賈亞婷，郭艷梅，蔡逸安，李昕悅，趙玉明，馬玲

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省生物研究所，太原030006）

不同菌種發(fā)酵乳品質(zhì)與抗氧化能力研究

賈亞婷1，郭艷梅1，蔡逸安1，李昕悅1，趙玉明2，馬玲1

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省生物研究所，太原030006）

研究了由不同菌種制作的酸奶發(fā)酵乳在冷藏期21 d內(nèi)品質(zhì)、抗氧化活性的變化，研制具有高抗氧化活性的發(fā)酵乳。通過(guò)對(duì)比傳統(tǒng)發(fā)酵乳與兩種益生菌發(fā)酵乳貯藏期的pH值、滴定酸度、黏度、持水力、ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率和總還原能力等指標(biāo)，研究益生菌對(duì)發(fā)酵乳品質(zhì)和抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，益生菌發(fā)酵乳在維持酸奶品質(zhì)、延長(zhǎng)市場(chǎng)貨架期方面優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵乳，在冷藏期21 d內(nèi)三種菌種發(fā)酵乳DPPH自由基清除能力和還原能力均有明顯的增加（P＜0.05），動(dòng)物雙歧桿菌BB-12發(fā)酵乳A700nm最高達(dá)0.481±0.06。在冷藏期1～7 d益生菌發(fā)酵乳ABTS自由基清除能力明顯高于傳統(tǒng)發(fā)酵乳。

發(fā)酵乳；菌種；冷藏；品質(zhì)；抗氧化活性

Abstract:In order to develop yoghurt with higher antioxidant activity,the properties and antioxidant changes of yoghurts made with differ?ent starter strains in 21 days cold(4℃)storage periods were determined,Indexes of pH,acidity,viscosity,water-holding power,ABTS free radical scavenging ability,DPPH free radical scavenging rate and total reducing power were investigated for both the traditional fermented milk and two kinds of probiotic fermented milk during cold(4℃)storage.The results showed that the probiotic fermented milk in mainting the yogurt quality,extend the shelf life of the products was better than the traditional fermented milk,all samples for DPPH radical scaveng?ing ability and reducing power has increased significantly during the 21 d cold storage(P＜0.05),the reduce power for BB-12 fermented milk as higher as up to 0.481± 0.06.the ABTS free radical scavenging ability for probiotic fermented milk was significantly higher than the tradi?tional fermented milk in 1～7 d cold storage.

Key words:yoghurt;strains;cold storage;quality;antioxidant activity

0 引言

乳酸菌作為一種天然的抗氧化劑，具有抗癌、降低膽固醇、治療各種胃腸道疾病及增強(qiáng)免疫力等的作用[1]，同時(shí)乳酸菌介導(dǎo)的發(fā)酵可以提高食品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此，發(fā)酵乳添加益生菌后可以將菌種的保健作用與發(fā)酵乳的健康功效完美結(jié)合起來(lái)。

目前相關(guān)方面也有一些研究，張睿[2]等的研究結(jié)果表明在貯藏期21 d內(nèi)，添加干酪乳桿菌與植物乳桿菌的益生菌發(fā)酵乳在硬度、稠度、黏度與凝聚性上與傳統(tǒng)發(fā)酵乳相比均有所增加。趙志文[3]等研究了單一及組合乳酸菌發(fā)酵乳對(duì)體外抑菌、抗氧化和降膽固醇等功能的影響，結(jié)果表明混合乳酸菌清除超氧陰離子的能力強(qiáng)于各組單菌株發(fā)酵乳。本研究將比較分別由保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌1∶1組成的混合發(fā)酵劑、動(dòng)物雙歧桿菌BB-12、嗜酸乳桿菌LA-14制備的發(fā)酵乳在冷藏期21 d內(nèi)的品質(zhì)及抗氧化活性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型高抗氧化活性發(fā)酵乳提供導(dǎo)向和理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料試劑

