張 芳

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院 國家加工食品監(jiān)督檢驗中心(福州)，福建 福州 350002）

液體培養(yǎng)法在大腸埃希氏菌O157∶H7鞭毛抗原鑒定中的應(yīng)用研究*

張 芳

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院 國家加工食品監(jiān)督檢驗中心(福州)，福建 福州 350002）

優(yōu)化了一種致瀉性大腸埃希氏菌H抗原凝集試驗方法。方法將目標(biāo)可疑菌加至無菌營養(yǎng)肉湯中，通過培養(yǎng)離心收集菌體沉淀，洗滌菌懸液用于待檢相H抗原的玻片凝集試驗。結(jié)果顯示，該凝集試驗方法效果顯著，檢測迅速，值得進(jìn)一步推廣和使用。

大腸埃希氏菌O157∶H7；H抗原鑒定；液體培養(yǎng)法

致瀉性大腸埃希氏菌是引起人體以腹瀉癥狀為主的全球性疾病的常見病原菌，在我國也居引起感染性腹瀉的所有傳染病之首。致瀉性大腸埃希氏菌國際上分類主要包括5類，即腸致病性大腸埃希氏菌（EPEC）、腸產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（ETEC）、腸侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）、腸出血性大腸埃希氏菌（EHEC）和粘附性腸埃希氏菌（EAEC），因此快速準(zhǔn)確地檢測這5種病原菌對預(yù)防和控制由其引起食物中毒事件有著十分重要的作用[1]。腸出血性大腸桿菌（EHEC）是能引起人的出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌，以O(shè)157:H7血清型為代表菌株。為了提高大腸埃希氏菌O157:H7檢測技術(shù)水平，對于H血清凝集試驗的試驗優(yōu)化就尤為重要。

大腸埃希氏菌O157:H7的血清診斷中，鞭毛抗原的血清分型是不可缺少的重要步驟，但是大腸埃希氏菌O157:H7的鞭毛結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，加熱、乙醇處理、干燥、冷凍等這些因素都可使其鞭毛生長困難[3，4]，從而對H抗原的鑒定帶來不利影響。傳統(tǒng)的大腸埃希氏菌O157:H7的鞭毛抗原鑒定方法一般將目標(biāo)菌株劃線于營養(yǎng)瓊脂，然后將培養(yǎng)物用于血清凝集試驗。若待測抗原與血清均無明顯凝集時，需在半固體中誘導(dǎo)多次，再進(jìn)行凝集試驗。該傳統(tǒng)方法凝集速度慢、干擾大、操作繁瑣。針對上述缺點，文章引入液體培養(yǎng)法進(jìn)行大腸埃希氏菌O157:H7鞭毛抗原的鑒定，以期探尋一種操作簡便、干擾小、重復(fù)性好的H抗原鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸埃希氏菌O157:H7 菌株（NCTC12900）購自北京國家典型培養(yǎng)物保藏中心；大腸埃希氏菌O157和H7血清診斷盒購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；營養(yǎng)肉湯、半固體瓊脂、營養(yǎng)瓊脂購自北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.2 傳統(tǒng)H抗原鑒定方法[2]

將大腸埃希氏菌O157:H7（NCTC12900）菌株活化后劃線接種于營養(yǎng)瓊脂，36±1℃培養(yǎng)18～24h，取培養(yǎng)物1環(huán)接種物做玻片凝集或試管凝集試驗。若待測抗原與血清均無明顯凝集，應(yīng)首先從營養(yǎng)瓊脂上挑取培養(yǎng)物，再進(jìn)行半固體管穿刺培養(yǎng)，36±1℃培養(yǎng)18～24h，重復(fù)半固體培養(yǎng)2～3次后再進(jìn)行血清凝集試驗。

1.3 優(yōu)化試驗方法（液體培養(yǎng)法）

1.3.1 將大腸埃希氏菌O157:H7（NCTC12900）菌株活化后接種于無菌營養(yǎng)肉湯于36±1℃培養(yǎng)18h獲得培養(yǎng)物。

1.3.2 將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至無菌離心管內(nèi)，于5000 r/min條件下離心10min，移棄上清液，保留離心管底部的菌體沉淀。

1.3.3 向含有菌體沉淀的離心管內(nèi)添加無菌生理鹽水（無菌生理鹽水與培養(yǎng)物的體積之比為1:1），用移液器輕輕吸吹，直至菌體完全懸浮，再次于5000 r/min下離心10 min，移棄上清液，完成洗液步驟。

