張 娜，謝艷輝，陳進(jìn)會(huì)，李家僑，斯?jié)啥鳎S 磊

（1. 湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東湛江 524000；2. 東莞出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東東莞 441900）

蝦肝腸胞蟲Taqman熒光PCR方法的建立與應(yīng)用

張 娜1，謝艷輝1，陳進(jìn)會(huì)2，李家僑1，斯?jié)啥?，黃 磊1

（1. 湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東湛江 524000；2. 東莞出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東東莞 441900）

為給蝦肝腸胞蟲（EHP）的監(jiān)測和控制工作提供特異、靈敏的快速檢測方法，針對EHP 18S相關(guān)保守序列設(shè)計(jì)1對特異性引物，優(yōu)化并建立EHP的Taqman熒光PCR檢測方法，同時(shí)驗(yàn)證該方法的重復(fù)性和敏感性。結(jié)果顯示：體系擴(kuò)增的最佳退火溫度為60 ℃，構(gòu)建好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.195，R2為0.991；擴(kuò)增產(chǎn)物閾值循環(huán)數(shù)（Ct）與標(biāo)準(zhǔn)模板起始量（X）的關(guān)系曲線為-3.195×Log（X）+36.923，擴(kuò)增效率為105.59。使用所構(gòu)建方法檢測湛江市EHP流行情況，同時(shí)對樣品進(jìn)行白斑綜合癥病毒（WSSV）、傳染性皮下和造血器官壞死病毒（IHHNV）、桃拉綜合征病毒（TSV）、早期死亡綜合癥（AHPND）病毒檢測。結(jié)果顯示：樣品的WSSV、IHHNV、TSV檢測均為陰性；AHPND檢出陽性率為10%，EHP為30%，其中1份樣品的EHP和AHPND檢測同為陽性。本研究建立的EHP熒光PCR方法具有特異、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。該方法及其臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)可為EHP的防控提供技術(shù)參考。

蝦肝腸胞蟲；南美白對蝦；Taqman熒光PCR

Abstract：To provide specific，sensitive and rapid detection methods for the monitoring and control of Enterocytozoon hepatopenaei（EHP），Taqman fluorescent PCR method to detect EHP of Shrimp microsporidian was developed，a pair of specific primers was designed according to the conserved sequences of EHP 18S published in Genbank，its repeatability and sensitivity were detected in this study. The results showed that the optimum annealing temperature was 60 ℃，the standard cycles of amplification threshold（Ct）and the logarithmic of the initial template quantity[log（Sq）] conformed to Ct=-3.195×Log（X）+36.923，of which the coefficient of association R2was 0.991，the slope was -3.195，the amplification efficiency was 105.59. The results showed that the method had nice property and high sensitivity. By examing the growth of the 20 vannamei samples collected from Zhanjiang area with the method of this experiment，the samples were also examined for WSSV，IHHNV，TSV and AHPND，test results showed that WSSV，IHHNV and TSV had incidence of 0，AHPND had incidence of 10%，EHP had incidence of 30%，and one shrimp sample showed co-infection of AHPND and EHP. In conclusion，a highly specific，sensitive method was developed，which could be a useful tool in the prevention and control of Shrimp microsporidian E.hepatopenaei.

Key words：Enterocytozoon hepatopenaei；Shrimp microsporidian；Taqman fluorescent PCR method

隨著南美白對蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，疫病成為對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸之一。蝦急性肝胰腺壞死/蝦早死綜合癥（AHPND/EMS）[1]、蝦肝腸胞蟲病[2]等新發(fā)疫病的發(fā)生，更加重了養(yǎng)殖企業(yè)的風(fēng)險(xiǎn)和負(fù)擔(dān)，使得我國對蝦養(yǎng)殖成功率逐年下降，嚴(yán)重影響了對蝦進(jìn)出口貿(mào)易和對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。據(jù)湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，近幾年湛江市對蝦出口不斷下滑，2015年出口對蝦14.95萬噸，同比減少16.28%。

蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）是近幾年新發(fā)現(xiàn)的寄生于對蝦肝胰腺組織的新病原，2009年，在泰國的斑節(jié)對蝦中首次被分離和命名[2-3]。盡管EHP不會(huì)引起對蝦很高的死亡率，也不會(huì)出現(xiàn)明顯癥狀，但可使對蝦生長緩慢，當(dāng)發(fā)生混合感染時(shí)，會(huì)加重對蝦疫情，增加致死率[4]。目前，EHP的傳播越來越廣泛。有信息表明，中國、印度尼西亞、馬來西亞、越南、印度和泰國的對蝦中都有EHP流行[5]。因此，對其應(yīng)引起足夠重視，并做好監(jiān)測和控制工作。