生鮮牛乳，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、動(dòng)物雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌等菌種（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院畜產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室保存），蔗糖(市售)，2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)ABTS,1,1-二苯基-2-苦肼基（自由基）DPPH，TCI原裝；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，HPP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱，0～4℃冰箱，ST2100pH計(jì)，NDJ-1指針式黏度計(jì)，F(xiàn)A2004電子分析天平，LD5-2B低速離心機(jī)，7200型分光光度計(jì)，XH-C漩渦振蕩器，恒溫水浴鍋。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將生鮮牛乳滅菌，冷卻至室溫后，分裝至滅菌后的試管中，然后分別接種保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、動(dòng)物雙歧桿菌BB-12、嗜酸乳桿菌LA-14凍干粉，置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行凝乳培養(yǎng)，反復(fù)傳代，直到符合生產(chǎn)發(fā)酵劑要求。

1.3.2 發(fā)酵乳的加工工藝流程

原料奶→均質(zhì)→加糖→殺菌→冷卻→接種→發(fā)酵→冷藏→后熟

接種3%由保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌按1∶1組成的混合發(fā)酵劑制作的發(fā)酵乳記為L(zhǎng)B+ST，接種3%動(dòng)物雙歧桿菌BB-12發(fā)酵劑制作的發(fā)酵乳記為BB12，接種3%嗜酸乳桿菌LA-14發(fā)酵劑制作的發(fā)酵乳記為L(zhǎng)A14。

pH值直接用ST2100pH計(jì)測(cè)定；黏度采用NDJ-1指針式黏度計(jì)測(cè)定。

1.3.3 酸度的測(cè)定[4]

取10 g發(fā)酵乳于三角瓶中，加入20 mL蒸餾水，滴入2～3滴酚酞指示劑，用濃度為0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，不斷輕微搖動(dòng)，直至微紅色在30 s內(nèi)不消失為止。樣品的酸度按下面公式計(jì)算：

式中：c為標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉的濃度（mol/L）；V為滴定所消耗標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉的體積（mol/L）；m為樣品質(zhì)量（g）；0.1為酸度理論定義NaOH的摩爾濃度（mol/L）。

1.3.4 發(fā)酵乳持水力的測(cè)定[5]

準(zhǔn)確稱(chēng)量一定質(zhì)量樣品于離心管中，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心10 min后，去除上清液后稱(chēng)重。樣品的保水性按下式計(jì)算：

式中:m1為離心前所稱(chēng)取樣品質(zhì)量（g）；m2為離心后去掉上清液樣品質(zhì)量（g）。

1.3.5 發(fā)酵乳抗氧化性的測(cè)定

樣品處理：將待測(cè)發(fā)酵乳與蒸餾水以體積比1:2的比例混勻配置成樣品溶液，按照如下方法分別測(cè)定三項(xiàng)抗氧化指標(biāo)。

（1）ABTS自由基清除能力

參考Linghong Liang[6]等的方法并略作改動(dòng)。將濃度為7 mmol/L的ABTS與2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀混勻在室溫避光條件下放置12～16 h，形成ABTS儲(chǔ)備液。ABTS儲(chǔ)備液用磷酸鹽緩沖溶液PBS（0.1 mol/L,pH=7.4）稀釋使其在734 nm波長(zhǎng)處吸光值為0.70±0.02。吸取0.5 mL待測(cè)樣品于反應(yīng)試管中，然后加入5 mL的ABTS稀釋液，用漩渦振蕩器充分混勻，暗處反應(yīng)6 min,于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)反應(yīng)液吸光值。

式中：AS為樣品吸光值；AC為對(duì)照組吸光值，即用同體積PBS代替ABTS稀釋液；Ab為樣品空白組吸光值。

（2）DPPH自由基清除能力

參考Linghong Liang[6]等的方法并略作改動(dòng)。將1 mL待測(cè)樣品與5 mL 0.1 mmol/L DPPH混合均勻，室溫下放置暗處反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光值。

