喻日成，羅建華，劉 倩

(貴州省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴陽 550000)

論著·基礎研究

n-3多不飽和脂肪酸對大鼠非酒精性脂肪肝的改善作用

喻日成，羅建華，劉 倩

(貴州省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴陽 550000)

目的探討n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)對高脂誘導的 Wister大鼠非酒精性脂肪性肝(NAFLD)的改善作用。方法Wister雄性大鼠30只，分為正常組、模型組、n-3 PUFA組。采用高脂喂養(yǎng)建立NAFLD模型，實驗20周后，每組抽出7只大鼠檢測血清及肝臟總膽固醇(TG)及三酰甘油(TC)；其余3只大鼠肝臟蘇木精-伊紅(HE)染色；應用實時定量PCR(Real time-qPCR)及Western blot檢測肝臟組織單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α) mRNA及蛋白水平。結果模型組大鼠血清及肝臟TG、TC水平明顯高于對照組(P<0.01)，加入n-3 PUFA后血清及肝臟的TG、TC水平明顯下降(P<0.05)。HE染色能明顯觀察到模型組大鼠肝細胞脂肪變性，而n-3 PUFA有明顯改善效果。模型組大鼠炎癥分子MCP-1、iNOS、TNF-α基因表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，而n-3 PUFA組與模型組比較，MCP-1、iNOS、TNF-α炎癥分子的表達水平明顯下降(P<0.05)。結論高脂喂養(yǎng)能引起大鼠肝臟嚴重的脂肪變性及炎性反應，而n-3 PUFA起明顯的改善作用。

脂肪肝，酒精性；脂肪酸類，不飽和；n-3多不飽和脂肪酸；非酒精性脂肪肝??；單核細胞趨化蛋白-1

亞太地區(qū)的非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)患病率為12%～24%，已成為一種危害極大的公共衛(wèi)生問題[1]。NAFLD是由非酒精因素引起的肝內(nèi)嚴重的脂肪變性，與脂代謝異常、胰島素抵抗、肥胖及代謝綜合征關系密切[2]。n-3多不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acid，n-3 PUFA)能抑制脂質(zhì)合成、促進脂質(zhì)分解，同時也有抗炎和增加胰島素敏感性的作用[3]。本研究對n-3 PUFA對大鼠NAFLD胰島素抵抗及肝臟炎癥的影響進行探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級Wister雄性大鼠30只，初始體質(zhì)量(160±10)g，中南大學湘雅醫(yī)學院動物中心提供。RNA提取試劑盒購自Qiagen公司；逆轉錄試劑盒購自Applied Biosystems公司；LightCycler?TaqMan?Master購自Roche公司；單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、β-肌動蛋白(β-actin)一抗購自BD Biosciences公司；辣根過氧化物酶(HRP) 標記的二抗購自Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1動物飼養(yǎng)及標本留取 30只Wister雄性大鼠，分為3組：正常組，模型組，n-3 PUFA組，每組10只。正常組喂基礎飼料(蛋白質(zhì)22%，脂肪12%，碳水化合物66%)，模型組喂高脂飼料(蛋白質(zhì)9%，脂肪66%，碳水化合物25%)，8周后n-3 PUFA組加入1.0 g/d n-3 PUFA。喂養(yǎng)20周后，每周抽出3只大鼠，取肝臟同一部位經(jīng)固定后行蘇木精-伊紅(HE)染色，其余7只大鼠斷頭處死后分離血清，進行相關指標的測定，肝臟取出后用液氮速凍并保存于-80 ℃，用于后續(xù)實驗。

表1 Real-time PCR引物

1.2.2指標測定 采用酶法試劑盒測定血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC),操作過程按說明書進行。稱取肝臟100 g，加入900 μL異丙醇作為介質(zhì)充分勻漿，3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，檢測TG、TC。取3只大鼠同一部位肝臟經(jīng)4%多聚甲醛固定，行常規(guī)HE染色。

1.2.3實時定量PCR(Real time-qPCR)檢測MCP-1、iNOS、TNF-α基因mRNA表達

1.2.3.1總RNA制備 取肝臟組織100～150 mg，勻漿，加入1 mL TRIzol，按Qiagen試劑盒說明書介紹的方法提取總RNA，采用Nanodrop ND1000 測量RNA的濃度。

