申 婷，肖 純，向 彬，郭營營，李秀芳

（1．云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500； 2．上海浦靈生物科技有限公司，上海 201203）

研究

天麻成分對羥基苯甲醛抗血小板聚集的作用機制研究

申 婷1，肖 純1，向 彬1，郭營營2，李秀芳1

（1．云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500； 2．上海浦靈生物科技有限公司，上海 201203）

目的探討天麻成分對羥基苯甲醛抗血小板聚集的作用機制。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法，檢測不同濃度（320，80，20 mol／L）對羥基苯甲醛對二磷酸腺苷（ADP）誘導后大鼠體外富血小板血漿中環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平的影響；采用雙波長Fura－2熒光分光光度法，測定對羥基苯甲醛對ADP誘導后家兔體外血小板胞漿鈣離子濃度的影響；采用western blot，檢測不同劑量（20，15，10 mg／kg）對羥基苯甲醛大鼠連續(xù)灌胃5 d后，對ADP誘導的血小板P2Y12受體表達的影響。結果 對羥基苯甲醛高、中濃度（320，80 mol／L）均能顯著提高大鼠富血小板血漿 cAMP水平，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01或 P＜0．05）；不同濃度（320，80，20 mol／L）對羥基苯甲醛對ADP誘導的家兔體外血小板細胞內(nèi)鈣釋放與外鈣內(nèi)流均無明顯影響，與陰性對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；高劑量（20 mg／kg）對羥基苯甲醛能顯著抑制ADP誘導的血小板P2Y12受體的表達。結論 天麻成分對羥基苯甲醛抗血小板聚集的作用是通過提高血小板cAMP水平、抑制血小板P2Y12受體的表達而發(fā)揮的。

天麻；成分；對羥基苯甲醛；抗血小板聚集；作用機制

Abstract：Objective To investigate the mechanism of the anti－platelet aggregation effect of p－Hydroxybenzaldehyde（PHBA） from Gastrodia elata．M ethods Enzyme－ linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect the effect of PHBA（320，80，20μmol／L）on the content of cyclic adenosine monophosphate（cAMP）in platelet－rich plasma（PRP）of rats induced by adenosine diphosphate（ADP）．The effect of PHBA on the external platelet cytosolic calcium concentration in rabbits induced by ADP was measured by dual－wavelength Fura－2 fluorescence spectrophotometry．The expression of P2Y12receptor induced by ADP was detected by western blotafter 5 days of continuous administration of PHBA （20，15，10 mg ／kg）rats．Results The high and medium concentrations（320，80 mol／L）of PHBA can significantly increase the levels of cAMP in PRP of rats，which were significantly higher than that in the model group，and the difference was statistically significant（P＜0．01 or P ＜0．05）．Different concentrations of PHBA （320，80，20μmol／L）had no obvious effect on intracellular calcium release and external calcium influx in ADP－induced rabbit platelets．High concentration of PHBA（20 mg／kg） could significantly inhibit the expression of platelet P2Y12receptor induced by ADP．Conclusion The mechanism of the anti－platelet aggregation effect of PHBA from Gastrodia elata is related to the increasing of platelet cAMP level and the inhibition of platelet P2Y12receptor expression．

Key words：Gastrodia elata；p－h(huán)ydroxybenzaldehyde；anti－platelet aggregation；mechanism

血栓性疾病是缺血性腦梗死、心肌梗死、急性冠脈綜合征等主要疾病的病理基礎，研究表明，血小板的異?；罨途奂瘜τ谘ǖ男纬捎兄匾饔?，抗血小板藥物可抑制血小板活化，對上述疾病有一定療效[1－2]。目前，臨床常用的抗血小板藥物有阿司匹林（環(huán)氧合酶抑制劑）、氯吡格雷（二磷酸腺苷 P2Y12受體拮抗劑）和血小板膜糖蛋白Ⅱb／Ⅲa受體拮抗劑（阿昔單抗）等，但不良反應較多，且多因出血風險而使臨床應用受限。因此，研究安全、有效的抗血小板聚集藥物仍然是防治血栓性疾病的重點。對羥基苯甲醛（p－Hydroxybenzaldehyde，PHBA）是蘭科植物天麻 Gastrodia elata Blume．的主要化學成分之一。前期研究顯示，云南道地藥材天麻的乙酸乙酯提取物具有較強的抗血小板聚集作用[3]。后續(xù)研究證實，PHBA是天麻抗血小板聚集活性成分之一，對于二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）誘導的家兔體外血小板聚集有顯著的對抗作用[4]，但其機制尚不清楚。因此，本研究中對PHBA抗血小板聚集的作用機制進行了考察。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 動物、儀器與試藥