式中：AS為樣品吸光值；AC為對(duì)照組吸光值，即用同體積無(wú)水乙醇代替DPPH；Ab為樣品空白組吸光值。

（3）總還原能力的測(cè)定

[7-8]中的方法并略作改動(dòng)。將1 mL待測(cè)樣品與2 mL磷酸鹽緩沖溶液PBS（濃度0.2 mol/L，pH=6.6），2 mL質(zhì)量濃度為10 g/L鐵氰化鉀混合后放于50℃恒溫水浴中20 min。反應(yīng)后加入2 mL質(zhì)量濃度為100 g/L的TCA混勻后離心（4 000 r/min,10 min），取上清液4 mL加入0.5 mL質(zhì)量濃度為1 g/L的FeCl3.混合液放置室溫反應(yīng)至溶液澄清后在600 nm處測(cè)吸光值。吸光值越大，表明抗氧化能力越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳的貯藏特性研究

2.1.1 冷藏期間產(chǎn)酸能力的測(cè)定結(jié)果

圖1為傳統(tǒng)乳酸菌LB+ST、動(dòng)物雙歧桿菌BB-12、嗜酸乳桿菌LA-14發(fā)酵乳冷藏期酸度的變化趨勢(shì)；圖2為冷藏期21 d pH值的變化趨勢(shì)。

圖1 不同菌種發(fā)酵乳冷藏期滴定酸度的變化趨勢(shì)

圖2 不同菌種發(fā)酵乳冷藏期pH的變化趨勢(shì)

由圖1和圖2可以看出，不同菌種產(chǎn)酸能力差異較大。在發(fā)酵初期（即冷藏1～7 d），LB+ST，BB12，LA14滴定酸度均明顯增加，且pH值的變化趨勢(shì)正好相反，這是由于在冷藏初期，菌種具有較強(qiáng)的代謝乳糖從而產(chǎn)酸的能力，酸度增加幅度較大。隨著冷藏期的延長(zhǎng)，滴定酸度增加趨勢(shì)和pH下降趨勢(shì)均逐漸平緩，這可能是酸性物質(zhì)增加抑制菌種的代謝產(chǎn)酸所致。酸度是衡量酸奶保質(zhì)期的一個(gè)重要指標(biāo)，由圖1可以看出，在冷藏1～7 d，傳統(tǒng)發(fā)酵乳酸度由67.5°T上升到98.5°T，變化幅度為31.0°T，而B(niǎo)B12和LA14分別由56.7°T上升到77.0°T、56.8°T上升到78.0°T，變化幅度分別為20.3°T和21.2°T。即在相同的冷藏條件下，動(dòng)物雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌發(fā)酵乳的產(chǎn)酸速度均低于傳統(tǒng)發(fā)酵乳，后酸化程度弱，這樣較好的保存了酸乳特征口味的穩(wěn)定，有利于延長(zhǎng)酸乳市場(chǎng)貨架期。

2.1.2 冷藏期間黏度、持水力的測(cè)定結(jié)果

由圖3可以看出，在21 d冷藏期間LB+ST、BB12、LA14的黏度變化趨勢(shì)均是先增大后減小。LA14黏度在冷藏第7 d達(dá)到最大值，之后下降，LB+ST和BB12黏度在冷藏第14天達(dá)到最大值后緩慢下降。在冷藏期21 d內(nèi)，與LB+ST、LA14比較，BB12發(fā)酵乳黏度變化較為緩慢，這可能與菌種的穩(wěn)定性及自身代謝有關(guān)[9]。圖4為L(zhǎng)B+ST，BB12，LA14冷藏期持水力的變化趨勢(shì)。

圖3 不同菌種發(fā)酵乳冷藏期黏度的變化趨勢(shì)

圖4 不同菌種發(fā)酵乳冷藏期持水力的變化趨勢(shì)

由圖4可以看出，在冷藏期21 d內(nèi)，三種菌種持水力均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵乳冷藏期間菌種不斷代謝需要水的參與[10]，也可能與發(fā)酵乳冷藏過(guò)程中較低的pH值環(huán)境破壞了凝膠體的結(jié)構(gòu)有關(guān)。BB12和LA14持水力均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。BB12在冷藏1～7 d內(nèi)持水力不斷增加，第7 d時(shí)達(dá)最大值61.80%，隨后持水力下降，在冷藏第21 d時(shí)達(dá)最小值47.84%。LA14在冷藏1～7 d內(nèi)持水力由56.50%上升至66.90%，之后不斷下降，第21天時(shí)持水力達(dá)最小值50.69%。傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵乳在冷藏期21 d內(nèi)持水力下降不明顯。BB12和LA14在冷藏1～14 d內(nèi)持水力均大于傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵乳，因此從持水力的角度來(lái)看，在一定保質(zhì)期內(nèi)，益生菌發(fā)酵乳品質(zhì)優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵乳。

