代一航 趙崇軍 田敬歡 倪媛媛 李二文 楊冉冉 馮丹 劉雯雪 王昭懿 喬藝涵 馬志強(qiáng) 林瑞超 鄒迪新

·論著·

香加皮水提取物對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟毒性的初步研究

代一航 趙崇軍 田敬歡 倪媛媛 李二文 楊冉冉 馮丹 劉雯雪 王昭懿 喬藝涵 馬志強(qiáng) 林瑞超 鄒迪新

目的 研究香加皮水提取物對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟的毒性作用。方法 將受精后發(fā)育4天的斑馬魚(yú)幼魚(yú)暴露于不同濃度的香加皮水提取物中,24小時(shí)后,統(tǒng)計(jì)幼魚(yú)的死亡率,計(jì)算量毒曲線;選取低于LC10的三個(gè)藥物暴露組和空白組,以幼魚(yú)肝臟形態(tài)和面積變化、轉(zhuǎn)基因幼魚(yú)肝臟熒光面積和熒光強(qiáng)度以及幼魚(yú)肝臟細(xì)胞凋亡、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartic transaminase,AST)活性為毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果 香加皮水提取物對(duì)幼魚(yú)的量-毒回歸曲線y=-1.0843+0.0014x(R2=0.9524,r=0.97590,P＜0.001),LC10為845.9286μg/mL;與空白組相比,幼魚(yú)肝臟形態(tài)異常、透明度降低,肝臟面積隨藥物暴露濃度增加而劑量依賴(lài)性增加(P＜0.05);轉(zhuǎn)基因幼魚(yú)肝臟熒光面積隨暴露濃度增加而增大,但在高濃度組減小,熒光強(qiáng)度隨暴露濃度的增加而減小(P＜0.05);高濃度暴露組幼魚(yú)肝臟區(qū)域顯示了細(xì)胞凋亡;藥物暴露組幼魚(yú)SOD、GSH-Px活力顯著下降,ALT、AST活力顯著上升(P＜0.05)。結(jié)論 香加皮水提取物對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的肝臟毒性可能是通過(guò)破壞其體內(nèi)氧化應(yīng)激平衡,進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

香加皮; 水提取物; 斑馬魚(yú)模型; 肝臟毒性

香加皮為蘿摩科植物杠柳Periploca sepium Bge的干燥根皮,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,歸為下品,其性溫,味辛苦,有毒,歸肝腎心經(jīng);具有利水消腫、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨之功效;用于治療心悸氣短、風(fēng)寒濕痹、腰膝酸軟等癥[1]。現(xiàn)代藥物化學(xué)和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),香加皮中含有多種化學(xué)成分,包括C21甾體類(lèi)、三萜類(lèi)、醛類(lèi)等,具有強(qiáng)心、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種作用[2-3]。2015版《中華人民共和國(guó)藥典》收載含有香加皮的成方制劑有8種,其中口服藥物有3種,主要用于強(qiáng)心、消腫;外用藥物有5種,主要用于祛風(fēng)除濕、活血止痛。但在臨床運(yùn)用時(shí)發(fā)現(xiàn)其具有一定的毒性,嚴(yán)重限制了它的廣泛應(yīng)用,并且現(xiàn)代研究對(duì)其毒性靶器官和毒性成分的研究較少,缺乏相關(guān)毒性評(píng)價(jià)的數(shù)據(jù)[4]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的主要為其含有的杠柳毒苷和杠柳次苷等強(qiáng)心苷類(lèi)成分所產(chǎn)生的心臟毒性作用[5],但香加皮水提取物的肝臟毒性未見(jiàn)有詳細(xì)明確的報(bào)道,其毒性成分的種類(lèi)尚不明確,毒性作用與目前較為認(rèn)同的功效與毒性成分——杠柳毒苷是否具有相關(guān)性,以及產(chǎn)生肝毒性時(shí)藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過(guò)程和其肝臟損傷的機(jī)制,有待進(jìn)一步深入研究。