1．1．1 動物

日本大耳白兔30只，體質量2～2．5 kg，雌雄兼用，動物合格證號為SCXK（川）2013－24。雄性SD大鼠66只，清潔級，體質量250～300 g，動物合格證號為SCXK（川）2015－030。所有動物均由四川省醫(yī)學科學研究院動物研究所提供，飼養(yǎng)條件：室溫為（22±2）℃，相對濕度60%～70%，12 h明暗循環(huán)，自由飲食和飲水。

1．1．2 儀器

Infinite M 200 PRO型酶標儀（瑞士Tecan公司）；賽多利斯XS125A型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；臺式低速離心機（上海電機廠）；IISS－1B型數(shù)字式超級恒溫浴槽（成都儀器廠）；臺式低速離心機（上海電機廠）；半干轉膜裝置（TE－70，英國Amersham Biosciences公司）；UVP凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio Spectrum，美國Spectrum公司）。

1．1．3 試藥

PHBA（上海百靈威科技有限公司，批號為LB20K01，純度為99%）；花生四烯酸（Arachidonic Acid，AA，日本TCI，批號為A0781）；ADP（Sigma公司，批號為091M7002V）；氯吡格雷（Clopidogrel，Santa Cruz Biotechnology，批號為G1713）；水合氯醛（分析純，天津市瑞金特化學品有限公司，批號為20090814）；枸櫞酸鈉（天津市瑞金特化學品有限公司，批號為 A20120416）；Fura2－AM（Sigma公司，批號為010M 1351）；鹽酸噻氯匹定（Sigma公司，批號為 039K1431）；磷酸鹽緩沖液（PBS，北京鼎國昌盛生物科技有限公司，批號為28J001141）；TritonX－100（MP Biomedical，LLC，批號為MR28831）；Na2CO3（批號為 A20120313）；ADP試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號為04／2014）；Rabbit Anti－P2Y12（北京 Bioss公司，批號為 bs－12072R）；GAPDH（Beyotime公司，批號為 AG019）；Goat Anti－Rabbit IgG－HRP（Abmart公司，批號為＃M 21002）。

1．2 方法

1．2．1 對大鼠血小板cAMP水平的影響

富血小板血漿 （PRP）的制備：將36只SD大鼠隨機分為溶劑對照組（給予1%吐溫－80）、模型組（給予吐溫 －80）、陽性對照組（給予氯吡格雷650μmol／L）及PHBA 3個濃度組（分別給予PHBA 320，80，20μmol／L）各6只，用10%的水合氯醛以3m L／kg的劑量腹腔注射麻醉大鼠，自頸總動脈取血，收集于一次性塑料試管中，采用3．2%枸櫞酸鈉抗凝，取血時試管內(nèi)枸櫞酸鈉與取血量的比例為1∶9，取后立即顛倒混勻。血液于室溫以1 000 r／min的速率離心10min，得上層液，即富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）。

各組給予相應藥物或溶劑干預5 min后，以ADP為誘導劑，終濃度為12μmol／L，誘導血小板聚集，5min后所有樣本中加入10mmol／L EDTA終止反應，4℃下以4 000 r／min的速率離心10min，收集上清液，按大鼠環(huán)磷酸腺苷（cAMP）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書操作，根據(jù)標準曲線計算出每個樣品中cAMP含量。

