喬慧聰　任向波　吳秀麗

摘要：通過對(duì)煙草驅(qū)動(dòng)蛋白家族新成員NtTkr尾部的酵母雙雜交篩選，得到多個(gè)與NtTkr互作的候選蛋白。為進(jìn)一步驗(yàn)證NtTkr與候選蛋白之間的相互作用，以pGBKT7-NtTkr質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增煙草NtTKR全長(zhǎng)，將其克隆入原核表達(dá)載體pMXB10，重組質(zhì)粒pMXB10-NtTkr-3582經(jīng)生物公司測(cè)序，結(jié)果正確。將其轉(zhuǎn)化為BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)目的蛋白，經(jīng)幾丁質(zhì)法純化及SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果表明筆者得到了高純度的目的蛋白。該試驗(yàn)為進(jìn)一步運(yùn)用Pull Down確定NtTkr與候選蛋白之間的體外互作及深入研究該蛋白的其他生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：煙草；新驅(qū)動(dòng)蛋白；NtTkr；誘導(dǎo)表達(dá)；純化

中圖分類號(hào)： S572.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）14-0024-03

通過cDNA文庫差異篩選方法，成功分離出了一個(gè)新基因NtTKR（Nicotiana tabacum kinesin related protein），該基因是驅(qū)動(dòng)蛋白超家族中的一員。NtTkr與現(xiàn)已知的廣泛表達(dá)的多數(shù)植物的驅(qū)動(dòng)蛋白不同[1-3]，該基因僅在植物的葉和各發(fā)育時(shí)期的胚中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。這一特異表達(dá)模式說明它可能在胚胎發(fā)生及葉組織分化過程中具有獨(dú)特的功能[4-5]。

眾所周知，多數(shù)蛋白質(zhì)需與其他蛋白質(zhì)互作才能發(fā)揮其自身的作用。因此，為了解NtTkr這一新發(fā)現(xiàn)的蛋白的功能，通過對(duì)NtTkr尾部的酵母雙雜交篩選，得到多個(gè)與NtTkr互作的候選蛋白。

為進(jìn)一步運(yùn)用Pull-Down試驗(yàn)驗(yàn)證NtTkr與篩選的各候選蛋白之間能否相互作用，以含NtTKR全長(zhǎng)的pGBKT7-NtTkr質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增煙草NtTKR全長(zhǎng)，并將其克隆入IMPACT原核表達(dá)載體系統(tǒng)新成員pMXB10載體，得到重組質(zhì)粒pMXB10-NtTkr-3582，將其轉(zhuǎn)化為BL21（DE3），再經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、幾丁質(zhì)法純化及SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示了與預(yù)期相符的單一蛋白條帶，說明得到了高純度的純化NtTkr蛋白。該試驗(yàn)為進(jìn)一步運(yùn)用Pull-Down確定NtTkr與候選蛋白之間的體外互作及深入研究該蛋白的其他生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒

DH5α、BL21（DE3）菌株、原核表達(dá)載體pMXB10及含NtTKR全長(zhǎng)的pGBKT7-NtTkr質(zhì)粒由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2工具酶及試劑

PCR所用的KOD-plus高保真酶、10×KOD-緩沖液、dNTPs（濃度均為2 mmol/L）、25 mmol/L MgSO4，均購自ToYoBo公司；在TIANGEN公司購買PCR產(chǎn)物純化和DNA凝膠回收試劑盒；于TaKaRa公司購買T4 DNA連接酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker和限制性內(nèi)切酶；幾丁質(zhì)親和柱購自NEB公司；于Fermentas公司購買蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；其余試劑購于生工生物工程（上海）股份有限公司或Sigma公司。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒制備與SDS-PAGE

主要參照Sambrook的方法[6]。采用堿裂解法制備質(zhì)粒，CaCl2法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。SDS-PAGE：各蛋白樣品與等體積2×上樣緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L DTT，4% SDS，20%甘油，0.12%溴酚藍(lán)，pH值為6.8）混合，煮沸5～10 min后，13 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE。

1.2.2PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和鑒定

由北京三博遠(yuǎn)志生物工程公司合成引物，引物序列：正向KNs，5′-NNNNNNNCATATGTCAGAGAACAGATTC-3′，反向Kca，5′-NNNNNNNNGCGGCCGCNTATGCGTTCCTGGTAAATGGC-3′，以含NtTKR全長(zhǎng)的pGBKT7-NtTkr質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果正確后，用引物兩端引入的NdeⅠ和NotⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物，電泳回收NtTKR片段。

