黎 穎，唐 佳，熊維建，宋 娜，賴宗浪，周 鑫，鐘 錦△

(重慶市中醫(yī)院：1.腎病科；2.腫瘤科；3.內(nèi)分泌科 400021)

論著·基礎(chǔ)研究

補腎活血排毒法組方中藥對慢性腎臟病大鼠腎臟細胞凋亡的影響*

黎 穎1，唐 佳1，熊維建1，宋 娜2，賴宗浪2，周 鑫3，鐘 錦1△

(重慶市中醫(yī)院：1.腎病科；2.腫瘤科；3.內(nèi)分泌科 400021)

目的觀察補腎活血排毒法組方中藥對慢性腎臟病大鼠的治療作用及細胞凋亡的影響。方法采用單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)動物模型，將SD雄性大鼠分為假手術(shù)組、UUO模型組、補腎活血排毒法中藥低劑量治療組和高劑量治療組，自動生化分析儀檢測腎功能；蘇木素-伊紅(HE)染色檢測腎臟組織病理損傷；TUNEL法檢測腎組織細胞凋亡；Western blot法檢測B淋巴細胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)水平。結(jié)果與UUO模型組相比，補腎活血排毒法中藥各劑量組血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)均明顯下降(P<0.05)。病理觀察，模型組可見腎小管上皮細胞凋亡、壞死、脫落，炎性細胞浸潤，補腎活血排毒法中藥各劑量組均較UUO模型組腎損傷程度輕(P<0.05)。TUNEL法檢測UUO模型組細胞凋亡數(shù)較假手術(shù)組明顯增多，補腎活血排毒法中藥各劑量組可顯著減少細胞凋亡數(shù)目(P<0.05)。與UUO模型組相較，補腎活血排毒法中藥各劑量治療組Bcl-2水平明顯上調(diào)，Bax 水平下調(diào)，Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)。以上結(jié)果均呈劑量依賴性。結(jié)論補腎活血排毒法中藥能明顯下調(diào)血清肌酐和尿素氮水平，抑制UUO大鼠腎臟細胞凋亡，調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax水平。

慢性腎臟?。恢兴幆煼?；細胞凋亡；補腎活血排毒法組方中藥；Bcl-2/Bax

慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)是由各種原因造成的腎單位嚴(yán)重受損，腎小球濾過率進行性下降，機體排泄代謝廢物和調(diào)節(jié)水電解質(zhì)、酸堿平衡紊亂的臨床綜合征[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對CKD的有效治療主要為血液透析和腎移植等，但其均不能用于治療早中期CKD，且費用昂貴，已成為患者家庭的沉重負(fù)擔(dān)。因此，如何延緩CKD病程的進展，已成為醫(yī)學(xué)界面臨的重大課程。補腎活血排毒法組方中藥是本院國醫(yī)大師鄭新教授治療CKD患者的經(jīng)驗方，在多年臨床治療中取得滿意療效。為進一步探討其作用機制，本實驗觀察補腎活血排毒法組方中藥對單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)所致CKD大鼠腎臟細胞凋亡的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物選用健康SD雄性大鼠，5～7周齡，體質(zhì)量220～280 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。補腎活血排毒法組方中藥：黃芪、紅參、大黃、淫羊藿、川芎、杜仲等，均購自重慶市中醫(yī)院中藥房，經(jīng)煎煮、過濾、水浴蒸發(fā)分別濃縮至2.0 g·kg-1·d-1和4.0 g·kg-1·d-1，置于冰箱保存。主要試劑為TUNEL檢測細胞凋亡試劑盒購自美國Sigma公司，兔抗大鼠B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

表1 治療前與治療后各組BUN、Scr變化比較

a：P<0.05,與假手術(shù)組比較；b：P<0.05,與UUO模型組比較；c:P<0.05，與治療前比較；d:P<0.05，與低劑量組比較

1.2方法

1.2.1動物模型的建立與分組 UUO動物模型的建立：大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，采用左側(cè)背部切開腹腔，鈍性分離左側(cè)輸尿管，于輸尿管中上1/3 處以4-0線雙重結(jié)扎后切斷輸尿管，分層縫合關(guān)閉腹腔。48只大鼠分4組：(1)假手術(shù)組；(2)UUO模型組；(3)補腎活血排毒法中藥低劑量組(簡稱低劑量組)；(4)補腎活血排毒法中藥高劑量組(簡稱高劑量組)。假手術(shù)組只找到輸尿管，不結(jié)扎，常規(guī)喂養(yǎng)。各組大鼠分別于術(shù)后第14天時分批(12只)處死，留取大鼠血液標(biāo)本及左側(cè)腎臟。

1.2.2給藥方法 于手術(shù)后第1天開始灌胃給藥治療，補腎活血排毒法組方中藥治療組分別予高劑量(4.0 g·kg-1·d-1)和低劑量(2.0 g·kg-1·d-1)灌胃，UUO模型組予等量0.9%生理鹽水，每天1次,連續(xù)14 d,實驗過程中大鼠自由進食、飲水，室溫控制在20～24 ℃，通風(fēng)濕度良好。

