肖 雷，許 龍

（1．安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230022； 2．安徽省先鋒制藥有限公司，安徽 合肥 230022）

高效液相色譜法測定甲硫氨酸維B1氯化鈉注射液中甲硫氨酸含量

肖 雷1，許 龍2

（1．安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230022； 2．安徽省先鋒制藥有限公司，安徽 合肥 230022）

目的建立測定甲硫氨酸維B1氯化鈉注射液中甲硫氨酸含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 采用COSMOSIL5 C18－MS－Ⅱ色譜柱（250 mm×4．6 mm，5 m）；以水為流動(dòng)相，流速為1．0 m L／min；柱溫為30℃ ，檢測波長為228 nm。結(jié)果 甲硫氨酸質(zhì)量濃度在70．94～638．46 g／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r＝0．999 9），平均回收率為100．03%，RSD為0．86%（n＝9）。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、簡便、快速、重復(fù)性好，適用于甲硫氨酸維B1氯化鈉注射液中甲硫氨酸的含量測定。

高效液相色譜法；甲硫氨酸維B1氯化鈉注射液；甲硫氨酸；含量測定

Abstract：Ob jective To establish an HPLC method for content determination of methiouine in Methiouine in Methiouine－Vitamin B1and Sodium Chloride Injection．M ethods The COSMOSIL5 C18－MS－Ⅱcolumn（250 mm×4．6 mm，5 m）was performed，the mobile phase was water，the flow rate was 1．0 mL／min，the temperature was set at 30℃，the detection wavelength was 228 nm．Results Methiouine showed a good linear in the concentration range of 70．94－638．46μg／mL（r＝0．999 9）．The average recovery of methiouine was 100．03%，and RSD was 0．86%（n＝9）．Conclusion The method is accurate，simple，rapid and reproducible，which can be used for the content determination of methiouine in Methiouine in Methiouine－Vitamin B1and Sodium Chloride Injection．

Key words：HPLC；Methiouine－Vitamin B1and Sodium Chloride Injection；methiouine；content determination

甲硫氨酸為人體8種必需氨基酸之一，人體自身不能合成，必須依靠外源補(bǔ)充。其在人體內(nèi)與三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合生成 S－腺苷氨酸，可促進(jìn)肝細(xì)胞膜磷脂甲基化，減少肝內(nèi)膽汁淤積，加強(qiáng)轉(zhuǎn)硫基作用，有利于肝細(xì)胞恢復(fù)正常生理功能，促進(jìn)黃疸消退和肝功能恢復(fù)；供給甲基，促進(jìn)膽堿合成，后者與肝臟的脂肪結(jié)合形成卵磷脂，有調(diào)脂、促進(jìn)肝脂肪代謝及保肝、解毒，可促進(jìn)體內(nèi)脂肪代謝的轉(zhuǎn)運(yùn)，防止脂肪沉積的作用。維生素B1在體內(nèi)與焦磷酸結(jié)合成輔羧酶，參與糖代謝中丙酮酸和α－酮戊二酸的氧化脫羧反應(yīng)，是糖類代謝所必需；缺乏時(shí)，氧化受阻形成丙酮酸，乳酸堆積影響機(jī)體能量供應(yīng)。甲硫氨酸維B1注射液系肝病輔助用藥，可改善肝臟機(jī)能，對(duì)多數(shù)肝臟疾病，如急慢性肝炎、肝硬化，尤其是脂肪肝有特別的療效，能改善肝內(nèi)膽汁淤積；可用于酒精、巴比妥類、磺胺類藥物中毒時(shí)的輔助治療；還可以改善營養(yǎng)，增強(qiáng)體質(zhì)[1]。甲硫氨酸維B1目前上市的劑型有注射液、凍干粉針等，尚無大輸液批準(zhǔn)上市。本品臨床應(yīng)用不良反應(yīng)少，經(jīng)調(diào)查醫(yī)院用藥情況，多采用靜脈滴注給藥。因此，筆者對(duì)甲硫氨酸維B1氯化鈉注射液進(jìn)行了研究，原劑型執(zhí)行的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[2]采用電位滴定法測定甲硫氨酸的含量。本研究中建立了高效液相色譜（HPLC）法，可測定原化藥注冊5類新藥甲硫氨酸維B1氯化鈉注射液中甲硫氨酸的含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC－10A型液相色譜儀（日本島津公司）；COSMOSIL5 C18－MS－Ⅱ色譜柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；N－2000型雙通道色譜工作站（浙江大學(xué)）；SPD－10Avp型紫外檢測器（日本島津公司）；AG135型雙量程電子天平（Mettler Toledo公司）；KQ－250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1．2 試藥

