王淑玲 劉 佳 鄧景貴 宋 濤 方翠霓 劉楚娟 陶 希

(湖南省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410016)

強(qiáng)制性運(yùn)動(dòng)療法對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)功能的影響

王淑玲 劉 佳1鄧景貴 宋 濤 方翠霓 劉楚娟 陶 希

(湖南省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410016)

目的制作腦卒中大鼠模型，給予強(qiáng)制性運(yùn)動(dòng)療法(CMIT)干預(yù)，觀察干預(yù)后大鼠相關(guān)神經(jīng)功能的變化。方法選取SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和CMIT訓(xùn)練組，觀察各組大鼠行為障礙、組織病理學(xué)改變、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3及程序化死亡基因(PDCD)-5表達(dá)情況、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量變化及神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及S-100β表達(dá)情況。結(jié)果與假手術(shù)組相比，模型組及CMIT訓(xùn)練組神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，CMIT訓(xùn)練組的神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(P<0.05)。假手術(shù)組大鼠腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核、核膜及核仁結(jié)構(gòu)完整；模型組細(xì)胞排列紊亂，水腫嚴(yán)重，核膜界線不清晰，血管充血嚴(yán)重；相比于模型組，CMIT訓(xùn)練組腦組織結(jié)構(gòu)較完整，且壞死較模型組顯著降低，間質(zhì)水腫較大緩解。假手術(shù)組基本未見Caspase-3及PDCD-5陽(yáng)性細(xì)胞；模型組隨處可見大量Caspase-3及PDCD-5陽(yáng)性細(xì)胞；但相對(duì)于模型組，CMIT訓(xùn)練組Caspase-3及PDCD-5陽(yáng)性細(xì)胞含量明顯降低。與假手術(shù)組相比，模型組及CMIT訓(xùn)練組Caspase-3及PDCD-5 mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與模型組大鼠相比，CMIT訓(xùn)練組大鼠的Caspase-3及PDCD-5 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。相比于假手術(shù)組，模型組及CMIT訓(xùn)練組SOD含量表達(dá)顯著降低MDA含量表達(dá)顯著升高(P<0.05)；相比于模型組，CMIT訓(xùn)練組SOD含量表達(dá)顯著升高M(jìn)DA含量表達(dá)顯著降低(P<0.05)；CMIT訓(xùn)練組(P<0.05)。相比于假手術(shù)組，模型組及CMIT訓(xùn)練組NSE、S-100β含量表達(dá)顯著升高；相比于模型組，CMIT訓(xùn)練組NSE、S-100β含量表達(dá)顯著降低(P<0.05)。結(jié)論CMIT療法可以通過抑制Caspase-3及PDCD-5凋亡因子，升高SOD，減少M(fèi)DA、NSE及S-100β含量，從而達(dá)到改善腦卒中后神經(jīng)功能障礙。

強(qiáng)制性運(yùn)動(dòng)療法(CMIT)；腦卒中；Caspase-3；PDCD-5；SOD；MDA；NSE；S-100β

腦卒中后常因神經(jīng)功能損傷而造成較高的致殘率，給家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。臨床上多運(yùn)用藥物、手術(shù)、康復(fù)治療等干預(yù)手段緩解腦卒中病情，改善神經(jīng)功能恢復(fù)〔1〕。強(qiáng)制性運(yùn)動(dòng)療法(CMIT)通過限制健側(cè)上肢、強(qiáng)化訓(xùn)練患肢，達(dá)到強(qiáng)制使用和強(qiáng)化訓(xùn)練患肢的目的，多用于腦卒中后恢復(fù)期的上肢功能訓(xùn)練〔2〕。然而，有關(guān)其對(duì)神經(jīng)功能改善的基礎(chǔ)研究暫時(shí)缺如。本研究擬觀察CMIT干預(yù)改善大鼠神經(jīng)功能的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1動(dòng)物及分組 從北京華阜康生物公司購(gòu)置Wistar大鼠120只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和CMIT訓(xùn)練組，每組40只。模型組和CMIT訓(xùn)練組均構(gòu)建腦卒中大鼠模型，CMIT訓(xùn)練組給予強(qiáng)制性運(yùn)動(dòng)康復(fù)。