2.2 發(fā)酵乳的抗氧化性活性測(cè)定結(jié)果

2.2.1 ABTS自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

ABTS法目前已被廣泛的應(yīng)用于抗氧化劑的體外抗氧化活性測(cè)定。在反應(yīng)體系中，ABTS經(jīng)氧化后生成相對(duì)穩(wěn)定的藍(lán)綠色的水溶性自由基ABTS+，抗氧化劑與ABTS+反應(yīng)后使反應(yīng)體系褪色，體系褪色越明顯表示被測(cè)物質(zhì)的抗氧化性活性越強(qiáng)。在ABTS自由基的特征吸收波長(zhǎng)下（734 nm）檢測(cè)吸光度的變化，能反應(yīng)抗氧化劑清除ABTS自由基活性的高低[11]。

由表1可知，LB+ST在冷藏期21 d內(nèi)，ABTS自由基清除率的變化范圍為（52.84%±0.17%）～（85.98%±0.30%），抗氧化活性有明顯的增加（P＜0.05）；發(fā)酵乳BB12在冷藏期21d內(nèi)，ABTS自由基清除率的變化范圍為（70.15%±0.11%）～（96.17%±0.16%），抗氧化活性有明顯的增加（P＜0.05）；發(fā)酵乳L(zhǎng)A14在冷藏期21d內(nèi)，抗氧化活性無(wú)顯著變化（P＞0.05）。由表1可知，在冷藏期第1 d和第7 d時(shí)，動(dòng)物雙歧桿菌BB-12和嗜酸乳桿菌LA-14發(fā)酵乳均具有較強(qiáng)的ABTS自由基清除能力，與傳統(tǒng)菌種酸乳L(zhǎng)B+ST相比差異顯著（P＜0.05）。

2.2.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

在DPPH自由基清除法中，DPPH可在乙醇溶液中形成一種紫紅色的穩(wěn)定的自由基，且在特征吸收波長(zhǎng)下（734 nm）具有典型的吸收峰。當(dāng)體系中存在抗氧化劑時(shí)，抗氧化劑提供氫電子和原子給DPPH自由基，使其生成無(wú)色產(chǎn)物，導(dǎo)致溶液的特征吸收峰值下降，吸光值變小。在此反應(yīng)中，在734 nm下檢測(cè)反應(yīng)體系吸光值的變化，能反應(yīng)被檢測(cè)物質(zhì)抗氧化能力的強(qiáng)弱[12]。

由表1可以看出，在冷藏期1～21 d內(nèi)發(fā)酵乳的DPPH自由基清除能力均有明顯的增加（P＜0.05），LB+ST、BB12、LA14發(fā)酵乳的增加趨勢(shì)幾乎一致。LB+ST在冷藏期第7 d時(shí)DPPH自由基清除率有明顯的增加（P＜0.05），在第21 d時(shí)達(dá)到最大值84.24%±0.14%；BB12在冷藏期第1～14 d內(nèi)變化范圍為（61.11±0.25）～（97.26±0.18），抗氧化活性明顯增加（P＜0.05）；LA14在冷藏期第21 d達(dá)到最大值82.14±0.30，抗氧化活性明顯增加（P＜0.05）。在同一冷藏期三種不同菌種的清除DPPH能力無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.2.3 還原能力的測(cè)定結(jié)果

