張曉舟　王祎玲

摘要：采用表型性狀和序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（簡(jiǎn)稱SRAP）分子標(biāo)記對(duì)香茶菜（Isodon japonica）不同海拔居群的遺傳多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：（1）香茶菜8個(gè)葉表型性狀在居群間和居群內(nèi)均存在顯著或極顯著差異，說明不同居群葉表型性狀存在明顯的變異；（2）香茶菜葉柄性狀的平均變異系數(shù)（CV，19.707%）>葉片性狀的平均變異系數(shù)（CV，9.905%），葉柄性狀穩(wěn)定性較低；（3）居群間平均表型分化系數(shù)（VST，69.89%）>居群內(nèi)平均表型分化系數(shù)（VST，30.11%），居群間變異是其主要的變異來源；（4）非加權(quán)組平均法（簡(jiǎn)稱UPGMA）聚類分析顯示，8個(gè)香茶菜居群分為三大類；（5）香茶菜居群具有較高的遺傳多樣性，平均多態(tài)位點(diǎn)數(shù)（NPL）、平均多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）、平均Shannon多樣性指數(shù)（I）分別為60.875、82.083%、0.387；（6）8個(gè)居群遺傳多樣性變化規(guī)律隨海拔的升高先增加后降低；（7）分子生物學(xué)方差分析（簡(jiǎn)稱AMOVA）顯示，居群間遺傳變異占總變異的75%，與表型性狀分析的主要變異來源一致；（8）聚類分析將8個(gè)居群分為3類，海拔相近的居群優(yōu)先聚類。

關(guān)鍵詞：香茶菜；表型性狀；SRAP；遺傳多樣性；霍山

中圖分類號(hào)： S567.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）14-0107-05

霍山位于山西省南部，是傳說中太岳山的主要高峰，位于太行山中部，屬于臨汾盆地的邊緣區(qū)域[1]。由于受暖溫帶大陸性氣候和東南季風(fēng)的影響嚴(yán)重，成為山西省乃至全國水熱條件相對(duì)較好的區(qū)域之一。

香茶菜（Isodon japonica）為唇形科（Labiatae）香茶菜屬（Isodon）植物，主要生長在非洲和亞洲，有150多種，在我國有90多種，山西、黑龍江、河南等20多個(gè)省內(nèi)都比較常見[2]。香茶菜是中國藥材，它具有健胃、解毒、抗癌、增加免疫等功效，被用于治療咽喉腫痛、肝炎、癌癥、感冒發(fā)熱、腹部脹痛等[3]。從開始研究香茶菜至今，很多研究者從香茶菜的提取產(chǎn)物中提煉出有用的化合物，并深入地分析了其藥理作用，很多文獻(xiàn)報(bào)道以及臨床等實(shí)踐證明香茶菜在保護(hù)心肌正常工作等方面具有非常重要的作用，同時(shí)香茶菜在保健防護(hù)方面市場(chǎng)潛力非常大[4-5]。由此可見，香茶菜已成為中國最重要的草本之一。然而，香茶菜遺傳多樣性方面的研究卻很少，甚至沒有關(guān)于香茶菜表型的研究。

為確保我國合理發(fā)展和最大限度地使用遺傳資源，有必要研究香茶菜的遺傳多樣性。另外，香茶菜種質(zhì)收集的遺傳多樣性和對(duì)群體結(jié)構(gòu)的了解在改善中國草本植物上有非常重要的功能。近年來，分子標(biāo)記技術(shù)日益發(fā)展，為野生植物遺傳多樣性研究提供了很多重要信息。在不同的分子標(biāo)記中，SRAP分子標(biāo)記對(duì)遺傳研究是最佳選擇，因?yàn)樗谥参锘蚪M中具有簡(jiǎn)單、高效、高重復(fù)性、共顯性的特征。目前，關(guān)于香茶菜的研究主要集中在化合物組成、藥理效果上。本研究的目標(biāo)是運(yùn)用表型標(biāo)記和SRAP分子標(biāo)記闡述香茶菜的遺傳多樣性。