本研究設(shè)計(jì)建立了EHP Taqman探針熒光PCR檢測方法，同時(shí)用該方法對湛江市EHP流行情況進(jìn)行了調(diào)查；通過臨床應(yīng)用證明，該方法具備較好的特異性、靈敏性，可為EHP的快速檢測和監(jiān)測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)材料。采自湛江市的南美白對蝦樣品，經(jīng)PCR檢測并測序后確認(rèn)為EHP感染，由本實(shí)驗(yàn)室保存；ABI 核酸提取試劑盒、Premix Ex Taq（Probe qPCR）、膠回收試劑盒、PMD18-T克隆載體、質(zhì)?；厥赵噭┖?，購自大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司；PCR管、吸嘴等，均為Axygen產(chǎn)品；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要儀器設(shè)備。熒光定量PCR儀（美國ABI stepone plus）；PCR擴(kuò)增儀（美國ABI 公司）；凝膠成像儀（德國Biometra公司）；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf centrifuge 5417R）；電泳儀（DYY-8C，北京市六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1引物合成。選取EHP 18S序列中保守片段（GenBank：KX932044）， 應(yīng) 用 Primer 5.0和Primer Express 2.0軟件分別設(shè)計(jì)引物和探針。引物 序 列 為 F：5′-tggtataggtgggcaaagaatga-3′；R：5′-aaggacgaaggctagagtatcgaa-3′；探針序列為 F：5′-FAM-caacggaggcgaaagcgatgctct-BHQ1。 引 物 和探針均由大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司合成，預(yù)計(jì)引物擴(kuò)增片斷為111 bp。

1.2.2引物普通PCR擴(kuò)增。用ABI核酸提取試劑盒提取的肝胰腺陽性組織DNA為模板，用設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：10×PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，dNTP（10 mM）2 μL，TaqDNA 聚合酶 0.5 μL，提抽物5 μL，加水補(bǔ)至25 μL。按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃ 5 min；35次循環(huán)（94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s），72 ℃ 5 min；4 ℃ 保溫。

1.2.3模板標(biāo)準(zhǔn)品的制備及條件優(yōu)化。將10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖電泳，切下目的條帶，按照膠回收試劑盒說明書進(jìn)行回收；將回收的擴(kuò)增片斷與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化受體菌E.coli DH5a，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h；隨機(jī)挑取白色單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)8 h；用質(zhì)粒提取試劑盒提取有重組目的片斷的質(zhì)粒；對質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定陽性后，將目的條帶送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序；對測序結(jié)果經(jīng)DNAstar軟件分析后，與擴(kuò)增基因的片斷序列進(jìn)行核苷酸序列同源性分析。用核酸分析儀測定提取的重組質(zhì)粒DNA濃度。經(jīng)測定，質(zhì)粒濃度為 123 μg/mL，質(zhì)?？截悢?shù)為 4×1010copies/μL。將提取好的重組質(zhì)粒作為本實(shí)驗(yàn)定量標(biāo)準(zhǔn)品原液，-80 ℃保存。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系參照Premix Ex Taq（Probe qPCR）試劑說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系為25 μL（表1）。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；然后進(jìn)行44次循環(huán)（95 ℃ 5 s，退火溫度 30 s）。退火溫度分別設(shè)定為56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。將構(gòu)建好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，得到 4×101～4×108copies/μL 共 8 個(gè)梯度濃度；利用上述優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件，建立質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)與Ct值對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，判斷標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增質(zhì)量。

表1 反應(yīng)體系構(gòu)建 （單位：μL）

1.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)。用陰性樣品12份，37 ℃反應(yīng)30 min，模擬常溫下體系的穩(wěn)定性，檢測體系是否出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。采用已知陽性樣品4份和陰性樣品10份，每周試驗(yàn)1次，檢測其的穩(wěn)定性。

1.2.6特異性試驗(yàn)。以AHPND、IHHNV、WSSV、EHP的DNA為模板，分別用建立的熒光PCR方法進(jìn)行檢測，對每個(gè)模板同時(shí)設(shè)2個(gè)平行樣。

1.2.7重復(fù)性試驗(yàn)。由2名檢驗(yàn)員進(jìn)行加樣，使用1個(gè)陽性質(zhì)粒以及14個(gè)樣本進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，比較兩次結(jié)果，判斷方法重復(fù)性的好壞。

