李海，劉巧紅，唐雪穎，陳武個，丁少雄*

(1. 國家海洋局第三海洋研究所 海洋生物與生態(tài)實驗室，福建 廈門 361005；2. 福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361102；3.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學院，福建 廈門 361012)

我國近岸多室草苔蟲(Bugula neritina)的群體遺傳分化研究

李海1，2，劉巧紅2，唐雪穎2，陳武個3，丁少雄2*

(1. 國家海洋局第三海洋研究所 海洋生物與生態(tài)實驗室，福建 廈門 361005；2. 福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361102；3.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學院，福建 廈門 361012)

基于線粒體控制區(qū)序列和SLAF-seq，對重要藥源生物多室草苔蟲的群體遺傳分化水平開展了研究?？刂茀^(qū)序列中檢測到8個單倍型，單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)分別為0.130 7和0.000 7，單倍型網(wǎng)絡圖和NJ系統(tǒng)進化樹的結(jié)構(gòu)都較簡單，無明顯拓撲結(jié)構(gòu)。中性檢驗和核苷酸不配對分析結(jié)果均表明多室草苔蟲未經(jīng)歷過大規(guī)模群體擴張。Fst和AMOVA分析顯示遺傳變異主要來自于群體內(nèi)。SLAF建庫共開發(fā)得到214 409個SLAF標簽，其中多態(tài)性SLAF標簽23 437個，共開發(fā)出99 432個SNP位點。群體間的遺傳距離較小，且低于群體內(nèi)的遺傳距離。基于SNP所做的系統(tǒng)發(fā)育樹和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，各群體之間沒有顯著的遺傳結(jié)構(gòu)。綜上所述，我國沿海多室草苔蟲的遺傳多樣性水平較低，不同地理群體之間不存在顯著的遺傳結(jié)構(gòu)。多室草苔蟲較強的擴散能力是造成上述結(jié)果的主要原因。另外，本研究還驗證和討論了SLAF-seq應用在海洋生物群體遺傳分化研究中的可行性和優(yōu)勢。

多室草苔蟲；群體遺傳分化；線粒體DNA；SLAF-seq；簡化基因組

1 引言

多室草苔蟲(Bugulaneritina)，又稱總合草苔蟲，隸屬于苔蘚動物門(Bryozoa)，裸唇綱(Cymndaemata)，唇口目(Cheilostomida)，草苔蟲科(Bugulidae)，草苔蟲屬(Bugula)，系環(huán)熱帶廣布種，廣泛地分布于世界各地的中低緯海域[1]。在中國范圍內(nèi)的表層水體中，多室草苔蟲只分布于東海和南海等南方海區(qū)[2]。作為一類常見的污損苔蟲，多室草苔蟲經(jīng)常附著于船底、浮標、石油平臺等人造水下設施以及養(yǎng)殖網(wǎng)箱、定置漁網(wǎng)等水產(chǎn)養(yǎng)殖設施上。

多室草苔蟲還是一種重要的海洋藥源生物。到目前為止，國內(nèi)外學者一共從多室草苔蟲中成功分離到22個抗癌活性成分[3-5]。草苔蟲內(nèi)酯bryostatin系列成分，具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用[6]，其中，bryostatin 1對于阿爾茨海默癥和許多癌癥更有著顯著的療效，是草苔蟲內(nèi)酯中最有希望成藥的抗癌藥物來源[7-11]。目前，該活性成分已經(jīng)被美國食品與藥品管理局批準進入臨床 Ⅱ 期試驗[12]。然而，bryostatin 1只在美國的東太平洋沿岸等海域生長的多室草苔蟲中發(fā)現(xiàn)[4]，從中國沿海生長的多室草苔蟲中卻一直未能成功分離。類似的由于多室草苔蟲生長地點的地域性差別而造成活性產(chǎn)物不同的現(xiàn)象在世界其他地方也同樣存在[4，13]，在中國范圍內(nèi)，從生長于不同地方的多室草苔蟲中提取得到的草苔蟲內(nèi)酯亦存在一定差異[4]，但其影響因素是來源于內(nèi)在的遺傳差異還是外在的環(huán)境因子目前尚不得知。而關(guān)于這種重要藥源生物的生物地理學和群體遺傳學的研究至今仍少有報道。因此，開展中國沿海多室草苔蟲的群體遺傳分化研究不僅可為類似污損生物的擴散方式研究提供借鑒，亦可為該重要藥源生物的種質(zhì)資源保護及其活性產(chǎn)物研發(fā)提供必要參考。

線粒體DNA(mtDNA)已被眾多學者證實其在海洋生物群體遺傳學研究中的適用性[14-17]。而SLAF-seq作為一種基于限制性酶切的簡化基因組新技術(shù)，目前已經(jīng)廣泛應用在全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)、遺傳圖譜構(gòu)建及QTL定位、群體遺傳進化分析和基因組選擇等領(lǐng)域[18-21]。本研究同時采用線粒體DNA控制區(qū)(D-loop)片段和SLAF-seq技術(shù)對中國沿海多室草苔蟲的群體遺傳分化開展研究，研究結(jié)果對深入了解這種重要藥源生物在我國的資源狀況及種群分化具有重要意義。