抗氧化劑的還原能力與抗氧化活性成正相關(guān)。根據(jù)還原力的測(cè)定方法，A700nm越大，則抗氧化劑的還原能力越強(qiáng)，即抗氧化活性越強(qiáng)[13]。由表1可以看出，無(wú)論傳統(tǒng)發(fā)酵乳還是益生菌發(fā)酵乳，還原能力隨著冷藏期的延長(zhǎng)均呈增強(qiáng)的趨勢(shì)。在冷藏期第14天和第21 d時(shí)，發(fā)酵乳BB12的還原力明顯高于LB+ST和LA14（P＜0.05），其A700nm最高達(dá)0.481±0.06。

表1 發(fā)酵乳冷藏期抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

唐雪梅[14]研究了干酪乳桿菌胞外多糖的抗氧化性能，結(jié)果表明隨著干酪乳桿菌胞外多糖濃度的增大，對(duì)DPPH自由基的清除率也增大。T.Amatayakul等[15]的研究由牛奶添加不同比例酪蛋白和乳清蛋白制作的酸奶在4℃冷藏21 d內(nèi)的胞外多糖濃度變化，發(fā)現(xiàn)在冷藏期21 d內(nèi)胞外多糖的濃度均有所增加。王曦等[11]對(duì)35株乳酸菌的菌體、無(wú)細(xì)胞提取物以及胞外分泌物的抗氧化能力進(jìn)行研究，結(jié)果表明抗氧化活性物質(zhì)較多分布在胞外分泌物中。本研究結(jié)果表明三種不同菌種發(fā)酵乳在21 d冷藏期抗氧化活性均增強(qiáng)。由此推測(cè)引起發(fā)酵乳中起抗氧化作用的物質(zhì)主要是胞外多糖，其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究闡明。Vaya Chouchouli等[16]以DPPH自由基清除率和還原能力為指標(biāo)，研究乳酸菌發(fā)酵乳在冷藏32 d內(nèi)的抗氧化活性，結(jié)果表明隨著貯藏期的延長(zhǎng)DPPH自由基清除率降低，而還原能力在貯藏1～21 d時(shí)先增加后降低。與本研究存在差異，推測(cè)原因可能是發(fā)酵乳制作工藝的不同及菌種配比不同。

3 結(jié)論

（1）本研究主要研究了不同菌種發(fā)酵乳在4℃冷藏21 d的pH值、酸度、粘度與持水力的變化。結(jié)果表明傳統(tǒng)發(fā)酵乳和益生菌發(fā)酵乳的酸度隨冷藏期的延長(zhǎng)均增加，而pH值、黏度與持水力均降低，發(fā)現(xiàn)益生菌發(fā)酵乳的后酸化程度較傳統(tǒng)發(fā)酵乳弱，黏度、持水力變化程度弱（P＜0.05），其在維持酸奶品質(zhì)、延長(zhǎng)市場(chǎng)貨架期方面優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵乳。

（2）以ABTS自由基清除率為指標(biāo)測(cè)定時(shí)，在4℃冷藏第1天和第7 d BB12和LA14的自由基清除率大于LB+ST，在第21 d BB12的自由基清除率大于LB+ST和LA14；從DPPH自由基清除率的結(jié)果來(lái)看，在冷藏第7 d BB12和LA14的自由基清除率大于LB+ST；還原力的測(cè)定結(jié)果可以看出，在冷藏第1天BB12和LA14的抗氧化活性大于LB+ST，在冷藏第14 d和第21 d時(shí)BB12的抗氧化活性大于LB+ST和LA14（P＜0.05）。綜合以上三個(gè)測(cè)定指標(biāo)，益生菌發(fā)酵乳的抗氧化活性在一定的貯藏期內(nèi)強(qiáng)于傳統(tǒng)發(fā)酵乳，具有較好的市場(chǎng)前景，也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型高抗氧化活性發(fā)酵乳提供了依據(jù)。

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Research of quality and antioxidant capacity for fermented milk with different strains

JIA Yating1，GUO Yanmei1，CAI Yian1，LI Xinyue1，ZHAO Yuming2,MA Ling1
（1.College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China;2.Biology Institute of Shanxi,Taiyuan 030006,China）

TS252.54

A

1001-2230（2017）09-0022-04

2017-02-28

山西省大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（201610113045）；山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（201603D21108-02）。

賈亞婷（1995-），女，本科，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

馬玲