1.2動(dòng)物模型構(gòu)建 參考相關(guān)文獻(xiàn)〔3〕建立腦卒中模型。7.2%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，剪開鼠頭部皮膚，頸正中切口，分離頸外動(dòng)脈(ECA)、右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)及頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。結(jié)扎ECA及CCA近心端。在CCA近分叉處插入備用魚線，將栓線送至大腦中動(dòng)脈分叉處，平均進(jìn)線(18.5±0.5)mm(ECA與ICA分叉處為起點(diǎn))，栓線尾端留于皮膚外，栓塞90 min后抽線實(shí)現(xiàn)再灌注。以動(dòng)物清醒后爬行時(shí)右轉(zhuǎn)圈，提尾時(shí)右前肢內(nèi)收屈曲為入選標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組操作同上，僅暴露各組血管，而不進(jìn)行線栓插入。

1.3CMIT訓(xùn)練 參照相關(guān)文獻(xiàn)〔4〕，CMIT訓(xùn)練組大鼠于造模后第7天行強(qiáng)制性訓(xùn)練。大鼠給予7.2%水合氯醛腹腔注射麻醉，將健肢置于自然屈曲的位置，然后用石膏纏繞固定該肢體，限制該肢體活動(dòng)，同時(shí)應(yīng)用改良托盤試驗(yàn)的訓(xùn)練，每天訓(xùn)練時(shí)間上下午各15 min。此項(xiàng)訓(xùn)練可強(qiáng)迫大鼠進(jìn)行患側(cè)肢體的運(yùn)動(dòng)。30 d后訓(xùn)練停止，取腦組織及血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。訓(xùn)練過程無死亡率，存活率為100%。

1.4行為障礙評(píng)分 造模后30 d，對(duì)大鼠進(jìn)行行為障礙評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照相關(guān)文獻(xiàn)〔3〕，采用4分制。0分，未見相關(guān)障礙；1分，左側(cè)前爪無力；2分，推手術(shù)側(cè)肩部，可發(fā)覺對(duì)側(cè)的移動(dòng)阻力降低；3分，大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)圈及行動(dòng)歪倒；4分，無肢體活動(dòng)。分值越高說明行為障礙越重。

1.5腦組織病理形態(tài)檢測(cè) 造模后30 d，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠處死，斷頭取大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，包埋，切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察腦組織形態(tài)。

1.6免疫組化檢測(cè)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3及程序化死亡基因(PDCD)-5的表達(dá) 將石蠟切片脫蠟，二甲苯透明，梯度酒精脫水，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，抗原修復(fù)，添加Caspase-3及PDCD-5一抗(購(gòu)于CST公司)過夜孵育，第2天二抗孵育，室溫靜置2 h，PBS清洗，DAB及蘇木精染色，清洗后封片顯微鏡觀察。

1.7RT-PCR檢測(cè)Caspase-3及PDCD-5 mRNA表達(dá) 造模后30 d，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠并處死，斷頭取大鼠腦組織。實(shí)驗(yàn)所需器械均經(jīng)高壓去RNA酶處理，并經(jīng)0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理，且實(shí)驗(yàn)均在冰塊上操作，降低溫度對(duì)結(jié)果的影響。取組織塊，加入1 ml TRIZOL，應(yīng)用勻漿機(jī)裂解5 min，然后依次加入三氯甲烷、異丙醇及75%乙醇進(jìn)行獲取RNA，10 μl DEPC水溶解RNA沉淀，紫外分光光度儀測(cè)定濃度及純度。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)于Takara公司)，嚴(yán)格按照說明書，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并嚴(yán)格按照擴(kuò)增試劑反應(yīng)要求進(jìn)行PCR體系的擴(kuò)增及反應(yīng)。引物序列：Caspase-3上游引物5′-ATGGAAGTGTCTCTATTAA-3′,下游引物5′-AGAACGGATTGGGTATGCC-3′;β-actin上游引物5′-CCATAAGCATTTAAACCCTC-3′,下游引物5′-AGTGGGTCATTTCAATACG-3′;PDCD-5上游引物5′-TTGAATGTCTGACTGAAAA-3′,下游引物5′-CAGCCTTTTGTGTTAGACC-3′。