因此，在本研究中，使用10對(duì)香茶菜SRAP引物和8個(gè)表型性狀決定山西省霍山不同海拔香茶菜的遺傳多樣性。

1材料與方法

1.1植物材料采集

2015年6月外出采集，選取山西省霍山不同海拔的香茶菜為研究對(duì)象，從1 300 m至2 000 m每隔100 m設(shè)立1個(gè)種群，共設(shè)立8個(gè)居群。為避免試驗(yàn)誤差，每個(gè)居群內(nèi)至少采集15個(gè)個(gè)體的葉片，保存在放有硅膠的密封袋中，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的研究[6]。

1.2葉表型性狀分析

評(píng)價(jià)8個(gè)居群香茶菜的表型多樣性，每個(gè)居群選取采樣完整、保存最好的15個(gè)個(gè)體進(jìn)行測(cè)量。在本試驗(yàn)中測(cè)量8個(gè)表型性狀，分別是葉長（LL）、葉片長（LML）、葉片寬（LW）、葉片長/寬（LLW）、葉柄長（LSL）、葉柄基部寬（LFW）、葉柄長/寬（LSLW）、葉片長/葉柄長（LLL）。

1.3DNA提取物

采用改良的CTAB法[7]提取DNA，在提取過程中，利用β-巰基乙醇的還原性，有效地遏制DNA提取過程對(duì)細(xì)胞造成的褐化反應(yīng)，大大降低了氧化損傷。抽提過程中，利用氯仿異戊醇除去蛋白質(zhì)。加入-20 ℃無水乙醇，靜置一段時(shí)間，待沉淀析出，即得到DNA提取物。采用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA提取物中DNA的純度。

1.4SRAP分析與電泳

SRAP擴(kuò)增在10 μL體系中進(jìn)行，使用10 ng基因組DNA、1×PCR buffer、2.0 mmol/L MgCl2、10.0 mmol/L dNTPs、5 μmol/L引物、1.0 U Taq DNA聚合酶。所用引物由博仕生物公司提供。

PCR擴(kuò)增項(xiàng)目的變性步驟為95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，保存于4 ℃。擴(kuò)增片段被20倍的水稀釋，6 μL稀釋產(chǎn)物與4 μL Loading-buffer混合。擴(kuò)增產(chǎn)物在1×TBE的6%變性甲叉雙丙烯酰胺凝膠中被檢測(cè)，1 500 V電泳120 min。通過使用銀染裝備使分離片段形象化。

1.5數(shù)據(jù)分析

1.5.1表型數(shù)據(jù)分析

上述8個(gè)表型性狀的巢式方差分析采用SPSS 17.0軟件完成[8]。種群間表型性狀的分化程度用表型分化系數(shù)（VST）表示[9]，表型分化系數(shù)=種群間方差分量/（種群間方差分量+種群內(nèi)方差分量）。表型性狀的離散程度用變異系數(shù)（CV）表示，變異系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值，即CV=S/X。采用NTSYSpc軟件的非加權(quán)組平均法（UPGMA）對(duì)表型性狀進(jìn)行聚類分析。其他相關(guān)數(shù)據(jù)處理使用Excel 5.0等程序進(jìn)行。