斑馬魚(yú)作為近年來(lái)新穎的模式生物,在胚胎發(fā)育生物學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[6]。至今,斑馬魚(yú)在藥物安全性評(píng)價(jià)中已有了較廣泛的應(yīng)用,從一般毒性評(píng)價(jià)到發(fā)育毒性、心臟毒性、肝臟毒性、神經(jīng)毒性、視覺(jué)系統(tǒng)毒性的評(píng)價(jià),甚至到耳毒性、軟骨毒性、胃腸毒性評(píng)價(jià)[7]?？傊?斑馬魚(yú)模型彌補(bǔ)了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)缺少藥物代謝內(nèi)環(huán)境、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本資源較高的缺陷,成為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的橋梁,并且斑馬魚(yú)對(duì)藥物的毒性反應(yīng)與哺乳動(dòng)物相似[8];因此,運(yùn)用斑馬魚(yú)模型進(jìn)行中藥毒性評(píng)價(jià)不失為一種新穎的評(píng)價(jià)方法。

本文選取斑馬魚(yú)為模型,探討香加皮水提取物對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的肝臟毒性作用,以期為建立以斑馬魚(yú)為模型的毒性快速評(píng)價(jià)體系提供參考數(shù)據(jù),并為臨床安全用藥提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 斑馬魚(yú)養(yǎng)殖與繁育 斑馬魚(yú)親本購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所,實(shí)驗(yàn)所用野生(wildtype)AB系和肝臟熒光蛋白轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(fabp10a：dsRed;ela31：EGFP)幼魚(yú)由本實(shí)驗(yàn)室斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)繁育。斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖繁育參照Z(yǔ)ebrafish Book[9]。實(shí)驗(yàn)的操作遵循OECD標(biāo)準(zhǔn)。養(yǎng)殖條件：水溫(28±0.5)℃,pH值7～7.2,電導(dǎo)率450～550μs/cm,黑暗與光照周期為10 h/14 h,成年斑馬魚(yú)每日喂食豐年蝦幼蟲(chóng)3次。繁育：于暗周期開(kāi)始時(shí),選取成年斑馬魚(yú)雌魚(yú)和雄魚(yú),按照1∶1的比例放入帶隔板的產(chǎn)卵缸中,暗周期結(jié)束后,將隔板抽出,打開(kāi)光源,在光照的刺激下,雄魚(yú)開(kāi)始追逐雌魚(yú),雌魚(yú)開(kāi)始產(chǎn)卵,待受精完成后,收集受精卵。在顯微鏡下將受精卵挑出并轉(zhuǎn)入含有適量胚胎培養(yǎng)水的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,清洗數(shù)次,放入生化培養(yǎng)箱中孵育96小時(shí),每24小時(shí)更換一次胚胎培養(yǎng)水。

1.1.2 試驗(yàn)材料與儀器藥材 香加皮(安國(guó)圣山藥業(yè)有限公司)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為蘿藦科植物杠柳Periploca sepium Bge的干燥根皮。 試劑：NaCl、KCl、Na2HPO4、K2HPO4、MgSO4、NaHCO3(分析純,北京化工),CaCl2、吖啶橙(sigma)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (alanine aminotransferase,AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartic transaminase,ALT)、考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所。儀器：斑馬魚(yú)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛(ài)生科技公司);蔡司熒光顯微鏡(NIKON);1 mL、5 mL 移液器(eppendorf);恒溫培養(yǎng)箱 LRH-250Z(廣州瑞明儀器有限公司);DZF-6050B真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);R-1001-VN旋蒸儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);15 cm玻璃培養(yǎng)皿(北京百諾威生物科技有限公司);PHS-3C酸度計(jì)(上海佑科,DDS-307);電導(dǎo)率儀(上海一恒科技有限公司),UV-2000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司)。斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液：按照Z(yǔ)ebrafish Book標(biāo)準(zhǔn),配制每升含有 0.137 mol NaCl、5.4 mol KCl、0.25 mol Na2HPO4、0.44 mol K2HPO4、1.3 mol CaCl2、1.0 mol MgSO4、4.2 mol NaHCO3的水溶液。

1.2 香加皮水提取物藥液的配制

取香加皮飲片,粉碎后過(guò)40目篩,精密稱(chēng)取50 g香加皮粉末,加入10倍量的蒸餾水回流提取2次,每次2小時(shí),提取液抽濾后濃縮,減壓干燥,研磨均勻后干燥保存。精密稱(chēng)取一定量的香加皮提取物粉末,溶于一定量的胚胎培養(yǎng)水中,超聲助溶30分鐘,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,配置成一定濃度的儲(chǔ)存液,實(shí)驗(yàn)前使用胚胎培養(yǎng)水稀釋至所需濃度。

1.3 斑馬魚(yú)幼魚(yú)24小時(shí)急性毒性試驗(yàn)