甲硫氨酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為140684－201507）；甲硫氨酸原料（注射用級(jí)，天津天安藥業(yè)有限公司，批號(hào)為160204）；維生素B1原料（注射用級(jí)，湖北華中藥業(yè)有限公司，批號(hào)為160115）；氯化鈉（中鹽宏博集團(tuán)云夢云虹制藥有限公司，批號(hào)為150228）；甲硫氨酸維B1氯化鈉注射液[醫(yī)院藥劑科制劑室自制，批號(hào)為160801，160802，160803，規(guī)格為每瓶250 mL，含甲硫氨酸（C5H11NO2S）100 mg、維生素 B1（C12H17ClN4OS·HCl）10mg與氯化鈉2．25g]；水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：COSMOSIL5 C18－MS－Ⅱ色譜柱（250mm×4．6 mm，5μm）；流動(dòng)相：水；流速：1．0 mL／min；柱溫：30℃；檢測波長：228 nm；進(jìn)樣量：20μL。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，理論板數(shù)以甲硫氨酸主峰計(jì)不得小于3 000。

2．2 溶液制備

供試品溶液：取甲硫氨酸維B1氯化鈉注射液，作為供試品溶液。

對(duì)照品溶液：精密稱取甲硫氨酸對(duì)照品適量，加水制成每1m L含0．4mg的溶液，即得。

空白輔料溶液：稱取維生素B110mg、鹽酸半胱氨酸（抗氧劑）75mg、氯化鈉2．25 g，置250mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2．3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2．2項(xiàng)下3種溶液各20μL，按2．1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1?？梢?，甲硫氨酸峰的分離度為9．8；理論板數(shù)以甲硫氨酸峰計(jì)算為9 645；空白輔料溶液（陰性樣品）對(duì)甲硫氨酸的測定無干擾。故規(guī)定理論板數(shù)以甲硫氨酸計(jì)不得小于3 000。取供試品溶液20μL，按2015年版《中國藥典（四部）》通則[3]，樣品吸收峰高是噪音的3倍，作為其檢測限，以不斷稀釋方法得出并計(jì)算，其最小檢測限為1 ng。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：稱取甲硫氨酸對(duì)照品35．47mg，精密稱定，置50mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取1．0，3．0，5．0，7．0，9．0m L，分別置10m L容量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻。分別取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積。以質(zhì)量濃度 X（μg／m L）對(duì)峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝1 760．14X－37．04，r＝0．999 9(n＝5)。結(jié)果表明，甲硫氨酸質(zhì)量濃度在70．94～638．46μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液（0．400 8mg／mL）20μL，按“2．1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0．41%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

中間精密度試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為160801），作為供試品溶液，由2人分別于不同時(shí)間采用不同儀器，分別精密量取20μL，按2．1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0．81%，表明方法中間精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為160801），依法制備供試品溶液，分別精密量取20μL，共6次，按2．1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0．54%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣20μL，測定，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積。結(jié)果的 RSD為0．65%(n＝6)，表明甲硫氨酸溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

回收率試驗(yàn)：分別稱取干燥至恒重的甲硫氨酸原料（含量為98．70%）8，10，12mg，各3份，精密稱定，分別置25mL容量瓶中，加處方量的輔料（維生素B1、鹽酸半胱氨酸、氯化鈉），加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取上述溶液各20μL，按2．1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)測定結(jié)果（n＝9）

2．4 樣品含量測定

取 3批自制樣品（批號(hào)分別為 160801，160802，160803）制備的供試品溶液和對(duì)照品溶液，按2．1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算樣品中甲硫氨酸的含量。結(jié)果3批樣品中甲硫氨酸的含量分別為標(biāo)示量的100．65%，100．34%，99．75%（n＝3）。