1．2．2 對家兔血小板鈣離子濃度的影響

負載血小板液制備：將30只家兔隨機分為5組，即溶劑對照組（給予1%吐溫－80）、陽性組（給予鹽酸噻氯匹定終濃度為 167μmol／L）和 PHBA 3個濃度組（320，80，20μmol／L）。用10%的水合氯醛以 3 mL／kg的劑量腹腔注射麻醉家兔，自頸總動脈取血，收集于一次性塑料試管中，采用3.2%枸櫞酸鈉抗凝，同前制備PRP，PRP以3 000 r／min的速率離心15min后，棄上清液，沉淀下來的血小板用無鈣HEPES緩沖液洗滌2次并調(diào)血小板數(shù)至400×109／L，加入Fura－2／AM，37℃恒溫避光振搖負載。

雙波長Fura－2熒光分光光度計法測定血小板細胞外鈣內(nèi)流：在上述HEPES液中加入CaCl2溶液孵育10min，調(diào)血小板數(shù)至400×109／L，取含Ca2+的HEPES細胞重懸液加入藥物，37℃孵育5min，測定熒光值。用酶標儀測定熒光強度，發(fā)射波長（Em）為505 nm，發(fā)射光柵10 nm，激發(fā)波長（Ex）分別為340，380 nm，激光光柵5 nm，雙波長下得熒光比值（F）。使細胞靜息1 min后加ADP，5 min后加0.1%TritonX－100破壞其細胞膜，測飽和狀態(tài)下得最大熒光比值（Fmax），最后加入EGTA絡合鈣離子，測得最小熒光比值（Fmin）。

雙波長Fura－2熒光分光光度法測定血小板細胞內(nèi)鈣釋放：取無Ca2+的HEPES細胞重懸液加入藥物，37℃孵育5min后測定熒光值。用酶標儀測定熒光強度，Em為505 nm，發(fā)射光柵 10 nm，Ex分別為340，380 nm，激光光柵5 nm，雙波長下得熒光比值（F）。使細胞靜息1min后加ADP，5min后加0.1%TritonX－100破壞其細胞膜，測飽和狀態(tài)下得最小熒光比值（Fmin），按公式[Ca2+]i＝Kd（R－Rmin)／（Rmax－R）（Ff2／Fb2）計算家兔血小板細胞在有無外鈣下ADP誘導的血小板[Ca2+]i。

1．2．3 對大鼠血小板P2Y12受體表達的影響

將30只SD大鼠隨機分為溶劑對照組（1%吐溫－80），陽性組（氯吡格雷20mg／kg），PHBA高劑量（20mg／kg）、中劑量（15mg／kg）、低劑量（10mg／kg）組，各6只。連續(xù)給予相應受試藥物5 d，于末次給藥后30min，自頸總動脈取血，收集于一次性離心管中，采用3.8%枸櫞酸鈉抗凝，同前制備PRP。加入ADP常溫下誘導，然后以3 000 r／min的速率離心15 min后，棄上清液，用PBS緩沖液洗滌沉淀的血小板2次。洗滌完后棄掉PBS，并根據(jù)細胞數(shù)量，加入適量的細胞裂解液，用微量移液器輕柔吹打數(shù)下使之充分混勻，冰上振蕩30 min，4℃下置離心機中以14 000 r／min的速率離心5min；離心結束后，取上清液置新的預冷EP管中。根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒法測定蛋白含量，并調(diào)平濃度。SDS－PAGE電泳：加入提前準備好的蛋白樣品，每孔上樣量為5μL，蛋白Marker上樣量為5μL。經(jīng)電泳、轉膜、牛奶封閉后，一抗4℃過夜，二抗孵育1h，TBST室溫搖床洗滌4次×5min，UVP凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1．3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2．1 對大鼠血小板cAM P水平的影響

高、中濃度(320，80μmol／L)的PHBA能顯著提高PRP中cAMP水平，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 PHBA對大鼠血小板cAMP水平的影響（±s，n＝6）

表1 PHBA對大鼠血小板cAMP水平的影響（±s，n＝6）

注：與模型組比較， P＜0．05， P＜0．01。

組別溶劑對照組模型組陽性對照組PHBA 高濃度組中濃度組低濃度組藥物濃度（ mol／L）－ －650 320 80 20 cAMP水平37．29±4．22 22．51±3．19 37．53±1．60 36．88±1．01 32．76±3．82 37．29±4．22

