王繼濤 阮紅峰 付方達 吳承亮 △

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所，浙江 杭州 310053；3.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

改良型激素性股骨頭壞死小鼠模型的建立與評價*

王繼濤1，3阮紅峰1，2付方達1，3吳承亮1，2△

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所，浙江 杭州 310053；3.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

目的 為建立有效的動物模型，更好研究激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制，科學(xué)闡明中藥方劑治療該疾病的分子作用機制。方法 取45只2月齡雄性C57BL/6小鼠隨機平均分為對照組、傳統(tǒng)組、改良組。傳統(tǒng)組給予脂多糖聯(lián)合甲強龍激素造模，改良組小鼠則在傳統(tǒng)組基礎(chǔ)上調(diào)整飼料槽的高度，迫使小鼠主動站立取食，并予跑步機上跑步2 h/d；對照組給予等量的生理鹽水。定時觀察小鼠一般狀況，分別于造模前、造模后第4周、第8周抽血檢測血液中三酰甘油的含量，并于造模后8周測量小鼠股骨頭骨密度，次日處死取雙側(cè)股骨頭，體視顯微鏡下觀察股骨頭外觀及色澤。采用蘇木精-伊紅染色法（HE）及阿爾新藍染色（ABH）等技術(shù)觀察小鼠股骨頭病理變化。結(jié)果 傳統(tǒng)組和改良組小鼠精神狀態(tài)明顯差于對照組，且改良組差于傳統(tǒng)組 （P<0.05）；傳統(tǒng)組和改良組血液中三酰甘油的含量高于對照組，改良組高于傳統(tǒng)組；骨密度檢測顯示，傳統(tǒng)組和改良組骨密度低于對照組，且改良組低于傳統(tǒng)組（P<0.05）；股骨頭形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)改良組股骨頭軟骨下出血壞死的面積較傳統(tǒng)組嚴重，HE、ABH結(jié)果顯示，傳統(tǒng)組有9只出現(xiàn)（空骨陷窩數(shù)量增多，骨小梁變細甚至斷裂）等骨壞死表現(xiàn)，造模成功率達60%，改良組有11只出現(xiàn)（空骨陷窩數(shù)量增多，骨小梁變細甚至斷裂）股骨頭壞死的表現(xiàn)，造模成功率高達73.3%（P<0.05）。結(jié)論 傳統(tǒng)造模方法和改良造模方法皆可造模成功，但改良造模方法具有更高成模率。

激素性股骨頭壞死 動物模型 甲強龍 脂多糖 跑步機

股骨頭壞死（ONFH）是骨科臨床難題之一。據(jù)流行病學(xué)報道，在中國每年新增50～75000例股骨頭壞死患者［1］。其中激素性股骨頭壞死（SONFH）發(fā)病率占非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的一半以上［2］。SONFH發(fā)病好發(fā)于青壯年，具有雙側(cè)高發(fā)病率的特點，且發(fā)病率逐年上升［3-4］；若不能進行及時有效地治療，70%的患者最終將發(fā)生股骨頭塌陷，給個人和社會帶來沉重的心理和經(jīng)濟負擔(dān)［5］。當(dāng)前SONFH確切的發(fā)病機制和始動因素仍不明確，因此建立一個全過程高度模擬人類早期SONFH的動物模型顯得尤為迫切和重要。本研究參照RyooS等［6］的方法并加以改進，小劑量脂多糖聯(lián)合大劑量甲強龍誘導(dǎo)C57BL/6小鼠早期股骨頭缺血性壞死，為研究早期SONFH的治療和預(yù)防研究提供動物模型?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2月齡SPF級雄性C57小鼠45只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：ACXK（滬）2015-0016。實驗動物隨機平均分為3組：傳統(tǒng)組（激素加內(nèi)毒素組）、改良組（在傳統(tǒng)組的基礎(chǔ)上進行站立取食聯(lián)合運動）以及對照組（僅予等量生理鹽水）。

1.2 試劑與儀器 大腸桿菌內(nèi)毒素 （Sigma公司，美國批號L2880，規(guī)格 10 mg）；甲潑尼龍琥珀酸鈉（甲強龍）（Pfizer Manufacturing Belgium NV公司，批號：A07056）；光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本），Milli-QS超純水器（美國Millipore公司），青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號：F3117217）；Sartorius BS110S萬分之一電子天平（德國塞多利斯公司）；INSTRON萬能材料試驗機（美國英斯特朗公司），小鼠跑步機（北京智鼠多寶公司），RM2235石蠟切片機、LEICADM500三目生物顯微鏡及圖像信號采集與分析系統(tǒng)（德國Leica公司）。