1.5.2遺傳數(shù)據(jù)分析

在篩選引物的過程中，選取穩(wěn)定性高、擴(kuò)增條帶清晰、易于分辨的引物組合。對(duì)SRAP引物擴(kuò)增出的片段進(jìn)行“0，1”標(biāo)記，將有帶處記為“1”，無帶處記為“0”。利用POPGENE 3.2版本軟件[10]，通過分析香茶菜的多態(tài)位點(diǎn)比率（PPB）、觀察等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon多樣性指數(shù)（I）、Neis基因多樣性指數(shù)（H），多態(tài)位點(diǎn)數(shù)（NPL）來證實(shí)香茶菜遺傳多樣性水平的遺傳參數(shù)[11]。應(yīng)用MEGA4軟件[12]對(duì)香茶菜不同海拔的8個(gè)居群進(jìn)行聚類分析。用GenALEx 6.4軟件[11]進(jìn)行分子生物學(xué)方差（簡(jiǎn)稱AMOVA）分析和各居群間的主坐標(biāo)（簡(jiǎn)稱PCoA）分析。

2結(jié)果與分析

2.1葉性狀表型多樣性

2.1.1香茶菜居群間和居群內(nèi)表型性狀變異特征

山西省霍山8個(gè)不同海拔香茶菜的表型性狀測(cè)量結(jié)果（表2）顯示，葉柄長與葉柄基部寬均以2 000 m居群的均值最大（分別為50.47、3.66 mm）；1 300 m居群的均值最?。ǚ謩e為29.61、2.95 mm）。葉長、葉片長、葉片寬均以1 400 m居群的平均值最大（分別為199.99、153.03、140.94 mm），葉片長、葉片長/寬均以1 600 m居群的平均值最小。隨著海拔的降低，基本呈現(xiàn)出葉片的性狀數(shù)值越大，葉柄性狀的數(shù)值越小。

本研究用變異系數(shù)的大小表示各性狀測(cè)量值離散程度的大小。變異系數(shù)越小，說明性狀的離散程度越小，表型多樣性的豐富程度越低；反之，說明性狀的離散程度越大，表型多樣性的豐富程度越高。由表3可知，香茶菜居群中各表型性狀的平均變異系數(shù)為16.207%，其中葉柄基部寬的平均變異系數(shù)最?。?.030%），葉片長/葉柄長的平均變異系數(shù)最大（30913%）。8個(gè)葉表型性狀的平均變異系數(shù)都較為穩(wěn)定，可應(yīng)用于表型多樣性的相關(guān)研究中。

不同性狀在同一居群的變異系數(shù)也存在差異，1 600 m海拔的居群中葉片長/葉柄長最大（42.338%），葉片長/寬最?。?0.449%），同一性狀在不同居群內(nèi)的變異系數(shù)也存在不同，葉柄長/寬在1 300 m最?。?6.959%），在 2 000 m 最大（46.338%）；葉片長/葉柄長在1 300 m最?。?8.883%），在2 000 m最大（53.829%），表明不同海拔的環(huán)境差異引起葉表型性狀的差異。

香茶菜8個(gè)海拔居群的平均變異系數(shù)存在差異，由小到大排列為1 400 m（11.569%）<1 900 m（11.670%）<1 300 m（12.062%）<1 800 m（13.113%）<1 500 m（14272%）<1 700 m（18.453%）<1 600 m（21.429%）<2 000 m（27.089%），海拔1 400 m居群的葉表型分化程度最小，說明其表型多樣性也最低；海拔2 000 m居群的平均變異系數(shù)最大，分化程度最高，遺傳多樣性最豐富。

從對(duì)8個(gè)表型性狀的方差分析結(jié)果（表4）可以看出，山西省霍山香茶菜8個(gè)葉表型性狀在居群間存在極顯著差異，在居群內(nèi)除葉柄基部寬存在顯著差異外，其余性狀均差異不顯著，說明同一居群內(nèi)存在相對(duì)穩(wěn)定性。香茶菜平均表型分化系數(shù)為69.89%、居群間的平均方差分量為58.34%，居群內(nèi)的平均方差分量為21.54%，表明葉表型性狀多樣性呈現(xiàn)出居群間大于居群內(nèi)的特征，山西省霍山8個(gè)海拔葉表型性狀變異以居群間變異為主。山西省霍山香茶菜8個(gè)居群葉表