2．2 對家兔血小板鈣離子濃度的影響

不同濃度(320，80，20μmol／L)的PHBA對ADP誘導的家兔血小板細胞內(nèi)鈣釋放與外鈣內(nèi)流無明顯影響，與溶劑對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，詳見表2。

表2 PHBA對ADP誘導的家兔體外血小板聚集胞漿鈣離子濃度的影響（±s，n＝6）

表2 PHBA對ADP誘導的家兔體外血小板聚集胞漿鈣離子濃度的影響（±s，n＝6）

注：與溶劑對照組比較， P＜0．01。

組別溶劑對照組陽性組PHBA 高濃度組中濃度組低濃度組濃度（ mol／L）－167 320 80 20胞外流入[Ca2+]i（nmol／L）129．32±9．05 124．99±11．44 258．89±27．06 140．77±23．12 189．39±10．19釋放內(nèi)[Ca2+]i（nmol／L）229．68±16．64 139．02±12．74 267．46±27．24 221．13±28．73 245．08±19．78

2．3 對大鼠血小板P2Y12受體表達的影響

高劑量（20 mg／kg）PHBA能顯著抑制血小板P2Y12受體的表達，其作用與陽性藥相似。詳見圖1。

3 討論

血小板是從骨髓中成熟的巨核細胞胞漿裂解脫落下來的、具有生物活性的小塊胞質。生理情況下，血小板聚集對止血有重要作用；但在病理情況下，血小板的活化－聚集會導致許多疾病的發(fā)生和發(fā)展，是膿毒血癥感染、動脈或靜脈血栓形成、動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風等多種心腦血管疾病的重要發(fā)病機制之一[5－6]。此外，血小板聚集不僅會促進血栓形成，同時也釋放促炎細胞因子，刺激白細胞募集到內(nèi)皮細胞，加重炎性反應。因此，抗血小板活化與聚集藥物的研究已成為血栓性疾病研究領域的熱點，對于開發(fā)新藥與防治血栓相關疾病具有重要意義[7]。

圖1 PHBA對血小板P2Y12受體表達的影響

血小板活化聚集主要通過3條途徑，其中ADP途徑是影響血小板聚集的重要途徑，但目前認為，3條途徑最終均是通過降低血小板內(nèi)cAMP水平并增加細胞內(nèi)游離鈣離子濃度而引起血小板活化聚集[8]。因此，本試驗中主要以ADP為誘導劑，對PHBA抗血小板聚集的機制進行考察，結果表明，PHBA對ADP誘導的家兔血小板細胞內(nèi)鈣釋放與外鈣內(nèi)流均無明顯作用。腺苷酸環(huán)化酶可催化三磷酸腺苷（ATP）生成血小板cAMP，并經(jīng)磷酸二酯酶（PDE）催化作用降解為5′－磷酸腺苷。因此，選擇性血小板磷酸二酯酶抑制劑和腺苷酸環(huán)化酶激活劑均可升高血小板內(nèi)cAMP水平，從而抑制血小板聚集[9]。試驗結果顯示，PHBA可提高血小板內(nèi)cAMP水平，但其究竟是通過激活腺苷酸環(huán)化酶還是通過抑制磷酸二酯酶而減少cAMP的降解尚不清楚，有待進一步研究。P2受體是屬于血小板表面的嘌呤類受體，也是抗血栓藥物的重要靶點之一[10－14]。其中，P2Y12受體拮抗劑為重要的抗血小板聚集藥物，臨床應用廣泛。其屬于P2受體家族G蛋白偶聯(lián)受體家族，主要分布在血小板膜表面。當P2Y12受體被激活后，可引起血小板維持持久聚集，并且通過與Gi偶聯(lián)蛋白結合抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，從而導致cAMP水平降低，最終致使血栓性疾病的發(fā)生[15]。本研究結果表明，PHBA可明顯抑制血小板P2Y12受體的表達，也間接說明了PHBA升高血小板內(nèi)cAMP含量的原因，但PHBA是否能阻滯P2Y12受體還有待進一步研究。