1.8神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及S-100β蛋白含量檢測(cè) 造模后30 d，對(duì)大鼠進(jìn)行眼球取血，靜置2 h后高速離心取血清置于深凍冰箱備用。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定NSE及S-100β含量，取冷凍血清，4℃解凍，應(yīng)用NSE試劑盒及S-100β試劑盒(均購(gòu)于R&D公司)。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書，預(yù)包被孔板，將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品孔，將樣品血清加入樣品孔，加檢測(cè)抗體，加生物素標(biāo)記抗體，室溫孵育，洗板，加入抗生物素蛋白鏈菌素-辣根過氧化物酶，室溫孵育，洗板，顯色液加入，室溫避光孵育15 min，加入終止液，酶標(biāo)儀讀數(shù)，檢測(cè)血清中兩種蛋白含量。

1.9超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè) 血清制備同1.8。應(yīng)用SOD試劑盒(碧云天試劑公司)，嚴(yán)格按照說明書及文獻(xiàn)配置多種試劑及顯色劑及操作〔3〕，并應(yīng)用儀器檢測(cè)吸光度。SOD(U/ml)=(對(duì)照管吸光度-測(cè)定管吸光度)/對(duì)照管吸光度×50%×稀釋倍數(shù)。

1.10丙二醛(MDA)檢測(cè) 血清制備同1.8。應(yīng)用MDA試劑盒(碧云天試劑公司)，采用熒光檢測(cè)法，嚴(yán)格參照說明書及相關(guān)文獻(xiàn)配置試劑及標(biāo)準(zhǔn)品〔3〕，試劑混勻后95℃水浴40 min，再流水一旁沖洗，3 500 r/min離心10 min，取上清后測(cè)定吸光度。MDA(nmol/ml)=(測(cè)定管吸光度-測(cè)定空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1行為障礙評(píng)分 與假手術(shù)組(0分)大鼠相比，模型組〔(3.53±0.76)分〕及CMIT訓(xùn)練組〔(2.51±0.69)分〕各大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組大鼠相比，CMIT訓(xùn)練組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(P<0.05)。

2.2腦組織病理學(xué)改變 假手術(shù)組大鼠腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核、核膜及核仁結(jié)構(gòu)完整；模型組細(xì)胞排列紊亂，水腫嚴(yán)重，核膜界線不清晰，血管充血嚴(yán)重；相比于模型組，CMIT訓(xùn)練組腦組織結(jié)構(gòu)較完整，且壞死較模型組顯著降低，間質(zhì)水腫較大緩解，見圖1。

圖1 各組大鼠HE染色(×400)

2.3Caspase-3及PDCD-5表達(dá)變化 光鏡下，Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色或黃褐色。假手術(shù)組基本未見Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞；模型組隨處可見大量Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞；相比于假手術(shù)組，CMIT訓(xùn)練組及模型組Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞含量明顯增加；相對(duì)于模型組，CMIT訓(xùn)練組Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞含量明顯降低，見圖2。光鏡下，PDCD-5陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色或黃褐色。假手術(shù)組基本未見PDCD-5陽(yáng)性細(xì)胞；模型組隨處可見大量PDCD-5陽(yáng)性細(xì)胞；相比于假手術(shù)組，CMIT訓(xùn)練組及模型組PDCD-5陽(yáng)性細(xì)胞含量明顯增加；但相對(duì)于模型組，CMIT訓(xùn)練組PDCD-5陽(yáng)性細(xì)胞含量明顯降低，見圖3。與假手術(shù)組大鼠相比，模型組及CMIT訓(xùn)練組大鼠的Caspase-3及PDCD-5 mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與模型組大鼠相比，CMIT訓(xùn)練組大鼠的Caspase-3及PDCD-5 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見圖4。

2.4SOD及MDA含量比較 相比于假手術(shù)組，模型組及CMIT訓(xùn)練組SOD含量顯著降低、MDA含量顯著升高(P<0.05)；相比于模型組，CMIT訓(xùn)練組SOD含量表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表1。

圖2 各組腦組織Caspase-3表達(dá)(DAB，×400)

圖3 各組腦組織PDCD-5表達(dá)(DAB，×400)

圖4 Caspase-3及PDCD-5 mRNA含量表達(dá)

組別SODMDA假手術(shù)組379.44±7.122.23±1.43模型組142.75±7.881)15.32±1.211)CMIT訓(xùn)練組192.16±8.191)2)7.37±1.091)2)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.5NSE及S-100β含量比較 相比于假手術(shù)組，模型組及CMIT訓(xùn)練組NSE、S-100β含量表達(dá)顯著升高(P<0.05)；相比于模型組，CMIT訓(xùn)練組NSE、S-100β含量表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠NSE及S-100β含量比較