2 材料與方法

2.1 樣品采集與DNA提取

根據(jù)中國多室草苔蟲的分布范圍及可能存在的地理阻隔特征，本研究采集了4個地理群體共104個個體(表1)，分別來自于三亞(SY)、深圳(SZ)、廈門(XM)和溫州(WZ)(圖1)。所有個體都根據(jù)《中國海洋污損苔蟲生物學》一書中的分類檢索表進行鑒定。樣品用無菌海水清洗3次后，置于95%的乙醇中固定，-20℃保存。

DNA的提取參考孫名安等[22]關(guān)于苔蘚動物基因組DNA的提取方法。提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2線粒體DNA控制區(qū)片段克隆和遺傳多樣性分析

根據(jù)GenBank上的多室草苔蟲線粒體全基因組序列(序列號：NC_010197)，利用Primer Premier 5軟件設計擴增D-loop片段的引物。引物F-bncn序列為5′-CTAATTTCTCACCCTTATTC-3′，引物R-bncn序列為5′-GTTGGTTGGCTGACACTT-3′。

圖1 多室草苔蟲采樣地點示意圖Fig.1 Sampling localities of B. neritina

PCR的反應體系為25 μL，其中包括10×反應緩沖液(Mg2+)2.5 μL， 引物 (10 μmol/L)各0.5 μL，Taq酶(2.5 U/μL) 0.2 μL， DNA 模板(100 ng/μL)1 μL， dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL， ddH2O 18.3 μL。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用TaKaRa DNA Fragment Purification kit純化后進行凝膠電泳檢測，擴增結(jié)果良好的樣品送至北京六合華大基因科技股份公司進行測序。

測序結(jié)果使用Sequencher 4.1.4軟件進行比對和校正，使用DnaSP 5.0軟件[23]統(tǒng)計單倍型數(shù)目，并計算單倍型多樣性和核苷酸多樣性。使用Network 5.0.0.0軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡圖。采用 Tajima′sD和Fu′sFs中性檢驗以及核苷酸不配對分布來檢測多室草苔蟲群體的歷史動態(tài)。

2.3 SLAF-seq簡化基因組測序

2.3.1 酶切建庫

選取紫色球海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)基因組作為參考基因組進行酶切預測。根據(jù)最優(yōu)酶切方案，從三亞(SY)、深圳(SZ)、廈門(XM)和溫州(WZ)群體中各隨機選取12個樣品對其基因組DNA進行酶切，對得到的SLAF標簽3′端進行加A處理，連接Dual-index測序接頭后PCR擴增，純化，產(chǎn)物混樣處理后切膠回收目的大小片段的產(chǎn)物。

2.3.2 高通量測序及測序片段質(zhì)量檢驗和分析

文庫構(gòu)建成功質(zhì)檢合格后用Illumina HiSeq 2500進行測序。選取擬南芥(Arabidopsisthalianaecotype Columbia)參與酶切和測序作為對照。利用Dual-index對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行識別，得到各個樣品的reads。過濾掉測序reads的接頭后，對其進行GC含量和Q30分析，以評估測序質(zhì)量和數(shù)據(jù)量。通過對照的數(shù)據(jù)評估選取的酶切方案的酶切效率，判斷實驗的準確性和有效性。

2.3.3SLAF標簽的獲得和全基因組范圍SNP標記的開發(fā)

根據(jù)序列相似度對各個樣品的reads進行聚類，聚類到一起的reads來源于同一個SLAF標簽，同一個SLAF標簽在不同樣品間的序列相似度要遠高于不同SLAF標簽間的相似度。一個SLAF標簽在不同樣品間有差異即可定義為多態(tài)性SLAF標簽。根據(jù)具有多態(tài)性的SLAF標簽尋找SNP位點。

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于線粒體DNA控制區(qū)片段的測序結(jié)果，使用MEGA 5.0軟件[24]計算群體內(nèi)和群體間基于Kimura 2-parameter的遺傳距離，并采用鄰接法構(gòu)建單倍型的系統(tǒng)進化樹，設定重復抽樣1 000次以檢驗單倍型關(guān)系樹各分枝的置信度。使用Arlequin 3.5.1.2軟件[25]中的分子方差分析(AMOVA)估算遺傳變異的分布和固定系數(shù)Fst，1 000次隨機重復抽樣后進行顯著性檢驗。

從SLAF-seq技術(shù)開發(fā)得到的分子標記中，選取群體內(nèi)具有代表性的高質(zhì)量(篩選標準為MAF>0.05)的SNP位點開展群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。使用MEGA 5軟件[24]，運用neighbor-joining算法[26]，構(gòu)建群體的進化樹。使用structure軟件[27]和admixture軟件[28]，分別假設樣品的分群數(shù)(K值)為1～10，進行聚類，通過交叉驗證確定分群數(shù)為何時驗證結(jié)果的錯誤率ΔK最低，以ΔK值最低的分群作為最佳分群數(shù)。使用cluster軟件[29]，進行主元成分分析(Principal components analysis， PCA)分析，通過樣品間的接近程度輔助進化分析。