[1]Heemskerk JW，Mattheij NJ，Cosemans JM．Platelet－based coagulation：different populations，different functions[J]．J Thromb Haemost，2013，11（1）：2－16．

[2]Lukasik M，Dworacki G，Michalak S，et al．Chronic hyper－reactivity of platelets resulting in enhanced monocyte recruitment in patientsafterischaemicstroke[J]．Platelets，2012，23（2）：132－142．

[3]淤澤溥，林 青，李秀芳，等．天麻醋酸乙酯提取物抗ADP誘導的家兔血小板聚集作用及機制[J]．中草藥，2007，38（5）：743－745．

[4]李秀芳，代 蓉，李國花，等．天麻成分對羥基苯甲醛抗血小板聚集作用及急性毒性研究[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25（3）：317－320．

[5]De Meyer SF，Deckmyn H，Vanhoorelbeke K．von W illebrand factor to the rescue[J]．Blood，2009，113（21）：5049－5057．

[6]Juurlink DN，Gomes T，Ko DT，etal．A population－based study of the drug interaction between proton pump inhibitors and clopidogrel[J]．CMAJ，2009，180（7）：713－718．

[7]BaigentC，Sudlow C，CollinsR，etal．Collaborativemeta－analysisof randomised trials of antiplatelet therapy for prevention of death，myocardial infarction，and stroke in high risk patients[J]．BMJ，2002，324（7329）：71－86．

[8]DobaczewskiM，Golanski J，Kowalski T，et al．Can we use adenosine diphosphate（ADP）to study″aspirin resistance″？The Janus faces of ADP－triggered platelet aggregation[J]．Pharmacol Rep，2008，60（3）：361－368．

[9]Harrison P．Platelet function analysis[J]．Blood Reviews，2005，19（2）：111－123．

[10]Raju NC，Eikelboom JW，Hirsh J．Platelet ADP－receptor antagonists for cardiovascular disease：past，present and future[J]．Nat Clin PractCardiovascMed，2008，5（12）：766－780．

[11]Srinivasan S，Mir F，Huang JS，et al．The P2Y12antagonists，2－methylthioadenosine 5′－monophosphate triethylammonium salt and cangrelor（ARC69931MX），can inhibit human plateletaggregation through a gi－independent increase in cAMP levels[J]．Journal of Biological Chemistry，2009，284（24）：16108－16117．

[12]Dorsam RT，Kunapuli SP．Central role of the P2Y12receptor in plateletactivation[J]．JClin Invest，2004，113（3）：340－345．

[13]Wijeyeratne YD，Heptinstall S．Anti－platelet therapy：ADP recep torantagonists[J]．Br JClin Pharmacol，2011，72（4）：647－657．

[14]SurprenantA，North RA．Signaling atpurinergic P2X receptors[J]．Annual Review of Physiology，2009，71（1）：333－359．

[15]NoéL，Peeters K，Izzi B，et al．Regulators of platelet cAMP levels：clinical and therapeutic implications[J]．Current Medicinal Chemistry，2010，17（26）：2897－2902．

Mechanism of Anti－Platelet Aggregation of P－Hyd roxybenzaldehyde from Gastrodia Elata

Shen Ting1，Xiao Chun1，Xiang Bin1，Guo Yingying2，Li Xiufang1
（1．Yunnan University of TCM，Kunming，Yunnan，China 650500； 2．Prisys Biotechnologies Co．，Ltd．，Shanghai，China 201203）

R285．5

A

1006－4931(2017)18－0004－04

10．3969／j．issn．1006－4931．2017．18．002

2017－04－10；

2017－05－26)

國家自然科學基金[81303263]；云南省高層次中醫(yī)藥人才培養(yǎng)項目[10452300500]。

申婷，大學本科，研究方向為中藥藥理與應用，（電子信箱）1010516948＠qq．com。

李秀芳，博士研究生，研究方向為中藥藥理與毒理，（電話）0871－65918014（電子信箱）sofinelxf＠163．com。