1.2.3.2cDNA合成 按逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，每個反應體系含：1.0 μg RNA，2.0 μL 10×RT緩沖液，0.8 μL dNTP，2.0 μL隨機引物，1.0 μL逆轉錄酶，總反應體系20.0 μL，反應條件：25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min，4 ℃后取出樣品，-20 ℃保存。

1.2.3.3PCR擴增 PCR總反應體系為10.0 μL，含cDNA模板2.0 μL，TaqMan?Master 5.0 μL，ddH2O 2.5 μL，正、反向引物各0.5 μL(表1)。PCR 反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s,60 ℃ 1 min，72 ℃ 20 s，45個循環(huán)；72 ℃ 5 min。每個qPCR重復3次，以PPIA為管家基因，目的基因的相對表達量通過公式2-ΔΔCt計算。

1.2.4Western blot檢測MCP-1、iNOS、TNF-α蛋白的表達 (1)大鼠肝臟總蛋白提?。喝〈笫蟾闻K組織100 mg，加入1 mL RIPA裂解液，充分勻漿后提取總蛋白，通過二喹啉甲酸(BCA)方法測量蛋白濃度。(2)將30 μg的蛋白樣品加入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳點樣孔，100 V電壓電泳2 h。(3)電泳完的凝膠轉聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%的脫脂牛奶封閉，MCP-1、TNF-α、iNOS及β-actin一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，加辣根過氧化物酶標記的二抗常溫下30 min，TBST洗3次。(4)化學發(fā)光法顯影、定影，將膠片進行掃描拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標帶的相對分子質(zhì)量和凈光密度值。

2 結 果

2.1各組大鼠血清及肝臟TC、TG水平 模型組大鼠血清及肝臟TG、TC水平明顯高于對照組(P<0.05)，加入n-3 PUFA后血清及肝臟的TG、TC水平較模型組明顯下降(P<0.05)，見表2。

2.2各組大鼠HE染色結果 光鏡下對照組大鼠肝組織結構完整，肝細胞排列緊密，肝小葉結構正常，細胞核位于細胞中央，核大而圓，無脂滴；模型組大鼠肝臟內(nèi)有彌漫性肝細胞脂肪變性，脂肪浸潤明顯，肝細胞內(nèi)可見大小不一的脂滴；n-3 PUFA組肝細胞脂肪變性較模型組明顯改善，僅見輕度脂肪沉積，見圖1。

表2 n-3 PUFA降低大鼠肝臟及血清TC、TG

a：P<0.01，與模型組比較

A:對照組；B：模型組；C：n-3 PUFA組

圖1光鏡下大鼠肝臟組織病理改變(HE，×400)

A：MCP-1；B：iNOS；C:TNF-2；1:對照組；2：模型組；3：n-3 PUFA組

圖2大鼠肝臟MCP-1、iNOS、TNF-α基因表達

2.3n-3 PUFA對大鼠肝臟組織炎癥分子基因表達的影響 Real time-qPCR及Western blot結果顯示：模型組大鼠炎癥分子MCP-1、iNOS、TNF-α mRNA及蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，而n-3 PUFA組與模型組比較，MCP-1、iNOS、TNF-α炎癥分子的mRNA及蛋白表達水平均明顯下降(P<0.05)，見圖2。

3 討 論

多個臨床研究證實增加飲食中n-3 PUFA水平能降低三酰甘油水平、降低血壓、減少肝臟炎癥、改善胰島素抵抗[4-5]。非酒精性肝硬化患者行肝臟活檢發(fā)現(xiàn)n-3/n-6多不飽和脂肪酸水平降低[6]。有研究表明飲食中n-3PUFA能通過孕烷X受體(PXR)及法尼醇X受體(FXR)信號通路改善NAFLD纖維化及硬化[7]。本研究采用國內(nèi)外廣泛應用的方法，利用高脂喂養(yǎng)建立大鼠NAFLD病模型。本研究結果表明高脂喂養(yǎng)大鼠20周后，大鼠血清TG、TC明顯高于正常對照組，肝臟組織的TG、TC亦明顯高于對照組。肝臟組織的HE染色觀察到高脂喂養(yǎng)的大鼠存在嚴重的脂肪變性，而對照組大鼠的肝細胞形態(tài)正常，這些結果表明通過高脂喂養(yǎng)成功建立了大鼠的NAFLD模型。