3 結(jié)果

3.1 基于線粒體控制區(qū)序列的結(jié)果

3.1.1 遺傳多樣性分析和單倍型統(tǒng)計

共檢測到10個多態(tài)簡約信息位點和11個核苷酸變異位點，定義了8個單倍型。單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)分別為0.130 7和0.000 7，顯示其多樣性水平較低。各個群體的遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計情況見表1。

單倍型網(wǎng)絡圖如圖2所示。Hap 1是所有群體共享的主單倍型。Hap 5、Hap 6、Hap 7這3個單倍型均是三亞群體的獨有單倍型，且數(shù)量僅有1個。

4個群體D-loop片段的單倍型NJ系統(tǒng)樹，如圖3所示。從圖中可以看出進化枝主要分為兩支，但兩進化枝之間枝長均較短。

3.1.2 群體歷史動態(tài)

各群體和總體的Fu′sFs和Tajima′sD中性檢驗結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，除了三亞群體的Fu′sFs中性結(jié)果為正值外，其他的都為負值，然而除了深圳群體的結(jié)果為顯著以外，其他群體和總體的中性檢驗結(jié)果都不顯著。4個群體的核苷酸不配對分析和吻合度分析見表2，根據(jù)核苷酸不配對分析結(jié)果所做的核苷酸不配對分布曲線如圖4所示。結(jié)果顯示，4個群體的核苷酸不配對分布曲線都不是典型的單峰分布，說明多室草苔蟲在歷史上可能并未發(fā)生過大規(guī)模擴張事件。

表1 不同群體的遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計

圖2 多室草苔蟲4個群體的單倍型網(wǎng)絡圖Fig.2 Haplotype network of 4 B. neritina populations

圖3 多室草苔蟲4個群體的D-loop片段的單倍型NJ系統(tǒng)樹Fig.3 Neighbor-joining tree of D-loop sequence haplotypes from 4 B. neritina populations

群體中性檢驗核苷酸不配對分析吻合度檢驗Tajima′sD檢驗Fu′sFs檢驗τθ0θ1SSDRaggedness指數(shù)溫州-11647-079433000000000013223000010061728廈門-11424-12648?3000000000006855000001076953深圳-11401?-12903?3000000000006611000001077594三亞-07967064513000000000033604007064043347總體-10610-067613000000000015073001769064906

注：τ 用突變單位表示的種群擴張時間，θ0種群開始擴張前大小，θ1種群擴張后大??；數(shù)值右上方的*號表示結(jié)果顯著。

圖4 多室草苔蟲4個群體D-loop序列核苷酸不配對分布圖Fig.4 Mismatch distribution for D-loop sequences of 4 B. neritina populations

3.2 基于SLAF-seq簡化基因組的結(jié)果

3.2.1 SLAF建庫評估

根據(jù)對參考基因組序列的電子酶切結(jié)果，確定最佳的限制性內(nèi)切酶組合為HinCII+EcoRV-HF?，酶切長度在314～344 bp的序列定義為SLAF標簽，預測可得到14 540個SLAF標簽。另外，擬南芥的酶切片段雙端比對效率為79.21%，表明比對效率基本正常；酶切效率為99.21%，表明酶切反應正常。綜上所述，本實驗SLAF建庫正常。

3.2.2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與評估

為保證后續(xù)生物信息學分析質(zhì)量，實驗采用去掉接頭后讀長的80 bp×2作為后續(xù)的數(shù)據(jù)評估和分析數(shù)據(jù)。各樣品經(jīng)測序共獲得11.93 M的reads數(shù)據(jù)，每個樣品的總測序讀長74 430～735 578 bp不等。各樣品的GC含量35.09%～48.85%，達到測序要求；來自所有樣品的個體堿基測序評估的指標Q30比例80.01%～91.16%，所有樣品Q30比例都在80%以上，說明測序過程中堿基錯誤率低，獲得的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量合格可信。

3.2.3 SLAF標簽的開發(fā)和SNP信息統(tǒng)計

實驗中針對所有樣品共開發(fā)得到214 409個SLAF標簽，樣品的平均測序深度為10.29×。根據(jù)等位基因數(shù)和基因序列之間的差異進行多態(tài)性分析，共得到23 437個多態(tài)性SLAF標簽，比例為10.93%；190 972個非多態(tài)性的SLAF標簽，比例為89.07%。利用得到的多態(tài)性SLAF標簽共開發(fā)出99 432個SNP位點。

3.3 多室草苔蟲群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于控制區(qū)序列的4個群體的遺傳距離，如表3所示。從中可以看出，群體內(nèi)遺傳距離的大小比較為三亞(0.002 82)>溫州(0.000 16)>深圳(0.000 09)=廈門(0.000 09)，而群體間的遺傳距離范圍為0.000 09～0.001 62。整體來看，群體間的遺傳距離水平低于群體內(nèi)的遺傳距離，沒有顯著的遺傳結(jié)構(gòu)。但是，三亞群體與另外3個群體之間的遺傳距離相對較遠。