選取發(fā)育正常、無(wú)畸形的受精后4天(4 dpf)的AB系野生和轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)幼魚(yú),分別隨機(jī)放置于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔20條,并加入適量等體積胚胎培養(yǎng)水。

1.3.1 藥物暴露濃度的選取 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)不同暴露濃度的藥液,按照上述藥液的配置原則,配置成 700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500 μg/mL的藥液。

1.3.2 給藥方式 將裝有幼魚(yú)的12孔板中的培養(yǎng)水依次吸出,并依次加入不同濃度的藥液,每孔4 mL,每個(gè)濃度兩個(gè)復(fù)孔,空白對(duì)照組加入等體積的新鮮胚胎培養(yǎng)水。加蓋標(biāo)記后,將孔板置于可控溫光照培養(yǎng)箱中(28.5℃)24小時(shí)(黑暗與光照時(shí)間比為5∶7),實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處理方法 在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),統(tǒng)計(jì)各個(gè)濃度組死亡的斑馬魚(yú)數(shù)目,并計(jì)算死亡率,運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SAS 8.2計(jì)算藥物暴露濃度與死亡率相關(guān)性和線性回歸方程。

1.4 AB系野生斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟形態(tài)表型觀察和肝臟面積測(cè)定

1.4.1 藥物暴露濃度選取和暴露處理選取 低于LC10的三個(gè)藥物濃度,分為高濃度組、中濃度組、低濃度組,并設(shè)置空白對(duì)照組,參照1.3.2項(xiàng)進(jìn)行暴露處理。

1.4.2 表型觀察 藥物暴露結(jié)束后,去除藥液,使用胚胎培養(yǎng)水清洗幼魚(yú)3次后,將幼魚(yú)固定于涂布有3%的甲基纖維素凝膠的載玻片上,并擺放成側(cè)躺姿態(tài)(便于觀察幼魚(yú)肝臟的形態(tài)特征),在顯微鏡下依次觀察各個(gè)藥物暴露組和空白組中幼魚(yú)的肝臟表型,并在相同光學(xué)條件下進(jìn)行拍照。使用顯微鏡軟件(ZEN lite)統(tǒng)計(jì)各組幼魚(yú)的肝臟面積。

1.5 肝臟轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟形態(tài)學(xué)觀察、熒光面積和平均熒光強(qiáng)度的測(cè)定

1.5.1 藥物暴露濃度選取和暴露處理藥物 暴露濃度選取和暴露處理同1.4.1項(xiàng)。

1.5.2 表型觀察 表型觀察的處理方法同1.4.2項(xiàng),并使用顯微鏡軟件(ZEN lite)統(tǒng)計(jì)各組幼魚(yú)肝臟熒光面積和肝臟平均熒光強(qiáng)度。

1.6 AB系野生斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟吖啶橙染色

1.6.1 吖啶橙染色液的配置方法 參照文獻(xiàn)[10]的配置方法,精密稱(chēng)取一定量的吖啶橙粉末,放入棕色容量瓶中,加入斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)水,配置成2.5μg/mL的染色液,4℃環(huán)境避光保存。

1.6.2 細(xì)胞凋亡評(píng)價(jià) 按照上述1.4.1項(xiàng)方法進(jìn)行藥物暴露,在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),用胚胎培養(yǎng)水、PBS依次清洗各個(gè)濃度藥物暴露組幼魚(yú)三次,去除PBS后每孔加入2 mL的吖啶橙染液,28℃避光處理20分鐘進(jìn)行染色。隨后加入PBS反復(fù)清洗幼魚(yú)3次,將幼魚(yú)側(cè)位放置于含有3%甲基纖維素的載玻片上,于熒光顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞凋亡的情況。

1.7 斑馬魚(yú)幼魚(yú)SOD、GSH-Px、AST和ALT活力測(cè)定

按照上述1.4.1項(xiàng)下方法進(jìn)行藥物暴露,在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),將12孔板中的斑馬魚(yú)幼魚(yú)用斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)水清洗3次,轉(zhuǎn)入1.5 mL預(yù)先稱(chēng)重的離心管中,每個(gè)濃度80條幼魚(yú),PBS清洗3次,移除PBS,迅速稱(chēng)重并冷凍(-20℃)處理,隨后按照試劑盒的相關(guān)步驟進(jìn)行酶活性測(cè)定。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS 8.2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,所有計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)形式,各組正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果顯示符合正態(tài)分布且方差齊,因此運(yùn)用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD法進(jìn)行組間多重比較,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚(yú)幼魚(yú)24小時(shí)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件的相關(guān)回歸分析,在一定范圍內(nèi),藥液濃度與幼魚(yú)的死亡率成正相關(guān)關(guān)系,回歸方程為y=-1.0843+0.0014x(R2=0.9524,P＜0.05),相關(guān)性較好,相關(guān)系數(shù)為0.9759(P＜0.05)。由線性回歸方程計(jì)算出LC50=1131.6427μg/mL,LC10=845.9286μg/mL,LC0=774.5 μg/mL。