1.3 模型制備 傳統(tǒng)組小鼠腹腔注射脂多糖20 μg/kg，每日1次，連續(xù)注射2 d；第3天開始臀肌注射100 mg/kg的甲強龍，連續(xù)注射2周；第3周開始隔天注射激素1次直至取材。改良組在傳統(tǒng)組基礎(chǔ)上調(diào)整飼料高度迫使小鼠站立取食增加運動，并予跑步機跑步2 h/d。對照組不做任何處理，并腹腔注射等量的生理鹽水。所有動物每周臀部注射3萬U青霉素預(yù)防感染。造模8周后取材（雙側(cè)股骨頭）。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 動物一般體征 注射藥物后連續(xù)8周，每日觀察各組動物注射后飲食、排便次數(shù)、皮毛光澤、體質(zhì)量、精神狀態(tài)等情況。

1.4.2 小鼠血液學(xué)檢查 分別于造模前、造模后第4周、第8周檢測血液中三酰甘油（TG）的含量。取血方法：戳刺小鼠眼瞼，放血1滴，吸取血滴，置于500 μL的EP管中。

1.4.3 Micro-CT檢測及骨密度分析 造模后8周，各組小鼠分批麻醉放在Micro-CT上掃描，對小鼠雙側(cè)股骨進行掃描。通過相應(yīng)分析軟件，測得小鼠各組股骨頭骨密度。

1.4.4 形態(tài)學(xué)觀察 在無菌條件下，用0.02%的戊巴比妥鈉對小鼠（0.2 mL/10 g）進行腹腔注射，麻醉后將小鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，逐層分離直至暴露髖關(guān)節(jié)，取出股骨頭。用1×PBS清洗股骨頭，予體視顯微鏡下觀察雙側(cè)股骨頭外觀及色澤。

1.4.5 組織病理檢查 組織置于4%多聚甲醛固定3 d，流水沖洗過夜，脫鈣10 d后，以針頭無阻力刺透為度。隨后進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、進行HE、ABH染色，光鏡下觀察股骨頭外形、軟骨、骨小梁、軟骨細胞的變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。計量資料以）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動物一般體征觀察 造模后，定時觀察和比較3組小鼠的行為學(xué)差異，包括飲食、排便次數(shù)、皮毛光澤、體質(zhì)量、精神狀態(tài)等。脂多糖腹腔注射后，傳統(tǒng)組和改良組均出現(xiàn)不同程度的精神萎靡。注射激素第3天后，除對照組外，傳統(tǒng)組和改良組均出現(xiàn)大便稀溏，飲食和活動均減少的表現(xiàn)。第10天后開始上述癥狀開始減輕，造模期間均未出現(xiàn)潰瘍，脫毛現(xiàn)象，改良組小鼠精神狀態(tài)較傳統(tǒng)組差。對照組與傳統(tǒng)組和改良組比較，對照組小鼠精神狀態(tài)正常，活動自如，飲食正常，皮毛光澤。各組小鼠體質(zhì)量變化見表1。由表可知，激素具有能夠減輕小鼠體質(zhì)量的作用，造模后4、8周，傳統(tǒng)組和改良組小鼠體質(zhì)量較對照組明顯減輕（P＜0.05），改良組與傳統(tǒng)組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組C57小鼠各時間點體質(zhì)量比較（g

表1 各組C57小鼠各時間點體質(zhì)量比較（g

與傳統(tǒng)組比較，*P＜0.05；與改良組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n 0周 4周 8周對照組 15傳統(tǒng)組 15 20.0067±0.4309 22.2467±0.4454*△ 23.6533±0.3136*△20.0200±0.1207 18.2667±0.6298 20.6800±0.5697改良組 1520.0533±0.1922 17.8600±0.4717 20.4733±0.6099

2.2 各組小鼠各時間點TG比較 見表2。TG水平在造模前、造模后第4周、8周呈漸增趨勢，第4周傳統(tǒng)組和改良組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），傳統(tǒng)組和改良組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；第8周時，傳統(tǒng)組和改良組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組C57小鼠各時間點TG水平比較（mg/dL