注：*為群體內(nèi)Kimura 2-parameter遺傳距離。

基于控制區(qū)序列的4個群體的遺傳分化，其結(jié)果如表4所示。Wright[30]曾經(jīng)提出了關(guān)于遺傳分化指數(shù)的大小和分化程度的解釋，他認為Fst值小于0.05時，群體間遺傳分化程度很低；在0.05～0.15之間表明群體遺傳分化達中等水平。由基于D-loop片段序列的數(shù)據(jù)可知，三亞群體對另外3個群體的Fst值均高于0.05，且三亞對深圳和三亞對廈門的Fst分析均顯示差異顯著。這說明三亞群體相對于另外3個群體可能存在一定的遺傳分化。

表4 多室草苔蟲4個群體的遺傳分化

注：對角線以下群體間Fst值；對角線以上基于Fst值的顯著性分析(以P<0.05為標準)結(jié)果差異顯著為“+”，反之為“-”。

將三亞群體和另外3個群體分別歸為1個群組進行AMOVA分析，結(jié)果如表5所示。可以看出，有22.75%的變異來自群組間，而79.70%的變異來自群體內(nèi)，而群體間、群組間固定系數(shù)Fst和Fct分別為0.095 12和0.227 47，說明三亞群體和其他群體間存在較大的遺傳差異。

表5 多室草苔蟲群組間的AMOVA分析

基于SNP位點的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。由圖可知，系統(tǒng)發(fā)育樹呈現(xiàn)出與分布地點不相關(guān)的散狀分枝，說明各群體之間的遺傳分化并不明顯。

基于SNP位點的群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果顯示，來自不同地點的群體的最佳分群數(shù)為1(圖6，圖7)，這表明所有多室草苔蟲均屬于同一個群體。PCA分析結(jié)果(圖8)則顯示，來自溫州、廈門、深圳的樣品比較接近，而來自三亞的樣品與其他地點的樣品較為疏遠。

4 討論

4.1多室草苔蟲的遺傳多樣性水平和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

物種的遺傳多樣性水平與其適應和生存的能力以及進化的潛力密切相關(guān)[31]。基于線粒體控制區(qū)序列的結(jié)果表明，我國的多室草苔蟲群體的單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)均處于較低水平。當種群的h值和π值都較低時(h<0.5，π<0.005)，說明該種群的遺傳多樣性水平較低，有可能在進化過程中經(jīng)歷了瓶頸效應(bottleneck effect)或者是奠基者效應(founder effect)[32]。群體歷史動態(tài)結(jié)果也顯示多室草苔蟲在歷史上沒有發(fā)生過顯著的擴張行為。基于SLAF-seq的群體遺傳分化分析結(jié)果顯示，只有約10%的SLAF標簽是多態(tài)性的，這同樣表明該物種的遺傳多樣性水平較低。由此，基于線粒體DNA和SLAF-seq的群體遺傳分化結(jié)果都一致表明，多室草苔蟲的遺傳多樣性處于較低的水平，這也與其他學者對世界范圍內(nèi)多室草苔蟲的群體遺傳學研究中只發(fā)現(xiàn)了1種COⅠ單倍型的結(jié)果相吻合[33]。

圖5 基于SNP位點的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on SNP loci

圖6 分群數(shù)為1～10的聚類圖Fig.6 Dendrogram of clustering from 1-10

圖7 ΔK值分布圖Fig.7 Scattergram of ΔK value

圖8 PCA聚類分析圖Fig.8 PCA clustering analysis

群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，4個不同地點的多室草苔蟲之間未檢測到顯著的遺傳結(jié)構(gòu)，故應屬于同一個群體。導致生物群體遺傳結(jié)構(gòu)同質(zhì)化的原因有很多，對于海洋生物而言，其自身的生活史與擴散能力、海洋水文環(huán)境條件和理化因素、生境的連續(xù)性等，都是有可能影響其遺傳結(jié)構(gòu)的重要因素[34]。

多室草苔蟲是固生的海洋動物，其完整生活史中只有幼蟲階段具有潛在的擴散能力，但幼蟲在海水中僅能自由游動1～2 h便會附著在固著基上[35-36]，其較差的擴散能力，限制了不同地點群體間的基因交流[37-38]。在憑借自身條件難以實現(xiàn)遠距離擴散的情況下，多室草苔蟲仍可以依靠艦船航行擴散。艦船航行使得依附在其表面的污損生物有可能克服其原本無法逾越的海洋陸地阻隔、溫度差別以及低鹽度的河口徑流等障礙，從而擴大種群的分布范圍[1]。然而，要實現(xiàn)上述目的污損生物還必須滿足以下條件：(1)能經(jīng)受艦船快速航行和波浪沖擊；(2)能抵御溫度、鹽度等環(huán)境條件的急劇變化；(3)能在新環(huán)境里進行有性生殖[39]。對多室草苔蟲而言，其直立生長和鈣化程度較低的群體特性不利于應對艦船快速航行和波浪沖擊，但其幼蟲附著變態(tài)后幼體生長發(fā)育迅速，形成初蟲直立生長至群體第四次分歧僅需30 d，因此，多室草苔蟲仍然可借助附著在艦船底部進行有效的長距離擴散[1]。另外一方面，作為一種常見的污損生物，多室草苔蟲對棲息環(huán)境的適應范圍較廣，在半裸露的巖石、浮標、棧橋、漁排、船底、海帶和石花菜表面等地方均可大量生長[1]，在擴散到新的環(huán)境后有能力生存下來。