型性狀指數(shù)主要受居群間環(huán)境條件和海拔高度不同的影響較大。通過表4同時(shí)可以看出，葉片寬、葉片長/寬的表型分化系數(shù)較大，分別為85.23%、83.33%。說明這2個(gè)性狀的變異在居群間占優(yōu)勢(shì)。

2.1.2表型性狀聚類分析

根據(jù)歐式平均距離，對(duì)香茶菜8個(gè)海拔的8個(gè)葉表型性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行UPGMA聚類分析（圖1）。由圖1可知，在遺傳距離系數(shù)為0.05時(shí)出現(xiàn)分界線，8個(gè)居群被分為三大類。其中1 700、1 800 m海拔處的居群葉表型特征基本一致，聚為一類；1 900、2 000 m居群的葉表型性狀較為相似，聚為一類；1 300、1 400、1 500、1 600 m居群距離相近，聚為一類。整體上看，8個(gè)不同海拔居群葉表型性狀特征依海拔高度而聚類。

2.2葉的遺傳多樣性

2.2.1SRAP遺傳多樣性

8個(gè)海拔香茶菜居群的遺傳變異參數(shù)總結(jié)在表5中，NPL、PPB、Na、H、I值在海拔1 400 m居群有最大值（NPL=72.000、PPB=90.000%、Na=1.900±0302、H=0.333±0.168、I=0.492±0.224），在海拔1 800 m居群有最小值（NPL=46.000、PPB=57.500%、Na=1.575±0.498、H=0.224±0.208、I=0.329±0.299）。Ne值的最高值在海拔 1 300 m 居群（1.586±0.370），最低值在海拔 2 000 m 居群（1.385±0.371），平均值為1.444。

依據(jù)SRAP數(shù)據(jù)分析和比較香茶菜居群間和居群內(nèi)的遺傳多樣性。AMOVA結(jié)果（表6）顯示，75%的遺傳多樣性來自居群間，25%的遺傳多樣性來自居群內(nèi)，香茶菜的遺傳變異主要來自于居群間。AMOVA分析在居群間和居群內(nèi)存在極顯著或顯著差異。

2.2.2居群的遺傳距離與聚類分析

利用POPGEN軟件進(jìn)一步分析香茶菜居群間遺傳分化程度，結(jié)果（表7）表明，遺傳距離為0.037 5～0.221 2，遺傳的一致度為0.801 5～0.963 2。在海拔1 900、2 000 m的居群均與海拔1 300 m居群間有最大遺傳距離和最小遺傳相似度，該最大遺傳距離為0.221 2，最小遺傳相似度為0.801 5，呈現(xiàn)出較大的遺傳差異。

建立基于Nei遺傳距離的UPGMA聚類分析測(cè)量8個(gè)種基因觀察數(shù)；Ne為有效等位基因；H為Neis多樣性指數(shù)；I為Shannon多樣性指數(shù)。

3結(jié)論與討論

在植物適應(yīng)進(jìn)化的過程中，自然選擇作為推動(dòng)力，引起了表型的分化，植物表型性狀的變異對(duì)促使植物適應(yīng)當(dāng)?shù)厣姝h(huán)境具有重要意義[13]。表型性狀由基因與生態(tài)環(huán)境共同決定，而表型性狀的多樣性必然蘊(yùn)含著基因組成的多樣性[14]。本研究通過對(duì)山西省霍山不同海拔香茶菜居群葉表型性狀的研究發(fā)現(xiàn)，8個(gè)葉表型性狀在居群間和居群內(nèi)均存在極顯著或顯著差異。除了海拔1 300 m受人類活動(dòng)影響較大外，在海拔1 400～2 000 m范圍內(nèi)，葉長、葉片長、葉片寬這3個(gè)性狀的均值隨海拔的升高而遞減；葉柄長、葉柄基部寬的均值隨海拔的升高而增大。