圖1 斑馬魚(yú)幼魚(yú)經(jīng)香加皮水提取物不同濃度藥物處理24小時(shí)后濃度-死亡率線性回歸曲線

2.2 香加皮水提取物暴露處理對(duì)野生斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟表型和肝臟面積的影響

結(jié)果顯示,空白組斑馬魚(yú)肝臟成透明狀,無(wú)畸形,肝臟形態(tài)完整清晰,而藥物暴露組斑馬魚(yú)肝臟透明度降低,形態(tài)膨大,并且隨暴露濃度增加,肝臟進(jìn)一步膨大,成暗灰色狀,肝臟區(qū)域邊緣逐漸模糊;其中,600μg/mL暴露組肝臟透明度降低,700μg/mL暴露組中斑馬魚(yú)肝臟區(qū)域成整體灰暗狀,800μg/mL暴露組除肝臟成灰暗狀外,卵黃囊發(fā)育遲緩,表明肝臟損傷進(jìn)一步擴(kuò)大。肝臟面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,各濃度藥物暴露處理組中斑馬魚(yú)的肝臟面積呈劑量依賴(lài)性增加,并與空白組均具有顯著性差異(P＜0.05)。如圖2所示。

表1 斑馬魚(yú)幼魚(yú)(4dpf)經(jīng)香加皮水提取物不同濃度藥物處理24小時(shí)后肝臟面積變化(x±s)

圖2 斑馬魚(yú)幼魚(yú)(4dpf)經(jīng)香加皮水提取物不同濃度藥物處理24小時(shí)后肝臟形態(tài)學(xué)變化

2.3 香加皮水提取物暴露處理對(duì)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)肝臟形態(tài)、熒光面積和平均熒光強(qiáng)度的影響

形態(tài)觀察結(jié)果表明,空白組斑馬魚(yú)肝臟形態(tài)完整,產(chǎn)生了強(qiáng)烈的紅色熒光;而給藥組斑馬魚(yú)肝臟形態(tài)異常,肝臟熒光面積增大,熒光強(qiáng)度有下降的趨勢(shì);其中,600μg/mL暴露組斑馬魚(yú)肝臟熒光面積增大,熒光強(qiáng)度減弱,700μg/mL暴露組中斑馬魚(yú)肝臟熒光面積進(jìn)一步增加,800μg/mL暴露組肝臟熒光面積較700μg/mL組減小,但與空白組斑馬魚(yú)肝臟相比,仍顯示增大的趨勢(shì)。肝臟面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,斑馬魚(yú)的肝臟熒光面積隨藥物暴露濃度的增加而增大,但在高濃度組有下降的趨勢(shì),并與空白組均具有顯著性差異(P＜0.05)。肝臟平均熒光強(qiáng)度結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示,斑馬魚(yú)肝臟熒光強(qiáng)度呈劑量依賴(lài)性降低,并與空白組比較具有顯著性差異(P＜0.05)。如圖3所示。

圖3 肝臟熒光蛋白轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)幼魚(yú)經(jīng)香加皮水提取物不同濃度藥物處理24小時(shí)肝臟表型結(jié)果

表2 幼魚(yú)肝臟熒光面積和平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)表(x±s)

2.4 斑馬魚(yú)幼魚(yú)經(jīng)香加皮水提取物暴露處理后肝臟吖啶橙染色結(jié)果

吖啶橙是一種核酸插入式染料,能透過(guò)胞膜完整的細(xì)胞,與凋亡的細(xì)胞中的雙鏈DNA結(jié)合后,產(chǎn)生綠色熒光。吖啶橙染色處理后,與空白組相比,高濃度藥物處理組斑馬魚(yú)肝臟區(qū)域顯示了顯著的黃綠色熒光,意味著有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,結(jié)果如圖4所示。