綜上所述，多室草苔蟲廣泛的擴散行為和對環(huán)境較好的適應性可以使不同群體間保持頻繁的基因交流，在一定程度上使基因庫趨于同質(zhì)化，同時抵消了選擇壓力下對特定遺傳變異的保留[40]，進而影響群體的遺傳多樣性水平并阻礙群體遺傳結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。

4.2SLAF-seq應用在多室草苔蟲群體遺傳分化研究中的可行性和優(yōu)勢

目前，SLAF-seq技術(shù)已經(jīng)在各個領(lǐng)域的研究中成功開發(fā)出眾多分子標記[41]。對于沒有參考基因組的物種，如鯉魚等，SLAF-seq也能進行SNP位點的挖掘[42]；對于基因組序列組成高度雜合的物種，如牡丹、茶樹、胡桃等，在沒有參考基因組序列的情況下，SLAF-seq可以通過先進行電子酶切設計方案再測序的方式，實現(xiàn)分子標記的大規(guī)模開發(fā)[43-45]；而對于多態(tài)率低的物種，如大豆等，SLAF-seq大規(guī)模開發(fā)分子標記的能力也得到過檢驗[18]。因此，盡管目前由于沒有多室草苔蟲及其近緣物種的基因組序列可供參考，無法了解其基因組的復雜程度和組成特性，但是根據(jù)SLAF-seq技術(shù)在其他諸多物種上的成功實踐案例，我們依然可以將其用于多室草苔蟲全基因組范圍內(nèi)SNP位點的開發(fā)。

分子標記開發(fā)的結(jié)果顯示，實際開發(fā)出的SLAF標簽數(shù)遠高于用電子酶切預測的結(jié)果，同時做到了對所有樣品的深度覆蓋。10.29×的覆蓋率，不僅高于預期的5×，同時也確保了堿基讀取的準確性和SNP位點的有效性。另外，獲得的SLAF標簽中沒有重復性標簽，而只有多態(tài)性標簽和非多態(tài)性標簽。由于缺乏參考基因組信息，無法排除多室草苔蟲基因組本身重復序列比例較低的可能性；但是事先通過電子酶切來預測最優(yōu)酶切方案，顯然對于研究結(jié)果中重復性標簽的杜絕和分子標記挖掘效率的提升起到了重要的作用。最終開發(fā)出的99 432個分子標記，數(shù)量可觀，并實現(xiàn)了在全基因組范圍內(nèi)的高密度均勻覆蓋，因此完全可以用于后續(xù)的群體遺傳分析。另外， SLAF-seq在遺傳多樣性水平和群體遺傳結(jié)構(gòu)方面，呈現(xiàn)出與線粒體DNA序列相一致的結(jié)果，這也從另一個側(cè)面證明了，SLAF-seq技術(shù)完全可以應用于包括多室草苔蟲在內(nèi)的海洋生物群體遺傳分化研究。

作為一種生物信息學分析輔助的基于酶切的簡化基因組技術(shù)，SLAF-seq有著(1)不受參考基因組限制，可以應用于各種非模式生物；(2)對SLAF標簽的深度測序可以保證基因分型的高度準確性；(3)對目標基因組簡化代表的策略顯著降低了測序成本；(4)酶切方案靈活，能夠有效避開重復序列，優(yōu)化了分子標記的挖掘效率；(5)開發(fā)的SNP分子標記性價比高，穩(wěn)定性好，在基因組中分布均勻；(6)雙端barcode接頭的系統(tǒng)非常適合大群體研究等諸多優(yōu)勢[42，46]。特別是相較于其他傳統(tǒng)的分子標記，如線粒體DNA等，SLAF-seq有著高出幾個數(shù)量級的分子標記數(shù)目。另外，由于在全基因組范圍內(nèi)的高密度均勻覆蓋，而非其它分子標記僅僅來源于基因組的局部有限范圍，如線粒體基因組等，SLAF-seq在群體研究中有著更精細的分辨率，因而能傳遞出更多的遺傳信息。在本研究中，盡管兩種技術(shù)手段的結(jié)果基本一致，但是相較于線粒體控制區(qū)序列結(jié)果中的8個單倍型，SLAF-seq從來源相同、樣品數(shù)目卻更少的4個群體中共得到99 432個SNP位點，其呈現(xiàn)出的有關(guān)遺傳變異的信息量顯然更為豐富和準確，因此，能夠更加全面和深入地反映多室草苔蟲的群體遺傳結(jié)構(gòu)和群體遺傳分化水平。另外，SLAF-seq在群體遺傳學研究中對每個群體的樣品數(shù)量要求較低，在綜合考慮研究結(jié)果的準確性和測序成本的前提下，通常只需要10～15個，較線粒體DNA等傳統(tǒng)分子標記所需的30～50個而言大幅減少，在一定程度上降低了采樣成本和難度。由此可見，相較于線粒體DNA等傳統(tǒng)分子標記，SLAF-seq技術(shù)在群體遺傳分化研究中有著無可比擬的巨大技術(shù)優(yōu)勢。

[1] 劉錫興， 尹學明， 馬江虎. 中國海洋污損苔蟲生物學[M]. 北京: 科學出版社， 2001: 79-467.