3 討 論

腦卒中后，腦組織缺血缺氧導(dǎo)致細(xì)胞凋亡以及氧自由基增高，促使多種腦組織損傷特異性蛋白，如NSE、S-100β分泌增多，并隨之誘導(dǎo)腦組織神經(jīng)功能損傷。NSE是多由神經(jīng)元細(xì)胞分泌的，是CNS特異性蛋白，正常情況下血清中無法被檢測(cè)到，但當(dāng)顱內(nèi)缺血缺氧時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)的NSE即被釋放入血，可作為顱內(nèi)損傷的標(biāo)志物〔5〕；S-100β限制性表達(dá)于多種腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝多種功能，參與顱內(nèi)缺血缺氧的多種病理過程，被認(rèn)為是腦損傷的特異性標(biāo)記蛋白〔6〕。

作為腦卒中發(fā)病的重要因素之一，細(xì)胞凋亡是一種有序性的細(xì)胞死亡，是受多種基因調(diào)控的細(xì)胞正常死亡。已有研究表明，主要有3條信號(hào)通路可以干預(yù)凋亡：線粒體凋亡通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑和死亡受體通路，這三種通路最終都通過激活下游Caspase-3、PDCD-5等凋亡蛋白，從而誘發(fā)了細(xì)胞的程序性死亡〔7〕。Caspase-3處于凋亡系統(tǒng)的中心環(huán)節(jié)，多種因子及通道均可激活Caspase-3分子，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡〔8〕。PDCD-5是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡因子，在凋亡過程中起著早期及始動(dòng)性的功能，可誘發(fā)線粒體凋亡通路〔9〕。與此同時(shí)，機(jī)體在正常情況下可以清楚體內(nèi)多余的自由基，然而在顱內(nèi)缺血缺氧的情況下，機(jī)體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)較多的氧自由基的積聚，從而加重腦組織的損害。SOD是主要的抗氧化酶，能有效地清除體內(nèi)自由基〔10〕；而MDA與線粒體膜的穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)〔11〕，因此通過測(cè)定兩者情況可以評(píng)估顱內(nèi)氧自由基水平。

多種干預(yù)措施可促進(jìn)腦卒中后的神經(jīng)功能恢復(fù)，其中CMIT療法已被較廣泛地應(yīng)用于腦卒中患者康復(fù)領(lǐng)域，可有效改善患者神經(jīng)功能障礙〔12〕。然而CMIT通過何種機(jī)制干預(yù)腦卒中恢復(fù)仍然不清楚。本研究可以看出，CMIT療法可以形態(tài)學(xué)方面顯著改善大鼠腦卒中神經(jīng)功能障礙，免疫組化染色發(fā)現(xiàn)CMIT療法可以改善大鼠顱內(nèi)細(xì)胞凋亡程度，CMIT療法還可以顯著減輕腦卒中大鼠氧自由基的分泌。CMIT療法可以降低腦特異損傷蛋白的分泌，參與腦卒中的修復(fù)。以往研究顯示，CMIT療法可誘發(fā)大腦皮層發(fā)生使用-依賴性神經(jīng)功能重組的可塑性變化，可使腦卒中恢復(fù)期患者大腦皮層發(fā)生功能重組變化，使患側(cè)上肢運(yùn)動(dòng)功能得到恢復(fù)〔13，14〕。本研究可以看出，CMIT療法可以通過減輕顱內(nèi)凋亡程度，氧自由基分泌狀況及腦損傷蛋白的合成來改善腦卒中大鼠的神經(jīng)功能障礙，然而有關(guān)其深入機(jī)制的研究仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

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〔2016-11-14修回〕

(編輯 徐 杰)

R743

A

1005-9202(2017)18-4440-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.005

湖南省自然科學(xué)基金(12JJ9029)；湖南省科技廳項(xiàng)目(2013FJ3117)

1 湖南省人民醫(yī)院康復(fù)科

劉 佳(1963-)，女，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)康復(fù)研究。

王淑珍(1984-)，女，碩士，助理研究員，主要從事神經(jīng)康復(fù)研究。