香茶菜葉片8個(gè)表型性狀平均變異系數(shù)為16.207%，變異幅度為8.030%～30.913%，葉柄性狀的平均變異系數(shù)（19.707%）>葉片性狀的平均變異系數(shù)（9.905%），表明香茶菜居群內(nèi)表型性狀離散程度較高，且葉片性狀是葉表型性狀中較為穩(wěn)定的遺傳特征。8個(gè)海拔中2 000 m香茶菜葉表型性狀變異系數(shù)均值最大，為27.089%，說明海拔2 000 m可能是山西省霍山香茶菜表型多樣性的中心。

香茶菜8個(gè)表型性狀的平均表型分化系數(shù)水平偏高（69.89%），高于苦楝（54.47%）[15]、白云杉（50.00%）[16]、紫丁香（43.93%）[17]、疏花薔薇（41.84%）[18]，說明該居群間存在較大的變異，反映了居群基因與環(huán)境間相互作用的復(fù)雜性，是不同環(huán)境選擇的結(jié)果，是種群分化的源泉[19-21]。香茶菜居群內(nèi)平均表型分化系數(shù)偏低，為30.11%，說明香茶菜的主要變異來源是居群間的變異，該變異主要受到居群間環(huán)境差異的影響。

香茶菜8個(gè)居群依據(jù)葉表型性狀建立的系統(tǒng)發(fā)育樹在遺傳距離系數(shù)0.05處分為三大支。1 300～1 600 m聚為一支；1 700、1 800 m聚為一支；1 900、2 000 m聚為一支。結(jié)果表明，葉表型性狀的特征與地理距離特征相吻合。

不同海拔香茶菜8個(gè)居群的SRAP標(biāo)記研究顯示（表6），在海拔1 400 m居群出現(xiàn)最大的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)（72.000）、最高的多態(tài)位點(diǎn)百分比（90.000%）、最高的Shannon多樣性指數(shù)（0.492±0.224），具有較高的遺傳多樣性。隨著海拔降低到1 400 m，其遺傳變異水平有所下降（NPL=68.000、PPB=85.000%、I=0.481±0.246）；海拔升高到1 800 m，其遺傳變異水平進(jìn)一步下降（NPL=46.000，PPB=57.500%，I=0.329±0.299）。由此可知，香茶菜遺傳變異水平的高低與海拔有關(guān)，整體表現(xiàn)為隨著海拔的升高，香茶菜遺傳多樣性呈現(xiàn)出先升高后降低的規(guī)律。野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，低海拔居群受到人為活動(dòng)和牲畜啃食的影響較大，極易發(fā)生遺傳漂變，從而使其遺傳多樣性降低。當(dāng)海拔繼續(xù)上升時(shí)，溫度隨之下降，影響香茶菜的生長發(fā)育，最終導(dǎo)致居群內(nèi)個(gè)體數(shù)量減少，遺傳多樣性降低。

海拔分布與居群的遺傳關(guān)系之間有非常重要的意義。AMOVA分析顯示，香茶菜遺傳多樣性主要存在于居群間，因此居群間存在較高的基因流和遺傳分化（表7）。聚類分析中，海拔1 300 m單獨(dú)聚為一類，海拔1 400、1 500、1 600 m聚為一類，海拔1 700、1 800、1 900、2 000 m聚為一類，香茶菜居群間遺傳距離與地理距離之間有明顯的相關(guān)性。另外，統(tǒng)計(jì)學(xué)研究表明，影響居群水平上遺傳多樣性大小的因素是繁殖系統(tǒng)>分布范圍>生活方式>分類地位>種子傳播方式[22]。

8個(gè)海拔香茶菜葉表型性狀的多樣性和SRAP標(biāo)記的遺傳多樣性均主要表現(xiàn)為居群間的遺傳變異，二者具有一致性。聚類分析中聚為三大類，均表現(xiàn)出海拔相近的居群優(yōu)先聚類，但各居群在每一大類中的聚集情況又有所不同。再次表明，表型的變異主要來源于基因組的變異，同時(shí)又受到生存環(huán)境的影響。

參考文獻(xiàn)：

[1]郝曉杰. 霍山七里峪茶條槭種群生態(tài)學(xué)研究[D]. 臨汾：山西師范大學(xué)，2009.