Liu Xixing， Yin Xueming， Ma Jianghu. Biology of Marine-fouling Bryozoans in the Coastal Waters of China[M]. Beijing: Science Press， 2001: 79-467.

[2] 林厚文， 易楊華， 姚新生， 等. 中國南?？偤喜萏οx抗癌活性成分研究(Ⅳ) Bryostatin 8， 16的分離與結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 中國海洋藥物， 2001， 20(4): 1-6.

Lin Houwen， Yi Yanghua， Yao Xinsheng， et al. Studies on antineoplastic constituents from marine bryozoanBugulaneritinainhabiting South China Sea (Ⅳ): isolation and structural elucidation of bryostatins 8 and 16[J]. Chinese Journal of Marine Drugs， 2001， 20(4): 1-6.

[3] 林厚文， 易楊華， 姚新生， 等. 中國南海總合草苔蟲抗癌活性成分研究——Ⅱ總草苔蟲內(nèi)酯的超強抗癌活性[J]. 中國海洋藥物， 2000， 19(2): 1-3.

Lin Houwen， Yi Yanghua， Yao Xinsheng， et al. Studies on the antineoplastic constituents from marine bryozoanBugulaneritinainhabiting South China Sea (Ⅱ): remarkable antineoplastic activities of active principals[J]. Chinese Journal of Marine Drugs， 2000， 19(2): 1-3.

[4] Lei Hui， Zhou Xuefeng， Yang Yaling， et al. Bryostatins from South China Sea bryozoanBugulaneritinaL.[J]. Biochemical Systematics and Ecology， 2010， 38(6): 1231-1233.

[5] Lopanik N， Gustafson K R， Lindquist N. Structure of bryostatin 20: a symbiont-produced chemical defense for larvae of the host bryozoan，Bugulaneritina[J]. Journal of Natural Products， 2004， 67(8): 1412-1414.

[6] 孫鵬， 李玲， 易楊華， 等. 總合草苔蟲中抗癌活性成分的提取和含量測定[J]. 第二軍醫(yī)大學學報， 2002， 23(3): 240-242.

Sun Peng， Li Ling， Yi Yanghua， et al. Extraction and quantitative determination of antineoplastic constituents inBugulaneritinaL.[J]. Academic Journal of Second Military Medical University， 2002， 23(3): 240-242.

[7] Kraft A S， Smith J B， Berkow R L. Bryostatin， an activator of the calcium phospholipid-dependent protein kinase， blocks phorbol ester-induced differentiation of human promyelocytic leukemia cells HL-60[J]. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America， 1986， 83(5): 1334-1338.

[8] Kuzirian A M， Epstein H， Gagliardi C J， et al. Bryostatin enhancement of memory inHermissenda[J]. The Biological Bulletin， 2006， 210(3): 201-214.

[9] Parkinson D R， Arbuck S G， Moore T， et al. Clinical development of anticancer agents from natural products[J]. Stem Cells， 1994， 12(1): 30-43.

[10] Sun Miaokun， Alkon D L. Bryostatin-1: pharmacology and therapeutic potential as a CNS drug[J]. CNS Drug Reviews， 2006， 12(1): 1-8.

[11] Sun Miaokun， Alkon D L. Dual effects of bryostatin-1 on spatial memory and depression[J]. European Journal of Pharmacology， 2005， 512(1): 43-51.

[12] 林厚文， 易楊華， 李文林， 等. 中國南?？偤喜萏οx中新的抗癌活性成分Bryostatin19[J]. 中國海洋藥物， 1998， 17(1): 1-3.

Lin Houwen， Yi Yanghua， Li Wenlin， et al. Bryostatin 19: a new antineoplastic component fromBugulaneritinain the South China Sea[J]. Chinese Journal of Marine Drugs， 1998， 17(1): 1-3.

[13] Pettit G R， Kamano Y， Herald C L， et al. Isolation and structure of bryostatins 5-7[J]. Canadian Journal of Chemistry， 1985， 63(6): 1204-1208.

[14] 曹艷， 章群， 宮亞運， 等. 基于線粒體COⅠ序列的中國沿海藍點馬鮫遺傳多樣性[J]. 海洋漁業(yè)， 2015， 37(6): 485-493.

Cao Yan， Zhang Qun， Gong Yayun， et al. Genetic variation ofScomberomorusniphoniusin the coastal waters of China based on mt DNA COⅠ sequences[J]. Marine Fisheries， 2015， 37(6): 485-493.

[15] 劉若愚， 孫忠民， 姚建亭， 等. 中國近海重要生態(tài)建群紅藻真江蘺的群體遺傳多樣性[J]. 生物多樣性， 2016， 24(7): 781-790.

Liu Ruoyu， Sun Zhongmin， Yao Jianting， et al. Genetic diversity of the habitat-forming red algaGracilariavermiculophyllaalong Chinese coasts[J]. Biodiversity Science， 2016， 24(7): 781-790.

[16] Guo Xiang， Zhao Dan， Jung D， et al. Phylogeography of the rock shellThaisclavigera(Mollusca): evidence for long-distance dispersal in the northwestern Pacific[J]. PLoS One， 2015， 10(7): e0129715.