1.2.3生化分析儀檢測腎功能 治療前取尾靜脈血，治療后斷頭取血，采血前禁食8 h。血尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)用生化分析儀測定。

1.2.4組織病理學(xué)檢查 取經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h的腎臟組織標(biāo)本，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4 μm的石蠟切片，按常規(guī)方法進行蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.2.5Western blot法檢測目的蛋白 Western blot分析腎臟組織Bcl-2、Bax的表達。用總蛋白裂解液提取腎臟總蛋白，二喹啉甲酸法(BCA)測定蛋白質(zhì)濃度，每泳道上樣40 μg 蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%牛血清清蛋白TBST溶液室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后再以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育；洗膜，加電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液，F(xiàn)ujifilm化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照。Image Pro Plus 6.0 分析各條帶的累積光密度值，將各目的條帶與同一泳道內(nèi)參照β-actin 的累積光密度值的比值作為該泳道中目的蛋白表達的半定量結(jié)果。

1.2.6TUNEL法檢測細胞凋亡 石蠟切片厚4 μm，常規(guī)脫蠟入水。3%H2O2室溫處理10 min,加1∶100 TBS新鮮稀釋的蛋白酶K 37 ℃消化10 min。洗滌后加脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)和地高辛標(biāo)記的脫氧核苷(Dig-dUTP),置濕盒中4 ℃過夜。洗滌，加封閉液室溫30 min，加1∶100封閉液稀釋的生物素化抗地高辛抗體，37 ℃ 30 min，加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)試劑盒37 ℃ 30 min，充分水洗后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，光鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腎功能比較 UUO模型組大鼠的BUN、Scr在術(shù)后明顯上升(P<0.05)；術(shù)后，高劑量組和低劑量組的BUN和Scr較UUO模型組明顯下降(P<0.05)，其中高劑量組組較低劑量治療組腎功能改善更明顯(P<0.05)，見表1。

2.2各組大鼠腎臟病變比較 HE染色顯示，光鏡下假手術(shù)組大鼠腎小管基底膜完整，小管上皮細胞結(jié)構(gòu)清晰，未見變性壞死，腔內(nèi)未見管型。UUO模型組大鼠在皮質(zhì)區(qū)及外髓質(zhì)區(qū)可以見到典型的腎小管壞死，包括腎小管上皮細胞凋亡(RTECs)嚴(yán)重變性、崩解和脫落，腎小管管腔擴張，腎間質(zhì)水腫及炎癥細胞浸潤。而高、低劑量組的腎組織損傷程度較UUO模型組有所減輕，高劑量組較低劑量組病理改善更明顯。半定量評分顯示高、低劑量組的腎損傷程度明顯低于UUO模型組(P<0.05)，高劑量組較低劑量組腎損傷程度輕(P<0.05)，見圖1。

A:假手術(shù)組;B:UUO模型組;C:低劑量組;D：高劑量組；E：半定量分析圖

圖1各組大鼠腎臟病變比較(HE，×400)

2.3各組大鼠腎臟凋亡比較 假手術(shù)組腎組織中僅見到極其少量的TUNEL陽性細胞；UUO模型組大鼠見到大量TUNEL陽性細胞，主要分布在腎臟的皮質(zhì)區(qū)和外髓質(zhì)區(qū)；高、低劑量組的TUNEL細胞凋亡數(shù)均較UUO模型組減少，高劑量組的TUNEL細胞凋亡數(shù)較低劑量組明顯減少(P<0.05)，見圖2。

2.4各組大鼠腎臟Bcl-2、Bax水平比較 UUO模型組腎組織中Bcl-2、Bax水平較假手術(shù)組明顯升高，但Bcl-2/Bax比值下降。高、低劑量組腎臟Bcl-2水平較UUO模型組明顯升高，但Bax水平明顯下降，Bcl-2/Bax比值高于假手術(shù)組和UUO模型組(P<0.05)，高劑量組Bcl/Bax比值較低劑量組更高(P<0.05)，見圖3。

A:假手術(shù)組;B:UUO模型組;C:低劑量組;D：高劑量組;E:定量分析圖

圖2各組慢性腎衰竭大鼠腎臟凋亡比較(TUNEL,×400)