NAFLD的發(fā)病機制目前尚不明確，有研究表明肝臟的炎癥及纖維化在NAFLD的發(fā)病環(huán)節(jié)中起重要作用，一些炎癥因子如TNF-α及活性氧(ROS)通過上調(diào)肝臟轉化生長因子-β(TGF-β)及α-平滑肌機動蛋白(SMA)參與NAFLD的發(fā)病過程[8-9]。本研究結果表明高脂喂養(yǎng)大鼠建立NAFLD模型后肝臟組織的炎癥因子MCP-1、iNOS、TNF-α表達明顯上調(diào)，結果與國外研究一致。TNF-α是肝臟炎癥的重要標志物，在肝臟的損害及肝纖維化中起重要作用[10]。MCP-1促進巨噬細胞浸潤肝臟，國外研究表明MCP-1基因敲除的小鼠肝臟巨噬細胞的浸潤減少，肝臟的炎性反應減輕[11]。n-3 PUFA具有明顯的抗炎及改善胰島素抵抗作用，能減少脂肪組織及肝臟組織的炎癥分子如TNF-α的表達[12]。本研究結果表明NAFLD模型組大鼠加入n-3 PUFA喂養(yǎng)20周后，肝臟組織脂肪變性明顯改善，肝臟組織TC、TG水平明顯降低，炎癥分子MCP-1、iNOS、TNF-α表達明顯下調(diào)。有研究表明n-3 PUFA通過激活過氧化物酶增殖活化受體-α(PPAR-α)及下調(diào)類固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)的基因表達增加肝臟脂肪酸氧化。n-3 PUFA亦可通過核因子kappa B通路減少肝臟及脂肪組織的炎性反應，明顯減少肝臟組織TNF-α的表達[13-14]。

n-3 PUFA具有明顯抗炎及改善脂代謝作用，能明顯減少NAFLD大鼠肝臟脂肪變性及肝臟組織TG、TC水平，減少肝臟組織的炎性反應，為臨床工作中NAFLD防治提供一定的理論依據(jù)。

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Improvementeffectofn-3polyunsaturatedfattyacidonratnonalcoholicfattyliverdisease

YuRicheng,LuoJianhua,LiuQian

(DepartmentofEndocrinology,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550000,China)

ObjectiveTo investigate the improvement effect of n-3 polyunsaturated fatty acid (n-3 PUFA) on rat nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD) induced by high fat diet.MethodsThirty Wister male rats were divided into the control group,model group and n-3 PUFA group.The high fat feeding was adopted to establish NAFLD model.After 20 weeks of experiment,7 cases were extracted from each group for detecting serum and liver total cholesterol (TC) and triacylglyceride(TG);other 3 cases were performed the liver HE staining,the levels of MCP-1,iNOS,TNF-α mRNA protein were detected by using the Real time quantitative PCR(qPCR) and Western blot.ResultsThe TC and TG levels in serum and livers of the model group were significantly higher than those in the control group(P<0.01),but which were evidently decreased after adding n-3 PUFA(P<0.05).The HE staining clearly observed the rat hepatic cells fatty degeneration in the model group,while polyunsaturated fatty acid had obvious improvement effect on it.The inflammatory molecule MCP-1,iNOS,TNF-α gene expression levels in the model group were significantly higher than those in the control group(P<0.05),while the expression levels of MCP-1,iNOS and TNF-α in the n-3PUFA group were significantly decreased compared with the model group.ConclusionHigh fat feeding can cause the severe fatty degeneration in rat liver,but polyunsaturated fatty acid can play obvious improvement effect.

fatty liver,alcoholic；fatty acids,unsaturated；n-3 Polyunsaturated fatty acid；nonalcoholic fatty liver disease；monocyte chemotactic protein-1

R589.2

A

1671-8348(2017)26-3620-03

2017-02-18

2017-06-06)

喻日成(1976-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事糖尿病慢性并發(fā)癥及肥胖方面研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.007