[17] Wang Jie， Tsang L M， Dong Yunwei. Causations of phylogeographic barrier of some rocky shore species along the Chinese coastline[J]. BMC Evolutionary Biology， 2015， 15: 114.

[18] Li Bin， Tian Ling， Zhang Jingying， et al. Construction of a high-density genetic map based on large-scale markers developed by specific length amplified fragment sequencing (SLAF-seq) and its application to QTL analysis for isoflavone content inGlycinemax[J]. BMC Genomics， 2014， 15: 1096.

[19] Wang Wenhao， Zhang Tao， Zhang Genxi， et al. Genome-wide association study of antibody level response to NDV and IBV in Jinghai yellow chicken based on SLAF-seq technology[J]. Journal of Applied Genetics， 2015， 56(3): 365-373.

[20] 陳士強， 秦樹文， 黃澤峰， 等. 基于SLAF-seq技術(shù)開發(fā)長穗偃麥草染色體特異分子標記[J]. 作物學報， 2013， 39(4): 727-734.

Chen Shiqiang， Qin Shuwen， Huang Zefeng， et al. Development of specific molecular markers forThinopyrumelongatumchromosome using SLAF-seq technique[J]. Acta Agronomica Sinica， 2013， 39(4): 727-734.

[21] 蘇文瑾， 趙寧， 雷劍， 等. 基于SLAF-seq技術(shù)的甘薯SNP位點開發(fā)[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2016， 49(1): 27-34.

Su Wenjin， Zhao Ning， Lei Jian， et al. SNP sites developed by specific length amplification fragment sequencing (SLAF-seq) in Sweetpotato[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2016， 49(1): 27-34.

[22] 孫名安， 吳志剛， 申欣， 等. 頸鏈血苔蟲線粒體基因組的測定及其系統(tǒng)發(fā)育學意義[J]. 漁業(yè)科學進展， 2010， 31(1): 89-94.

Sun Ming’an， Wu Zhigang， Shen Xin， et al. The complete mitochondrial genome ofWatersiporasubtorquataand its phylogenetic significance[J]. Progress in Fishery Sciences， 2010， 31(1): 89-94.

[23] Librado P， Rozas J. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics， 2009， 25(11): 1451-1452.

[24] Tamura K， Peterson D， Peterson N， et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood， evolutionary distance， and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution， 2011， 28(10): 2731-2739.

[25] Excoffier L， Lischer H E L. Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows[J]. Molecular Ecology Resources， 2010， 10(3): 564-567.

[26] Saitou N， Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology and Evolution， 1987， 4(4): 406-425.

[27] Evanno G， Regnaut S， Goudet J. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study[J]. Molecular Ecology， 2005， 14(8): 2611-2620.

[28] Alexander D H， Novembre J， Lange K. Fast model-based estimation of ancestry in unrelated individuals[J]. Genome Research， 2009， 19(9): 1655-1664.

[29] de Hoon M J L， Imoto S， Nolan J， et al. Open source clustering software[J]. Bioinformatics， 2004， 20(9): 1453-1454.

[30] Wright S. The genetical structure of populations[J]. Annals of Eugenics， 1949， 15(1): 323-354.

[31] 牛素芳， 蘇永全， 王軍， 等. 福建近海藍圓鲹群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[J]. 廈門大學學報：自然科學版， 2012， 51(4): 759-766.

Niu Sufang， Su Yongquan， Wang Jun， et al. Population genetic structure analysis ofDecapterusmaruadsifrom Fujian coastal waters[J]. Journal of Xiamen University：Natural Science， 2012， 51(4): 759-766.

[32] Grant W A S， Bowen B W. Shallow population histories in deep evolutionary lineages of marine fishes: insights from sardines and anchovies and lessons for conservation[J]. Journal of Heredity， 1998， 89(5): 415-426.

[33] Mackie J A， Keough M J， Christidis L. Invasion patterns inferred from cytochrome oxidase Ⅰ sequences in three bryozoans，Bugulaneritina，Watersiporasubtorquata， andWatersiporaarcuata[J]. Marine Biology， 2006， 149(2): 285-295.

[34] 張麗艷. 臺灣海峽三種中上層魚類遺傳多樣性的AFLP分析[D]. 廈門: 廈門大學， 2011.

Zhang Liyan. Genetic diversity of three pelagic fishes in the Taiwan Strait， inferred by AFLP fingerprinting[D]. Xiamen: Xiamen University， 2011.

[35] Dahms H U， Dobretsov S， Qian Peiyuan. The effect of bacterial and diatom biofilms on the settlement of the bryozoanBugulaneritina[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology， 2004， 313(1): 191-209.

[36] Wendt D E. Energetics of larval swimming and metamorphosis in four species ofBugula(Bryozoa)[J]. The Biological Bulletin， 2000， 198(3): 346-356.

[37] Keough M J. Dispersal of the bryozoanBugulaneritinaand effects of adults on newly metamorphosed juveniles[J]. Marine Ecology Progress Series， 1989， 57: 163-171.