1.2.3原核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

pMXB10經(jīng)NdeⅠ和 NotⅠ 雙酶切，凝膠回收片段，于16 ℃下用T4 DNA連接酶連接該載體片段與NtTKR片段，16 h后得到連接產(chǎn)物。將該產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α超感細(xì)胞，經(jīng)篩選得到成功轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的DH5α，擴(kuò)大培養(yǎng)該細(xì)胞，然后提取質(zhì)粒，酶切鑒定質(zhì)粒，鑒定結(jié)果無誤后，將該重組質(zhì)粒PMXB10-NtTkr-3582送往北京三博遠(yuǎn)志生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)

將測(cè)序無誤的PMXB10-NtTkr-3582質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布在LB+50 mg/mL氨芐青霉素（Amp）培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，然后挑取單克隆至液體LB+Amp培養(yǎng)基中于37 ℃、180 r/min下過夜培養(yǎng)，次日按1 ∶[KG-*3]100稀釋菌液，37 ℃ 下培養(yǎng)4 h左右至其D600 nm為0.8時(shí)，分別經(jīng)0、0.06、01、0.6 mmol/L IPTG于37 ℃誘導(dǎo)4 h，取2 mL菌液，于 4 ℃、1 000 r/min 離心1 min，棄上清收集菌體。然后，分別加入 100 μL 去離子水和還原型2×SDS上樣緩沖液懸浮菌體，三者混勻后煮沸10 min，取15 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定[6]。

1.2.5目的蛋白的純化

目的蛋白的純化參照李芬等的方法[7-8]，主要步驟如下：（1）細(xì)胞粗提物的制備；（2）幾丁質(zhì)柱的平衡；（3）上樣；（4）洗柱；（5）內(nèi)含肽的自我裂解活性的誘導(dǎo)；（6）目的蛋白的洗脫釋放；（7）幾丁質(zhì)樹脂的再生。于 -70 ℃ 保存純化的目的蛋白。endprint

2試驗(yàn)結(jié)果

2.1煙草NtTkr基因全長(zhǎng)的克隆及酶切片段的回收

以pGBKT7-NtTkr質(zhì)粒為PCR擴(kuò)增模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到與NtTKR基因全長(zhǎng)大小相符的3 582 bp大小的擴(kuò)增帶（圖1）。NdeⅠ和NotⅠ酶切引入引物兩端的PCR產(chǎn)物，凝膠回收的NtTKR片段用于連接反應(yīng)。

2.2原核表達(dá)載體pMXB10-NtTkr-3582的構(gòu)建與鑒定

凝膠回收NdeⅠ和NotⅠ雙酶切后的pMXB10載體片段，該片段與“1.2.1”節(jié)同樣雙酶切的NtTKR片段在T4 DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化并雙酶切鑒定得到與預(yù)期相符的6 675 bp的載體片段和3 582 pb的NtTKR全長(zhǎng)（圖2），且測(cè)序無突變，這表明筆者已成功獲得正確的原核表達(dá)載體pMXB10-NtTkr-3582。

重組質(zhì)粒PMXB10-NtTkr-3582轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，轉(zhuǎn)化子經(jīng)0、0.06、0.1、0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后收集菌體，煮沸后經(jīng)12% SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，上述3個(gè)濃度的IPTG都可誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)分子量約160 ku的NtTkr與內(nèi)含肽的融合蛋白，其中 0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)物目的蛋白表達(dá)量最高（圖3）。

2.4目的蛋白的純化

由于目的蛋白NtTkr-3582與原核表達(dá)載體pMXB10上的內(nèi)含肽形成融合蛋白，而DTT可通過誘導(dǎo)激活內(nèi)含肽的肽鍵裂解活性使目標(biāo)蛋白從幾丁質(zhì)介質(zhì)上釋放出來，而內(nèi)含肽留在幾丁質(zhì)介質(zhì)上，從而純化目的蛋白。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，表達(dá)的NtTkr全長(zhǎng)經(jīng)過幾丁質(zhì)柱純化得到分子量約132.5 ku的目的蛋白單一條帶（圖4），與預(yù)期蛋白大小相符。