表2 各組C57小鼠各時間點TG水平比較（mg/dL

組 別n 0周 4周 8周對照組 15傳統(tǒng)組 15 72.8133±12.4077 72.8133±12.4077*△ 81.8133±11.5068*△73.6133±13.55991 88.8333±10.32277 99.4800±9.96416△改良組 1575.3467±14.24088 81.2800±11.45944 101.480±11.40546*

2.3 各組小鼠各時間點股骨頭骨密度比較 見表3。Micro-CT顯示，激素注射后股骨頭密度逐漸減少。取材時發(fā)現(xiàn)改良組較傳統(tǒng)組、對照組兩組更容易發(fā)生骨折，傳統(tǒng)組和改良組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組C57小鼠各時間點股骨頭密度（BMD）比較（g/cm2s）

表3 各組C57小鼠各時間點股骨頭密度（BMD）比較（g/cm2s）

組 別 n 0周 8周對照組 15傳統(tǒng)組 15 0.26000±0.43095 0.31200±0.03764*△0.26067±0.38816 0.23400±0.47479△改良組 150.26400±0.46105 0.14933±0.42337*

2.4 各組小鼠股骨頭形態(tài)學(xué)觀察 見圖1。造模8周后，對照組股骨頭外觀明亮潔白，關(guān)節(jié)表面光滑；傳統(tǒng)組大部分小鼠股骨頭表面有小面積軟骨下出血壞死；改良組大部分小鼠股骨頭軟骨下壞死的程度和范圍嚴重，軟骨關(guān)節(jié)表面粗糙，出現(xiàn)囊性樣改變。

圖1 各組小鼠8周時顯微鏡下股骨頭外觀（10倍）

2.5 各組小鼠股骨頭組織病理學(xué)檢察 圖2為HE染色，背景為粉紅色，細胞核為藍紫色。對照組小鼠股骨頭形態(tài)正常，骨小梁排列緊密，排列整齊。傳統(tǒng)組8周模型小鼠股骨頭外形圓滑，骨小梁排列紊亂，改良組8周模型小鼠股骨頭，骨小梁排列不規(guī)則，骨髓腔細胞死亡、脫落。圖3為ABH染色，背景為紅色，軟骨為藍色。對照組小鼠股骨頭形態(tài)正常，軟骨表面光滑，軟骨基質(zhì)含量較多，染色較深。傳統(tǒng)組小鼠股骨頭骺軟骨區(qū)厚度變薄，軟骨成分含量減少，染色變淺，骨小梁變細，部分出現(xiàn)斷裂。改良組小鼠股骨骺軟骨區(qū)厚度顯著變薄，骨小梁變細，部分斷裂甚至壞死，先前完整的骨骺線開始變得模糊，伴有纖維結(jié)構(gòu)增生，甚至有骨橋形成。

圖2 各組小鼠股骨頭組織病理學(xué)檢查（HE染色，50倍）

圖3 各組小鼠股骨頭組織病理學(xué)檢查（ABH染色，50倍）

3 討 論

臨床上，許多疾病的治療都需要長期服用大劑量激素類藥物，例如腎病綜合征，支氣管哮喘，SARS等，其帶來的并發(fā)癥股骨頭壞死也是很常見的。SONFH的患病人數(shù)也越來越多，但其發(fā)病機制尚不清楚，且缺乏切實有效的早期診斷和預(yù)防方法。因此建立與人類SONFH臨床病理特征相似的動物模型并探索其發(fā)病機制，尋求有效的治療和預(yù)防方法就顯得尤為重要［7］。SONFH患者存在共同的病理特征，即在應(yīng)用激素前就已經(jīng)有過敏性血管炎［8］。內(nèi)毒素使血管內(nèi)皮發(fā)生損傷，造成血液的流速減慢，血管內(nèi)易凝血的狀態(tài)，在此基礎(chǔ)上大劑量應(yīng)用激素更符合臨床發(fā)病特征，且有更好的成模率［9-10］。因此，模型建立選擇激素聯(lián)合內(nèi)毒素。