[38] Wendt D E. Effect of larval swimming duration on success of metamorphosis and size of the ancestrular lophophore inBugulaneritina(Bryozoa)[J]. The Biological Bulletin， 1996， 191(2): 224-233.

[39] 黃宗國， 蔡如星. 海洋污損生物及其防除[M]. 北京: 海洋出版社， 1984: 1-352.

Huang Zongguo， Cai Ruxing. Marine Fouling and Its prevention[M]. Beijing: China Ocean Press， 1984: 1-352．

[40] Guo Baocheng， de Faveri J， Sotelo G， et al. Population genomic evidence for adaptive differentiation in Baltic Sea three-spined sticklebacks[J]. BMC Biology， 2015， 13: 19.

[41] Wei Qingzhen， Wang Yunzhu， Qin Xiaodong， et al. An SNP-based saturated genetic map and QTL analysis of fruit-related traits in cucumber using specific-length amplified fragment (SLAF) sequencing[J]. BMC Genomics， 2014， 15: 1158.

[42] Sun Xiaowen， Liu Dongyuan， Zhang Xiaofeng， et al. SLAF-seq: an efficient method of large-scaledenovoSNP discovery and genotyping using high-throughput sequencing[J]. PLoS One， 2013， 8(3): e58700.

[43] Cai Changfu， Cheng Fangyun， Wu Jing， et al. The first high-density genetic map construction in tree peony (PaeoniaSect.Moutan) using genotyping by specific-locus amplified fragment sequencing[J]. PLoS One， 2015， 10(5): e0128584.

[44] Ma Jianqiang， Huang Long， Ma Chunlei， et al. Large-scale SNP discovery and genotyping for constructing a high-density genetic map of tea plant using specific-locus amplified fragment sequencing (SLAF-seq)[J]. PLoS One， 2015， 10(6): e0128798.

[45] Zhu Yufeng， Yin Yanfei， Yang Keqiang， et al. Construction of a high-density genetic map using specific length amplified fragment markers and identification of a quantitative trait locus for anthracnose resistance in walnut (JuglansregiaL.)[J]. BMC Genomics， 2015， 16: 614.

[46] Zheng Wenjing， Li Zhiqiang， Zhao Jiaming， et al. Study of the long-distance migration of small brown planthoppersLaodelphaxstriatellusin China using next-generation sequencing[J]. Pest Management Science， 2016， 72(2): 298-305.

Population genetic variation study of Bugula neritina in coastal waters of China

Li Hai1，2，Liu Qiaohong2，Tang Xueying2，Chen Wuge3，Ding Shaoxiong2

(1.LaboratoryofMarineBiologyandEcology，ThirdInstituteofOceanography，StateOceanicAdministration，Xiamen361005,China; 2.FujianCollaborativeInnovationCenterforExploitationandUtilizationofMarineBiologicalResources，Xiamen361102,China; 3.XiamenOceanVocationalCollege，Xiamen361012,China)

We studied the genetic diversity and population genetic variation ofBugulaneritina，an important pharmaceutical organism，sampled from 4 distinct localities along China coastline by mitochondrial control region amplification and SLAF-seq. 8 haplotypes were detected in control region， haplotype diversity (h) and nucleotide diversity (π) were 0.130 7 and 0.000 7， respectively. No significant topological structure was found in haplotype network and NJ phylogenetic tree. Neutrality tests and mismatch distribution both suggested thatB.neritinadid not experience a range expansion.Fstand AMOVA analysis indicated that genetic variation mainly occurred within populations. SLAF library construction generated 214 409 SLAFs， among which 23 437 were polymorphic， 99 432 SNP loci were developed. Genetic distances among populations were short and even shorter than those within populations. Phylogenetic tree and population genetic analysis based on SNP data revealed that no significant genetic structure were observed among populations. In conclusion， genetic diversity ofB.neritinain coastal waters of China were low， and no significant genetic structure existed among geographically distinct populations. We assumed this was mainly attributed to bryozoan’s capability to disperse. In addition， our study validated the application and advantages of SLAF-seq in population genetic variation study of marine organisms．

Bugulaneritina; population genetic variation; mitochondrial DNA; SLAF-seq; reduced representation sequencing

10.3969/j.issn.0253-4193.2017.10.008

Q953+.1

：A

：0253-4193(2017)10-0090-11

2017-02-28；

：2017-06-15。

國家海洋局公益性項目“幾種重要海洋藥用生物種質(zhì)資源發(fā)掘、保藏和利用——重要海洋藥用生物優(yōu)良種質(zhì)評價和篩選”(201205024-2)。

李海(1988—)，男，江西省萍鄉(xiāng)市人，博士，主要從事海洋生物遺傳多樣性與進化研究。E-mail:lihai@tio.org.cn

*通信作者：丁少雄，教授，主要從事海洋生物資源保護與利用研究。E-mail:sxding@xmu.edu.cn

李海，劉巧紅，唐雪穎，等. 我國近岸多室草苔蟲(Bugulaneritina)的群體遺傳分化研究 [J].海洋學報，2017，39(10)：90—100，

Li Hai，Liu Qiaohong，Tang Xueying，et al. Population genetic variation study ofBugulaneritinain coastal waters of China[J]. Haiyang Xuebao，2017，39(10)：90—100， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2017.10.008