3討論

已知的植物驅(qū)動(dòng)蛋白多在不同組織中廣泛表達(dá)[1-3]，煙草[CM（25]新驅(qū)動(dòng)蛋白NtTkr卻僅在葉和各發(fā)育時(shí)期的胚中優(yōu)勢(shì)表達(dá)[4-5]。這一組織特異性表達(dá)模式說明它可能在胚胎發(fā)生及葉組織分化過程中具有獨(dú)特的功能。欲揭示一個(gè)未知蛋白的功能，篩選與之互作的蛋白質(zhì)極其重要，因?yàn)樯矬w內(nèi)幾乎所有的生命活動(dòng)即DNA的復(fù)制、基因的轉(zhuǎn)錄、蛋白的合成或信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等，都離不開蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。通過[CM（25]對(duì)煙草幼葉cDNA文庫的酵母雙雜交篩選，得到多個(gè)與NtTkr互作的候選蛋白。由于酵母雙雜交的局限性，假陽性的存在不可避免[9-11]，候選蛋白是否真的能夠與目的蛋白發(fā)生作用必須通過Pull-Down及CoIP或免疫共定位進(jìn)一步驗(yàn)證[12-14]。所以，本試驗(yàn)以pGBKT7-NtTkr質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增煙草NtTKR全長(zhǎng)，并將其克隆入原核表達(dá)載體pMXB10，轉(zhuǎn)入BL21（DE3），誘導(dǎo)其成功表達(dá)，為Pull-Down驗(yàn)證該蛋白與候選蛋白互作奠定基礎(chǔ)。

pMXB10是經(jīng)過優(yōu)化的IMPACT原核表達(dá)載體系統(tǒng)的新成員，攜帶有大腸桿菌mal E基因，含有1個(gè)小的蛋白剪切元件，即來自釀酒酵母（Saccharomyces scerevisiae）VMA1基因的內(nèi)含肽（Sce VMA內(nèi)含肽，50 ku）[15-16]。內(nèi)含肽標(biāo)簽中含有幾丁質(zhì)結(jié)合域，可以與幾丁質(zhì)珠結(jié)合，從而使融合有內(nèi)含肽與幾丁質(zhì)標(biāo)簽的目的蛋白得到純化。目前，已有蛋白質(zhì)工程的許多重要領(lǐng)域應(yīng)用了這種新型的蛋白融合表達(dá)及純化系統(tǒng)[7，17]，有諸多優(yōu)點(diǎn)，可非常方便地純化目的蛋白并獲得較高純度用于抗體制備的目的抗原[7-8]，因此本試驗(yàn)按照經(jīng)濟(jì)實(shí)用的原則，選用該系統(tǒng)的PMXB10用于NtTkr的表達(dá)和純化，以期獲得足夠的NtTkr蛋白用于體外確定其與候選蛋白是否存在真正的相互作用。

成功構(gòu)建重組原核表達(dá)載體PMXB10-NtTkr-3582后，將其轉(zhuǎn)化并誘導(dǎo)其表達(dá)。因?yàn)槟康牡鞍椎目扇苄?、穩(wěn)定性和表達(dá)量因蛋白而異，所以誘導(dǎo)表達(dá)條件須依實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。影響蛋白表達(dá)量的因素有培養(yǎng)時(shí)間、溫度及合適的IPTG工作濃度。為使蛋白達(dá)到較大的表達(dá)量，須找到合適的IPTG工作濃度。因此，在相同溫度和誘導(dǎo)時(shí)間條件下，設(shè)置4個(gè)IPTG濃度，蛋白電泳檢測(cè)結(jié)果表明，IPTG為0.1 mmol/L時(shí)的表達(dá)量比0.06 mmol/L時(shí)要大，但卻和0.6 mmol/L差別不大，表明IPTG工作濃度應(yīng)為0.1 mmol/L。因?yàn)楫?dāng)IPTG工作濃度達(dá)到0.1 mmol/L時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量不會(huì)隨著IPTG濃度的升高而升高，而濃度低于0.1 mmol/L，表達(dá)量卻會(huì)受到影響。

在37 ℃下，以最適濃度的IPTG大量誘導(dǎo)細(xì)胞，4 h后收集細(xì)胞，用DTT釋放目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，得到了與預(yù)期大小相符的NtTkr單一條帶，該高純度的目的蛋白利于以后的Pull-Down試驗(yàn)的進(jìn)行。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了煙草新驅(qū)動(dòng)蛋白NtTKR基因全長(zhǎng)和PMXB10載體大片段連接的融合表達(dá)載體并成功地誘導(dǎo)其高效表達(dá)，目的蛋白的成功表達(dá)和純化為進(jìn)一步研究NtTkr與候選蛋白之間的體外互作及深入研究該蛋白的其他生物學(xué)功能奠定了堅(jiān)實(shí)的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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