胺多糖分泌[15]。本研究中pFAK蛋白的表達(dá)水平也有明顯升高，與α5整聯(lián)蛋白呈明顯相關(guān)性。因此，P-15可能通過(guò)上調(diào)α5整聯(lián)蛋白的表達(dá)并激活pFAK通路促進(jìn)MSC細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組皮丘周邊MSCs大量聚集，出現(xiàn)組織軟骨化和骨沉積。軟骨內(nèi)成骨的特點(diǎn)為軟骨細(xì)胞肥大，軟骨基質(zhì)鈣化，骨原細(xì)胞和血管長(zhǎng)入肥大性軟骨細(xì)胞陷窩，骨組織在鈣化軟骨組織中心形成[16]。與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組周邊肥大軟骨細(xì)胞聚集，從組織學(xué)角度證明了整個(gè)過(guò)程受軟骨內(nèi)成骨機(jī)制的調(diào)控。

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MolecularmechanismofP-15peptidepromotingthedifferentiationofmesenchymalstemcellsintochondrocytesanditsfunctionofosteogenesisinvivo

ZHANGJun,YANGLi-li,LIUQin-yi,etal.

(TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

ObjectiveP15 peptide enhances chondrocyte differentiation and formation in vitro.However,the mechanism is unclear,and whether this is effective in vivo is not clear.In this study,we assessed the mechanism of chondrogenic differentiation in vitro.Further investigationto determine whether P15 could independently direct chondrogenesis or mineralization in vivo.MethodsTo determine if P15 enhances chondrogenic differentiation through integrin α5/pFAK signaling,we stained MSCs that had been maintained on either uncoated or P15-coated dishes using antibodies specific for α5 integrin or pFAK.Six hours after plating,the expression of integrin was determined by Western blot and fluorescent immunohistochemistry.Male Wistar mices

two injections ofMatrigel with bone morphogenetic protein2(BMP2) in the right abdominal region and two injections of Matrigel with P15 in the left abdominal region,respectively.12 days after injections,thetransplanted masses were excised and analyzed by micro CT and histology.ResultsCompare to the control group,cells grown in vitroon surfaces coated with the P15 peptide have increased α5integrin expression and show activation of FAK(P<0.05).When P15 was combined with BMP2,it was observed that an increased number of MSCs transformed into chondrocytes at D12.ConclusionP15 may interact indirectly with integrin α5/pFAK signaling to enhance chondrocyte differentiation.P15 has the ability to increase bone formation through endochondral formation.

P-15peptide;chondrocyte;Cartilage ossification;differentiation;integrin α5/pFAK signaling

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1429-03

Q813

：A

2016-11-16)