圖4 斑馬魚(yú)肝臟吖啶橙染色熒光情況

2.5 斑馬魚(yú)幼魚(yú)經(jīng)香加皮水提取物暴露處理后,T-SOD、GSH-Px、AST 和 ALT 活力測(cè)定

結(jié)果表明,與空白組相比,香加皮水提物暴露處理組能夠降低斑馬魚(yú)T-SOD及GSH-Px活性,并具有顯著性差異(P＜0.05),提高斑馬魚(yú)體內(nèi)ALT和AST活性,并具有顯著性差異(P＜0.05),并呈現(xiàn)劑量相關(guān)性,見(jiàn)表3。

3 討論

香加皮在臨床使用時(shí),常常伴隨著一些毒性和不良反應(yīng),早期表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉等,嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)心率下降、房室傳導(dǎo)阻滯、心律失常甚至引起機(jī)體死亡[11],嚴(yán)重限制了對(duì)其深入的開(kāi)發(fā)和運(yùn)用,需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)其毒性作用機(jī)制。

斑馬魚(yú)基因與人類(lèi)具有高度同源性,組織和器官發(fā)育具有相似的形態(tài)和分子基礎(chǔ),其中,生長(zhǎng)因子、基因表達(dá)以及肝臟中脂質(zhì)、蛋白、維生素和碳水化合物代謝的相似性就是很好的例子[12]。有研究表明斑馬魚(yú)對(duì)外源化學(xué)物質(zhì)的抵御機(jī)制與哺乳動(dòng)物類(lèi)似,包含酶活性誘導(dǎo)和氧化應(yīng)激,其中,斑馬魚(yú)肝臟中具有許多與哺乳動(dòng)物同源的脂質(zhì)代謝酶,包括HMG-CoA合成與裂解酶、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)[13-14]。有學(xué)者通過(guò)斑馬魚(yú)表型分析,對(duì)已知的哺乳動(dòng)物肝臟毒性藥物和陰性化合物進(jìn)行了準(zhǔn)確的區(qū)別[15];還有學(xué)者進(jìn)一步完善并建立了基于基因表達(dá)生物標(biāo)記物和表型分析的斑馬魚(yú)肝臟毒性評(píng)價(jià)方法,具有很好的適用性[16]。這些數(shù)據(jù)和技術(shù)手段都支持了斑馬魚(yú)模型對(duì)于藥物肝臟毒性的預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)具有可行性并展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),即基于斑馬魚(yú)模型的藥物肝臟毒性篩選具有明顯的高通量、低成本、實(shí)驗(yàn)周期短以及可以活體評(píng)價(jià)等優(yōu)點(diǎn)。

本文利用斑馬魚(yú)模型在藥物毒理學(xué)評(píng)價(jià)中的優(yōu)勢(shì)來(lái)探討香加皮水提取物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟的潛在毒性作用。機(jī)體內(nèi)氧自由基生成-清除的動(dòng)態(tài)平衡是機(jī)體自我保護(hù)的重要機(jī)制,自由基生成過(guò)多或清除能力減弱時(shí),機(jī)體會(huì)受到自由基的攻擊,造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能上的損害[17]?？寡趸?SOD和GSH-Px是機(jī)體通過(guò)酶系途徑抗氧化的主要物質(zhì),其活性的變化直接影響細(xì)胞內(nèi)氧自由基和其終末產(chǎn)物的量,并反應(yīng)了機(jī)體氧化應(yīng)激的水平。本研究通過(guò)測(cè)定斑馬魚(yú)體內(nèi)總超氧化物歧化酶的含量和谷胱甘肽過(guò)氧化酶的含量來(lái)探討香加皮水提取物對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)以上兩種酶活性的影響,結(jié)果顯示,與空白組相比,各藥物濃度組SOD、GSH-Px值具有顯著性差異,均小于空白組,并隨暴露濃度的升高而下降。SOD、GSH-Px活力的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除自由基的能力,因此,香加皮水提取物可能通過(guò)抑制斑馬魚(yú)肝臟SOD、GSH-Px的活性,造成斑馬魚(yú)氧化應(yīng)激損傷,進(jìn)而造成肝臟細(xì)胞的過(guò)氧化損傷。

表3 香加皮水提取物不同濃度暴露組處理24小時(shí)后對(duì)幼魚(yú)酶活力影響(x±s,n=3)