[2]項(xiàng)昭保，陳海生，王光利，等. 藍(lán)萼香茶菜化學(xué)成分研究Ⅱ[J]. 中成藥，2000，32（9）：1622-1627.

[3]張婷，呂明智，董研玲，等. 油茶SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立與引物篩選[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（17）：8882-8885.

[4]韓雅莉. 生物遺傳多樣性和系統(tǒng)學(xué)研究中的RAPD分析[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)牧學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，20（2）：1-4

[5]郭剛平，侯玉華，衛(wèi)恒巧. 香茶菜和苦參同位異部的多元素測(cè)定[J]. 中草藥，1993，24（3）：131-132.

[6]周重陽. 香茶菜甲素體外抗菌活性研究[J]. 中草藥，1988，19（12）：533-535.

[7]李榮華，夏巖石，劉順枝，等. 改進(jìn)的CTAB提取植物基因組DNA的方法[J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2009，28（9）：14-16.

[8]Li B，Gu W C，Lu B M. A study on phenotypic diversity of seeds and cones charateristics in Pinus bungeana[J]. Biodiversity Science，2002，10（2）：181-188.

[9]Ge S，Wang M X，Chen Y W. An analysis of population genetic structure of masson pine by isozyme technique[J]. Scientia Silvae Sinicae，1988，24（4）：399-409.

[10]Yeh F C，Yang R C，Boyle T P. Microsoft windows-based freeware for population genetic analysis releasel[M].Edmonton：University of Alberta，1999.

[11]Tanura K，Dudley J，Nei M，et al. MEGA：molecular evolutionary genetics analysis（MEGA） software（Version 4.0）[J]. Molecular Biology and Evolution，2007，24（8）：1596-1599.

[12]Peakall R，Smouse P E.GenALEx 6：genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research[J]. Molecular Ecology Notes，2006，6（1）：288-295.

[13]Rieseberg L H，Widmer A，Arntz M A，et al. Directional population is the primary cause of phenotypic diversification[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，2002，99（19）：12242-12245.

[14]劉維，陳芬，陳雨，等. 粵北普通野生稻表型多樣性研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，37（8）：21-24.

[15]程詩明. 苦楝聚合群體遺傳多樣性研究與核心種質(zhì)構(gòu)建[D]. 北京：中國林業(yè)科學(xué)院，2005.

[16]Zhang H G，Sun L F，Han J F，et al. Study on the genetic diversity of Picea koraiensis[J]. Bulletin of Botanical Research，2003，25（5）：224-229.

[17]明軍，顧萬春. 紫丁香表型多樣性研究[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2006，19（2）：199-204.

[18]Guo N，Yang S H，Ge W Y，et al. Phenotypic diversity of natural populations of rosa laxaretz in Tianshan Mountains of Xinjiang[J]. Acta Horticulturae Sinica，2011，38（3）：495-502.

[19]肖政，蘇家樂，劉曉青，等. 杜鵑花種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，32（2）：442-447.

[20]Jing Z H，Li H，Shao W H，et al. Phenotypic diversity of natural populations in Diospyros glaucifolia[J]. Bulletin of Botanical Research，2010，30（3）：325-331.

[21]楊天梅，許宗亮，左應(yīng)梅，等. 橫斷山區(qū)珠子參不同居群葉片形態(tài)變異及其與環(huán)境因子的關(guān)系[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（9）：276-280.

[22]Qiao M L，Jian L Z. Genetic diveristy of Phyllanthus emblica populations in dry-hot valleys in Yunnan[J]. Bidiversity Science，2007，15（1）：84-91.