1.3.4 向完成細(xì)菌步驟的離心管內(nèi)添加無菌生理鹽水（菌體沉淀與無菌生理鹽水的體積比為1:2），用移液器輕輕吸吹混勻，得到菌懸液。1.3.5 取10uL待檢相H因子血清滴加于干凈玻片上，取1uL菌懸液添加至血清液滴中，混勻并傾斜搖動玻片，1 min之內(nèi)觀察凝集現(xiàn)象，同時在玻片另一區(qū)域用無菌生理鹽水代替待檢H因子血清，與菌懸液混勻后作為對照。

2 結(jié)果與討論

傳統(tǒng)H抗原鑒定方法和液體培養(yǎng)法進(jìn)行大腸埃希氏菌O157:H7鞭毛抗原鑒定的結(jié)果比較如下：

表1 血清凝集鑒定結(jié)果

表1顯示采用液體培養(yǎng)法進(jìn)行大腸埃希氏菌O157:H7鞭毛抗原鑒定的凝集速度快，在10s內(nèi)即可凝集，操作過程中瞬間即可觀察到凝集顆粒，而傳統(tǒng)方法需要30～60s的時間才出現(xiàn)明顯的凝集顆粒。在反應(yīng)速度方面，液體培養(yǎng)法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。此外，傳統(tǒng)方法存在瓊脂干擾，瓊脂顆粒與凝集顆粒難以分辨。而液體培養(yǎng)法通過沉淀、洗滌，獲得菌懸液，消除了瓊脂顆粒對凝集試驗現(xiàn)象的干擾。同時，每個方法進(jìn)行了多次玻片凝集試驗，液體培養(yǎng)法的凝集效果均穩(wěn)定，重復(fù)性好。

血清分型是鑒別各類大腸埃希氏菌的重要方法之一，為了更好的診斷大腸埃希氏菌O157:H7 的鞭毛抗原，可以將菌株接種到液體培養(yǎng)基中，促使其鞭毛更好的發(fā)育，再通過離心收集菌體沉淀，獲得的菌懸液用于大腸埃希氏菌O157:H7 鞭毛抗原的凝集試驗。試驗證明該方法凝集速度快、現(xiàn)象明顯、干擾小、重復(fù)性好、成功率高、操作簡便。

對于H血清凝集試驗通常采用半固體瓊脂作為菌株生長的底物，瓊脂的存在抑制培養(yǎng)基的流動性，這與鞭毛的運動特性存在拮抗作用，從而阻礙H抗原性的復(fù)原。此外，致瀉性大腸埃希氏菌O157:H7可突破低濃度瓊脂，擴(kuò)散至培養(yǎng)基內(nèi)部長，造成菌體挑取困難，因此在進(jìn)行H抗原的玻片凝集試驗時，培養(yǎng)基不可避免的隨菌體進(jìn)入血清液滴中，且無法完全分散，微小的固態(tài)培養(yǎng)基顆粒極易與血清凝集顆粒混淆，從而嚴(yán)重干擾凝集結(jié)果的判定。另外，H抗原的凝集物為絮狀，不易觀察，實驗中往往需要挑取較多的菌體以增強凝集效果，這與降低固態(tài)培養(yǎng)基干擾的目的互相矛盾。

因此液體培養(yǎng)法可以克服傳統(tǒng)方法進(jìn)行致瀉性大腸埃希氏菌O157:H7鞭毛抗原試驗時存在的干擾大、成功率低、操作復(fù)雜、費時多等缺點，可以快速高效、簡便快捷的得到穩(wěn)定可靠的H抗原鑒定結(jié)果。

3 結(jié)論

液體培養(yǎng)法應(yīng)用于致瀉性大腸埃希氏菌O157:H7鞭毛抗原的鑒定，其凝集速度快、現(xiàn)象明顯、干擾小、重復(fù)性好、成功率高、操作簡便，具有較高的可行性和實用性，值得進(jìn)一步推廣。

[1] 李莎.大腸埃希菌臨床分離菌株耐藥性及毒力基因分析[D].青島:青島大學(xué)，2012.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品微生物檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗:GB/T 4789.36-2008[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008:8.

[3] 張國平，徐瑞良.發(fā)現(xiàn)一株菌體鞭毛抗原同時喪失的沙門菌[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2000，10（4）:462.

[4] 胡世江，吳錦如，張首帆，等.沙門氏菌鞭毛抗原的變異及檢測方法的初探[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，16（3）:945.

10.3969/j.issn.1007-550X.2017.05.004

R378.2+1

A

1007-550X（2017）05-0037-03

福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院科技項目（項目編號：KY201621A）。

2017-03-06

張芳（1987-），女，陜西西安人，本科，助理工程師，主要從事食品微生物相關(guān)檢測。