A:大鼠腎臟組織Bcl-2蛋白水平比較;B:大鼠腎臟組織Bax蛋白水平比較;C：Bcl-2/Bax比值強度比較

圖3各組Bcl-2和Bax水平比較

3 討 論

CKD屬于中醫(yī)“水腫”“溺毒”“關(guān)格”“虛勞”等范疇。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)識CKD病因病機多為臟腑虛損，又因外邪侵襲，情志所傷，勞累過度而使病情加重，最后導(dǎo)致正虛邪實[2-3]。本院國醫(yī)大師鄭新教授認(rèn)為正虛與濁毒、久病而瘀是本病的中心環(huán)節(jié)，其研制的以扶正祛邪法為大法的補腎活血排毒法組方中藥，具有補腎活血、排毒降濁的功效，可改善腎虛血瘀的病理變化，使機體陰陽平衡，扶正祛邪[4]。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，補腎活血排毒法組方中藥可顯著降低患者血中SCr、BUN的水平，以改善CKD患者脘腹脹滿、食少納呆、惡心嘔吐、大便秘結(jié)不通等癥狀，延緩CKD患者的病程進展[5]，但其具體作用機制，尚不清楚。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實RTECs是CKD重要的發(fā)病機制之一[6-8]。CKD患者腎臟局部炎癥因子過度表達，腎素-血管緊張系統(tǒng)(RAS)激活，氧化應(yīng)激反應(yīng)等導(dǎo)致RTECs線粒體損傷，線粒體膜通透性改變，凋亡蛋白包括細胞色素-C(Cyt-C)、激活胱天蛋白酶(Caspase)蛋白酶、細胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等從線粒體到胞質(zhì)，導(dǎo)致RTECs凋亡[9-11]。因此，抑制RTECs的凋亡，改善腎小管間質(zhì)的損傷，是延緩CKD進展的重要干預(yù)環(huán)節(jié)。在本實驗研究發(fā)現(xiàn)，單側(cè)切斷大鼠輸尿管14 d，存在著腎小管間質(zhì)明顯損傷、RTECs凋亡，并且與腎小管壞死甚至結(jié)構(gòu)消失相平行。RTECs大鼠經(jīng)補腎活血排毒法中藥治療后，RTECs凋亡明顯減少，腎臟病理損害和功能異常明顯得到改善，提示可以通過補腎活血排毒法組法中藥治療抑制RTECs凋亡而發(fā)揮腎臟保護作用。

大量研究進一步證實線粒體/Cyt-C信號通路是激活 Caspase執(zhí)行細胞凋亡的重要途徑。Bcl-2家族對該途徑有重要的調(diào)控作用，其中Bcl-2/Bax比率調(diào)控著線粒體膜是否受損及細胞是否發(fā)生凋亡。線粒體膜受損后釋放Cyt-C，Cyt-C與細胞凋亡因子Apaf1形成復(fù)合物激活Caspase-9，進而級聯(lián)激活Caspase-3，導(dǎo)致細胞凋亡[12-13]。大鼠造模14 d后，Bcl-2與Bax的表達均明顯升高，但Bax升高更明顯，故Bcl-2/Bax比值降低，細胞凋亡增加，這與其他學(xué)者的研究報道相一致[14-15]；給予UUO大鼠補腎活血排毒法組方中藥治療后，Bcl-2、Bcl/Bax水平明顯升高，而Bax的表達則明顯下降，并呈劑量依賴，提示補腎活血排毒法中藥可能通過促進Bcl-2的表達、抑制Bax的表達，發(fā)揮抗凋亡作用。

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Effectofnourishingkidney,activatingbloodandexpellingtoxinmethodChinesemedicineonrenalcellsapoptosisinCKDrats*

LiYing1,TangJia1,XiongWeijian1,SongNa2,LaiZonglang2,ZhouXin3,ZhongJin1△

(1.DepartmentofNephrology;2.DepartmentofOncology;3DepartmentofEndocrinology,ChongqingMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400021,China)

ObjectiveTo observe the curative effect of nourishing kidney,activating blood and expelling toxin method Chinese medicine on chronic kidney disease (CKD) rats and influence on cellular apoptosis.MethodsThe UUO animal model was adopted.SD male rats were divided into the sham operation group,UUO model group,Chinese medicine low dose group and high dose group.The renal function was measured by the automatic biochemical analyzer,the renal histopathologic change was observed by HE staining,the renal tissue apoptosis rate was observed by TUNEL as well as the protein expression levels of Bcl-2 and Bax were detected by Western blot.ResultsCompared with the UUO model group,the levels of serum creatinine(Scr) and urea nitrogen(BUN) in Chinese medicine various doses groups were significantly decreased(P<0.05).In the UUO pathologic observation,renal tubular epithelial cells apoptosis,necrosis,exfoliation,inflammatory cells infiltration were found in the model group,the renal damage in the Chinese medicine various doses groups were slighter compared with the UUO group(P<0.05).The TUNEL method detection showed that the cellular apoptosis number in the UUO group was significantly increased compared with the sham operation group,the Chinese medicine various doses groups could significantly decrease the apoptosis number(P<0.05).Compared with the UUO model group,the level of Bcl-2 in the Chinese medicine treatment groups was markedly up-regulated,the Bax level was down-regulated,and the ratio of Bcl-2/Bax was increased(P<0.05).Above results all showed the dose dependent manner.ConclusionThe nourishing kidney,activating blood and expelling toxin method Chinese medicine can obviously down-regulate serum Scr and BUN levels,inhibits the renal cells apoptosis in UUO rat and regulates the Bcl-2 and Bax levels.

chronic kidney disease；drug therapy；apoptosis；the chinese herbs with the function of activating the blood and removing the blood stasis;Bcl-2/Bax

R-33

A

1671-8348(2017)26-3611-03

2017-02-22

2017-06-06)

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.004

重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究項目(cstc2017jcyjAX0465)。

黎穎(1983-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事慢性腎臟病方面研究?！?/p>

，E-mail:120852723@qq.com。