3 討論

3．1 測定波長選擇

取甲硫氨酸對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解后，置紫外－可見分光光度計(jì)中，采用空白流動(dòng)相，在195～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果228 nm波長處甲硫氨酸有最大吸收，空白對(duì)照試驗(yàn)表明，溶劑在228 nm波長處有極少量吸收，且保留時(shí)間短，不干擾主要成分和有關(guān)物質(zhì)的檢查。通過試驗(yàn)考察，測定波長在226～230 nm對(duì)含量測定結(jié)果無明顯影響，參考文獻(xiàn)[4]后選擇228 nm為測定波長。另外，同時(shí)取維生素B1對(duì)照品溶液，在195～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果表明，維生素B1在234．5 nm及262．5 nm波長處有最大吸收。為了不影響本輸液中2個(gè)主成分甲硫氨酸和維生素B1含量測定的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)中未采用文獻(xiàn)[5－6]報(bào)道的在同一色譜條件下同時(shí)測定兩者的含量，而是分別進(jìn)行含量測定方法學(xué)研究。

3．2 流動(dòng)相選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)，分別選用以1mmol／L的己烷磺酸鈉溶液（含0．2%三乙胺，用50%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至5．0） － 甲醇（85∶15）為流動(dòng)相[4]，以緩沖液[取庚烷磺酸鈉 0．25 g，用磷酸鈉溶液（取磷酸鈉 38 g，加水至1 000 m L使溶解，用磷酸調(diào)pH至2．1）溶解并稀釋至1 000 m L]－ 乙腈（94∶6）為流動(dòng)相[5]，以 0．005 mol／L庚烷磺酸鈉溶液（磷酸調(diào)pH至3．0）－乙腈（92∶8）為流動(dòng)相[6]，經(jīng)多次摸索和比較，結(jié)果以水為流動(dòng)相時(shí)峰形好，柱效高，各峰之間分離較好，故選此作為流動(dòng)相。

此外，本試驗(yàn)中對(duì)原輔料的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、原輔料相容性試驗(yàn)、溶液與包材的相容性試驗(yàn)等對(duì)該輸液含量、有關(guān)物質(zhì)和穩(wěn)定性有影響的因素也進(jìn)行了研究[7]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究中建立的測定甲硫氨酸維B1氯化鈉注射液中甲硫氨酸（C5H11NO2S）含量的HPLC法操作簡便，靈敏度高，干擾少，重復(fù)性好，準(zhǔn)確，快速，可用于本品的質(zhì)量控制。

[1]馬春玉．甲硫氨酸維B1的臨床應(yīng)用及進(jìn)展[J]．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2012，28（6）：888－889．

[2]WS－10001（HD－1387）－2003，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[S]．

[3]國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典（四部）[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：59－61．

[4]紀(jì) 宇，刁 勇，王晨霞．高效液相色譜法測定甲硫氨酸維B1注射液的含量[J]．中國生化藥物雜志，2005，26（4）：228－229．

[5]謝娟萍．HPLC法測定注射用甲硫氨酸維B1中甲硫氨酸和維生素B1的含量[J]．求醫(yī)問藥，2012，10（11）：852．

[6]張 斐，李小敏，劉春暉，等．RP－HPLC法測定甲硫氨酸維B1注射液的含量[J]．藥學(xué)與臨床研究，2007，15（1）：78－80．

[7]陳宇堃，薛巧如，梁蔚陽．ICP－MS法測定維生素B1注射液中硼、鋁、砷、鋇、鉛的含量[J]．藥物分析雜志，2016，36(3)：536－540．

Content Determ ination of M ethiouine in M ethiouine－Vitam in B1and Sodium Chloride In jection by HPLC

Xiao Lei1，Xu Long2
（1．The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei，Anhui，China 230022； 2．Anhui Piom Pharmaceutical Co．，Ltd．，Hefei，Anhui，China 230022）

R927．2；R977．4

A

1006－4931(2017)18－0014－03

10．3969／j．issn．1006－4931．2017．18．005

2017－05－09)

肖雷，男，副主任藥師，主要從事醫(yī)院臨床藥學(xué)工作，（電話）0551－62923245（電子信箱）xiaoleiayf＠126．com。

許龍，男，大學(xué)本科，主管藥師，主要從事化學(xué)仿制藥處方和工藝研究、質(zhì)量研究及一致性評(píng)價(jià)工作，(電話)0551－65355036(電子信箱)163xul＠163．com。