1.2.8敏感性試驗(yàn)。對已知EHP陽性核酸（測定核酸濃度為6.5×108copies/μg）進(jìn)行稀釋，共得到6.5×106～6.5×101copies/μg 6個(gè)梯度；分別用梯度濃度核酸為模板，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。用稀釋好的模板、Somjintana[6]設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。引物F：5′-ccggagagggagcctgaga-3′；引物R：5′-gacgggcggtgtgtacaa a-3′。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min，然后進(jìn)行40次循環(huán)（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s），72 ℃ 5 min。

1.2.9臨床實(shí)際應(yīng)用。從湛江市隨機(jī)抽取10家對蝦養(yǎng)殖場的20份對蝦樣品，用建立的EHP熒光方法進(jìn)行檢測，同時(shí)對樣品進(jìn)行WSSV、IHHNV、TSV、AHPND 4種病原檢測，用PCR方法對EHP進(jìn)行確認(rèn)（方法見1.2.8）。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及條件優(yōu)化

對含目標(biāo)基因的重組質(zhì)粒進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，對比擴(kuò)增效率、擴(kuò)增曲線、溶解曲線等指標(biāo)。當(dāng)體系為 25 μL 時(shí)，確定 10 μmol/L 的引物 F/R 各為 1.0 μL；5 μmol/L 探針 0.5 μL 為最佳引物濃度；擴(kuò)增退火溫度為60 ℃最佳。將構(gòu)建好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，用 4×101～4×108copies/μL共8個(gè)梯度濃度得到標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.681，R2為0.998 8，擴(kuò)增產(chǎn)物閾值循環(huán)數(shù)（Ct）與標(biāo)準(zhǔn)模板起始量（X）關(guān)系曲線為-3.681×Log（X）+44.114，擴(kuò)增效率為105.59，證明所構(gòu)建的熒光PCR反應(yīng)體系對標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增質(zhì)量較好。陽性質(zhì)粒相應(yīng)濃度測試擴(kuò)增曲線顯示，模板濃度梯度明顯，曲線增量正常，擴(kuò)增Ct值合理，與標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果相對應(yīng)。擴(kuò)增只出現(xiàn)1個(gè)波峰說明擴(kuò)增產(chǎn)物是均一的，無非特異性擴(kuò)增（圖1）。

圖1 EHP熒光PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增、標(biāo)準(zhǔn)曲線、溶解曲線試驗(yàn)

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在溫育過程中，如果引物探針與體系不穩(wěn)定，就容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽性。用陰性樣品12份，37 ℃反應(yīng)30 min，模擬常溫反應(yīng)，結(jié)果顯示無非特異性擴(kuò)增結(jié)果，無假陽性。用已知陽性樣品4份和陰性樣品10份，每周試驗(yàn)1次，結(jié)果顯示陽性擴(kuò)增曲線模板濃度梯度明顯，曲線增量正常，每次擴(kuò)增的Ct值相同（圖2）。

圖2 EHP熒光PCR方法的非特異性擴(kuò)增和穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3 特異性試驗(yàn)

以建立的方法分別以AHPND、IHHNV、WSSV、EHP的DNA為模板進(jìn)行檢測，各設(shè)2個(gè)平行樣。結(jié)果顯示，只有EHP具有強(qiáng)烈的熒光信號，其他檢測樣品均為陰性，沒有熒光吸收信號（圖3）。

圖3 EHP熒光PCR方法特異性試驗(yàn)

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

2名檢驗(yàn)員同時(shí)加樣進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示1個(gè)陽性質(zhì)粒和4個(gè)陽性樣品都有明顯擴(kuò)增，陰性樣品無擴(kuò)增，平行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與樣本一致（圖4）。

圖4 EHP熒光PCR方法的重復(fù)性試驗(yàn)

2.4 敏感性試驗(yàn)

用已知濃度核酸為模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，共得到 6.5×106～6.5×101copies/μg 6 個(gè)梯度，結(jié)果顯示在模板濃度為6.5×102copies/μL時(shí)，仍有熒光信號（圖5）。普通PCR擴(kuò)增條帶為942 bp，在模板濃度為6.5×102copies/μL時(shí)，擴(kuò)增條帶用肉眼，難以看到。結(jié)果說明所建立熒光PCR方法的檢測靈敏度較普通PCR方法至少高出1個(gè)數(shù)量級（圖6）。