理想的SONFH的動物模型應(yīng)具有和人類高度相似的生理、病理、解剖特點，能夠有效地模擬SONFH發(fā)展過程。當(dāng)前主要用兔和鼠用于SONFH造模。選用小鼠作為實驗動物。小鼠是四肢動物，具有體質(zhì)量輕的特點，雖然難以造成股骨頭塌陷的模型，但是小鼠作為實驗動物有著自身獨特的優(yōu)勢。首先，小鼠的造模時間比較短，其次小鼠的活動空間大便于飼養(yǎng)，調(diào)整飼料槽的位置，使小鼠主動站立取食，模擬人股骨頭的受力狀態(tài)，有利于觀察疾病的發(fā)展過程。更重要的是，小鼠與人體的基因具有高度的同源性，這種基因的同源性，使得小鼠生理生化與發(fā)育過程的指標(biāo)與人體大致相似［11］，從而對環(huán)境及藥物的反應(yīng)也基本相同。為此，選用小鼠作為實驗動物。常用的造模方法有：單純激素、脂多糖聯(lián)合激素、異體血清聯(lián)合激素等方法［12-14］。本課題組經(jīng)過前期的預(yù)實驗，發(fā)現(xiàn)激素用量在20～100 mg/kg的范圍內(nèi)都屬于安全用量，相關(guān)研究證實在安全范圍內(nèi)，激素用量越大骨壞死發(fā)生率越高。故采用的是脂多糖（20 mg/kg）聯(lián)合大劑量的激素（100 mg/kg）同時配合站立取食聯(lián)合運動方法。本模型具有兩方面優(yōu)勢，一方面迫使小鼠站立取食，能夠模擬人股骨頭受力［15］。另一方面，運動可以模擬人SONFH早期的日常生活狀態(tài)。造模8周，B組15只小鼠中出現(xiàn)9只股骨頭壞死的表現(xiàn)，成模率達60%；而C組15只小鼠出現(xiàn)10只股骨頭壞死的表現(xiàn)；成模率高達73.3%，由此可見改良方法優(yōu)于傳統(tǒng)造模方法。造模過程中未出現(xiàn)小鼠死亡，這可能與無菌的操作習(xí)慣和良好的飼養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。

本模型模擬SONFH的早期病變，具有以下優(yōu)點：1）模型誘導(dǎo)時間比較短，SONFH效果明確；2）實驗動物存活率高，具有較好的成模率；3）與臨床上激素性股骨頭壞死的發(fā)病十分相似；4）激素聯(lián)合運動方法，能較好地模擬人發(fā)病早期的日常生活狀態(tài)。該模型建立，為早期激素性股骨頭缺血性壞死研究提供了可靠的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

綜上所述，脂多糖聯(lián)合甲強龍加站立喂食聯(lián)合運動方法能夠誘導(dǎo)小鼠早期激素性股骨頭缺血性壞死的發(fā)生，同時具有方法簡單、操作方便，成本低廉，成功率高的特點，有效地模擬SONFH早期的發(fā)病過程，所以該方法值得在股骨頭壞死的動物實驗中推廣應(yīng)用。

［1］Fan SH，Wang YY，Lu J，et al.CERS2 suppresses tumor cell invasion and is associated with decreased V-ATPase and MMP-2/MMP-9 activities in breast cancer［J］.J Cell Biochem，2015，116（4）：502-513.

［2］Xie M，Hu A，Luo Y，et al.Interleukin-4 and melatonin ameliorate high glucose and interleukin-1β stimulated inflammatory reaction in human retinal endothelial cells and retinal pigment epithelial cells［J］.Mol Vis，2014（20）：921-928.

［3］Lieberman JR，Engstrom SM，Meneghini RM，et al.Which factors influence preservation of the osteonecrotic femoral head［J］.Clin Orthop Relat Res，2012，470（2）：525-534.

［4］李子榮.股骨頭壞死：早期診斷與個體化治療［J］.中國矯形外科雜志，2013，21（19）：1909-1911.

［5］Tang C，Chen L，Gu W，et al.Cyclosporin A enhances the ability of trophoblasts to displace the activated human umbilical vein endothelial cell monolayers［J］.Int J Clin Exp Pathol，2013，6（11）：2441-2450.

［6］Ryoo S，Lee S，Jo S，et al.Effect of lipopolysaccharide （LPS）on mouse model of steroid-induced avascular necrosis in the femoral head （ANFH）［J］.J Microbiol Biotechnol，2014，24（3）：394-400.

［7］王坤正，王春生，武永剛，等.激素性骨壞死血管變化的實驗研究［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，92（29）：2024-2027.