ALT和AST是主要分布在肝細(xì)胞內(nèi)的氨基酸轉(zhuǎn)移酶,是表征肝臟受到外源性物質(zhì)損傷的常用信號(hào)檢測(cè)物質(zhì),當(dāng)肝細(xì)胞被損傷時(shí),肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)遭到破壞,其轉(zhuǎn)氨酶將釋放進(jìn)入血液循環(huán),從而導(dǎo)致血漿內(nèi)二者含量升高;二者在藥物暴露組中均表現(xiàn)出了含量上升的趨勢(shì),并與對(duì)照組具有顯著性差異,這些結(jié)果說(shuō)明斑馬魚(yú)肝臟受到了藥物的毒性損傷。有文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道連續(xù)給予小鼠香加皮水提取物后,小鼠肝臟AST、ALT水平顯著升高,同時(shí)導(dǎo)致小鼠肝臟細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而造成小鼠的肝臟損傷。這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論相一致,相互印證,也為證實(shí)斑馬魚(yú)在藥物肝臟毒性研究的適用性提供了數(shù)據(jù)支持,其毒性作用機(jī)制可能為破壞了斑馬魚(yú)體內(nèi)氧化應(yīng)激平衡,造成斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞的損傷和凋亡。

肝臟毒性在藥物毒性評(píng)價(jià)中往往處于首要的位置,近年來(lái)關(guān)于中藥肝臟毒副作用的報(bào)道受到了大眾的廣泛的關(guān)注,這些負(fù)面影響嚴(yán)重地?fù)p害了中藥的聲譽(yù),建立快速準(zhǔn)確的中藥肝臟毒性評(píng)價(jià)體系迫在眉睫,本文基于斑馬魚(yú)模型初步探討香加皮水提取物的肝臟毒性作用,以期為香加皮的臨床應(yīng)用和合理開(kāi)發(fā)提供一定的參考價(jià)值。

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Effects of waterextract from cortex periplocae on hepatotoxicity of zebrafish

DAI Yihang,ZHAO Chongjun,TIAN Jinghuan,et al.
School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing Key Laboratory for Quality Evaluation of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100102,China

LIN Ruichao,E-mail：linrch307@sina.com;ZOU Dixin,Email：zoudixin@163.com

Objective To study the toxic effect of waterextract from cortex periplocae on liver of zebrafish larval.Methods Zebrafish embryos of 4 days post-fertilization were exposed to 12-well plates with different concentrations of waterextract from cortex periplocae for 24 hours,and the mortality rate was calculated and the toxic curve was calculated.Three drug exposed groups less than LC10and the blank group were selected.The changes of liver morphology and area,fluorescence area and fluorescence intensity of liver,apoptosis of liver cell, superoxide dismutase, glutathione peroxidase,alanine aminotransferase,aspartic transaminase were used as indicator of toxicity assessment.Results The LC10ofwaterextract from cortex periplocae was 845.9286μg/mL,the mortality rate was dependent with the concentration,concentration-mortality curve was y=-1.0843+0.0014x(R2=0.9524,P＜0.001),and correlation coefficient was 0.97590(P＜0.001).Compared with the control group,morphological abnormalities was more and transparency was decreased in liver,and liver area was increased with drug exposure concentration(P＜0.05);The fluorescence area was increased with the exposure concentration increased,but in the high concentration group,the fluorescence intensity was decreased with the exposure concentration increased(P＜0.05);The apoptosis was appeared in high concentration exposed group.The activity of SOD,GSH-Px was significantly decreased while the activity of AST,ALT was significantly increased.Conclusion Waterextract from cortex periplocae can induce hepatotoxicity in zebrafish larvae,and the mechanism may relate to destroy the balance of oxidative stress and induce apoptosis in liver cells.

Cortex periplocae; Waterextract; Zebrafish model; Hepatotoxicity

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.10.001

2017-07-05)

(本文編輯：董歷華)

北京市科委創(chuàng)新環(huán)境與平臺(tái)建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(Z16111000500000)

100102北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[代一航(碩士研究生)、趙崇軍(博士研究生)、田敬歡(碩士研究生)、倪媛媛(碩士研究生)、李二文(碩士研究生)、楊冉冉(碩士研究生)、馮丹(博士研究生)、劉雯雪(碩士研究生)、王昭懿(博士研究生)、喬藝涵(碩士研究生)、馬志強(qiáng)、林瑞超];內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院(鄒迪新)

代一航(1991-),2015級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：中藥毒性成分與中藥藥理研究。E-mail：2449416672@qq.com

林瑞超(1954-),博士,教授,博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥、民族藥質(zhì)量控制與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。E-mail：linrch307@sina.com;鄒迪新(1983-),女,博士,講師。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究。Email：zoudixin@163.com