圖5 EHP熒光PCR方法的敏感性試驗(yàn)

圖6 普通PCR方法敏感性試驗(yàn)

2.5 臨床應(yīng)用

從湛江市10家對蝦養(yǎng)殖場隨機(jī)抽取20份對蝦樣品，用本實(shí)驗(yàn)建立的方法進(jìn)行EHP檢測，同時(shí)進(jìn)行WSSV、IHHNV、TSV、AHPND 4種病原檢測。檢測結(jié)果顯示：WSSV、IHHNV、TSV檢出率均為0；AHPND陽性樣品2份，檢出率為10%；EHP陽性樣品6份，檢出率為30%。有1份樣品的EHP和AHPND檢測結(jié)果均為陽性，說明養(yǎng)殖場中的對蝦存在EHP和AHPND的混合感染。EHP熒光PCR方法同普通PCR方法的檢測結(jié)果一致（圖7、圖8、圖9）。

圖7 樣品WSSV、IHHNV、TSV、AHPND熒光PCR方法檢測

圖8 樣品EHP熒光PCR方法檢測

圖9 樣品的普通PCR方法檢測結(jié)果（與熒光PCR方法檢測結(jié)果一致）

3 討論

微孢子蟲廣泛寄生于無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物體內(nèi)，早期多寄生于野生對蝦，如褐美對蝦、白濱對蝦等。常見的對蝦微孢子蟲病原有3種，分別為八孢蟲、匹里蟲、微粒子蟲[7]。EHP是2009 年在泰國的斑節(jié)對蝦中首次被分離和命名[2]，只寄生于對蝦肝胰腺組織。EHP 導(dǎo)致受感染對蝦生長阻滯，個(gè)體大小差異明顯，且會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌繼發(fā)感染[3]。在發(fā)現(xiàn)EHP之前，微孢子蟲主要寄生在對蝦肌肉和結(jié)締組織中[8]，引起的疾病命名為“棉花蝦病”[9]、“牛奶蝦病”[10]或“白背病”[11]。

目前，相關(guān)EHP檢測方法的研究包括SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR方法、LAMP檢測方法、普通PCR方法以及巢式PCR方法等[12-16]。本研究針對EHP 18S相關(guān)保守序列，利用基因克隆方法構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)檢測所建立方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性和敏感性。結(jié)果顯示，不同檢驗(yàn)員進(jìn)行的樣品重復(fù)性檢測結(jié)果一致，方法重復(fù)性較好。敏感性結(jié)果顯示，所建方法在模板濃度為6.5×102copies/μL DNA時(shí)，仍有較強(qiáng)熒光信號，較普通PCR方法檢測靈敏度至少高出1個(gè)數(shù)量級。

從湛江市10家養(yǎng)殖場隨機(jī)抽取20份15～20日齡的南美白對蝦樣品，用本研究建立的EHP熒光PCR方法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)有6份陽性。這些樣品的WSSV、IHHNV、TSV檢測結(jié)果均為陰性；2個(gè)樣品的AHPND為陽性，其中1份樣品的EHP和AHPND均為陽性，說明存在2種疫病的混合感染。

2009年，我國首次暴發(fā)早期死亡綜合癥/急性肝胰腺壞死?。ˋHPND/EMS）[17]。該病首先從泰國快速蔓延到亞洲許多國家，并席卷了全球，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大影響[18]，已經(jīng)成為當(dāng)前南美白對蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最大障礙。AHPDA/EMS引起的高致死率吸引了人們更多的注意力，卻使人們忽視了EHP的影響。從湛江市的EHP流行情況來看，隨機(jī)抽取的蝦樣品EHP陽性率已達(dá)30%，但其臨床癥狀不明顯，沒有引起蝦農(nóng)的注意。EHP是通過親蝦垂直傳播，還是通過購買的蝦苗水平傳播，還有待研究。對對蝦所有生長周期進(jìn)行EHP監(jiān)測，分析EHP來源和流行特點(diǎn)，將是下一步的工作重點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Establishment and Application of Taqman Fluorescent PCR Method for Detection of Enterocytozoon hepatopenaei

Zhang Na1，Xie Yanhui1，Chen Jinhui2，Li Jiaqiao1，Si Ze′en1，Huang Lei1
（1. Zhanjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhanjiang，Guangdong 524000；2. Dongguan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Dongguan，Guangdong 441900）

S945.4

A

1005-944X（2017）10-0098-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.026

廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015GDK04、2016GDK51、2017GDK04）