［8］Saito S，Ohzono K，Ono K.Early arteriopathy and postulated pathogenesis of osteonecrosis of the femoral head.The intracapital arterioles［J］.Clin Orthop Relat Res，1992（277）：98-110.

［9］邊焱焱.大劑量糖皮質(zhì)激素對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的MiroRNA調(diào)節(jié)的實驗研究［D］.北京：清華大學(xué)醫(yī)學(xué)部，2012.

［10］張國橋，易誠青，滕松松，等.早期激素性股骨頭壞死模型的建立［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2012，12（7）：1223-1224，1235.

［11］Bejar J，Peled E，Boss JH.Vasculature deprivation-induced osteonecrosis of the rat femoral head as a model for therapeutic trials［J］.Theor Biol Med Model，2005（2）：24.

［12］Bekler H，Uygur AM，Gke A，et al.The effect of steroid use on the pathogenesis of avascular necrosis of the femoral head：an animal model［J］.Acta Orthop Traumatol Turc，2007，41（1）：58-63.

［13］Okazaki S，Nishitani Y，Nagoya S，et al.Femoral head osteonecrosis can be caused by disruption of the systemic immune response via the toll-like receptor 4 signalling pathway［J］.Rheumatology（Oxford），2009，48（3）：227-232.

［14］黃思俊，白志強，張弛，等.采用激素聯(lián)合內(nèi)毒素建立兔中期股骨頭壞死模型［J］.中華關(guān)節(jié)外科雜志：電子版，2016，10（3）：331-336.

［15］朱嘉，方以群，金晶，等.激素性股骨頭壞死動物模型建立方法初探［J］.海軍醫(yī)學(xué)雜志，2009，30（2）：97-101.

Establishment and Evaluation of a Modified Mouse Model of Steroid Induced Osteonecrosis of the Femoral Head

WANG Jitao，RUAN Hongfeng，F(xiàn)U Fangda，et al. First Clinical Medical School of Zhejiang

Chinese Medicine University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

Objective： To establish an effective animal model to study the pathogenesis of steroid induced osteonecrosis of the femoral head，and to elucidate the molecular mechanism of the treatment of the disease.Methods： 45 male C57BL/6 mice of two months′old were randomly divided into three groups： the control group（A group） and the traditional group （B group） and the modified group （C group）.The traditional group was treated with lipopolysaccharide combined with methylprednisolone.In the modified group，the height of the feed tank was adjusted on the basis of the traditional group，forcing the mice to stand actively for feeding，and running on the treadmill，2 h/d.A group was given the same dose of saline，regularly observing the general condition of mice.Respectively before and four and eight weeks after modeling，three glycerol content in the blood was detected.The femoral head density was measured 8 weeks after modeling，and the mice was sacrificed and the bilateral femoral head was taken the next day.The appearance and color of the femoral head were observed under a stereo microscope.Hematoxylin and eosin（HE） staining and Alcian blue staining（ABH） were used to evaluate the pathological changes of mouse femoral head.Results： Mental state of B and C groups was worse than that of A group，and C group was worse than B group （P<0.05）.In the traditional group and the modified group，the content of three glycerol in the blood was higher than that in the control group，and the modified group was higher than the traditional group.Bone mineral density test showed that bone density in the traditional group and the modified groupwas lower than that in the control group，and the modified group was lower than that of the traditional group （P<0.05）.The morphological observation of femoral head showed that the area of subchondral hemorrhage and necrosis in the femoral head of the modified group was more serious than that in the traditional group.Hematoxylineosin（HE） staining and Alcian blue staining（ABH） showed that in the traditional group，there were 9 with empty lacunae increasing and trabecular bone thinning and rupturing of bone necrosis；the success rate of the model reached 60%，whilein the modified group，there were 11 with empty lacunae increasing and trabecular bone thinning and rupturing of bone necrosis；the success rate of the model reached 73.3%（P<0.05）.Conclusion： The traditional modeling method and improved modeling method can be successfully modeled，but the improved model has higher rate into a mold.

Steroid induced osteonecrosis ofthe femoralhead；Animalmodel；Methylprednisolone；Lipopolysaccharide；Treadmill

R285.5

A

1004-745X（2017）09-1525-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.007

2017-05-19）

國家自然科學(xué)基金項目（81273770，8157150451）；浙江省自然科學(xué)基金項目（LY15H270012，Q17H270023）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2017ZB026）

△通信作者（電子郵箱：wu.cl@126.com）