王淑惠，姜紅心，李曉雙，胡夢(mèng)琪，于 海，張 明，于樹娜，王健欣，蔣吉英△

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院2013級(jí)17班,山東濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,山東濰坊 261053；3.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院2013級(jí)7班,山東濰坊 261053)

N-乙酰-L-色氨酸對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注后腸損傷的保護(hù)作用*

王淑惠1，姜紅心2，李曉雙2，胡夢(mèng)琪3，于 海2，張 明2，于樹娜2，王健欣2，蔣吉英2△

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院2013級(jí)17班,山東濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,山東濰坊 261053；3.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院2013級(jí)7班,山東濰坊 261053)

目的探討N-乙酰-L-色氨酸(L-NAT)對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注中腸損傷的保護(hù)作用。方法將健康成年雄性SD大鼠24只分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(IR組)和缺血再灌注加L-NAT組(IR+L-NAT組)。用夾閉肝中葉和左葉肝蒂分支的方法制作肝缺血再灌注模型，用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察小腸組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu),用免疫組織化學(xué)染色觀察激活型Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果(1)IR組小腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞，腸黏膜充血脫落,上皮細(xì)胞變性壞死，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；L-NAT可使之減輕。(2)免疫組織化學(xué)染色顯示，與Sham組相比，IR組激活型Caspase-3、Bcl-2和bax的表達(dá)升高，L-NAT干預(yù)后，Caspase-3和Bax的表達(dá)下降，而Bcl-2的表達(dá)進(jìn)一步升高。結(jié)論L-NAT可抑制肝臟缺血再灌注損傷引起的小腸上皮細(xì)胞凋亡，減輕小腸上皮細(xì)胞損傷。

缺血再灌注損傷;小腸;N-乙酰-L-色氨酸;細(xì)胞凋亡;大鼠

在近代肝臟外科手術(shù)中，腸道損傷是常見的病理生理現(xiàn)象,手術(shù)中肝門阻斷可造成門靜脈淤血致腸黏膜屏障破壞,腸黏膜通透性增高,引發(fā)腸內(nèi)毒素及菌群移位,加重肝臟缺血再灌注損傷，形成惡性循環(huán)[1-2]，從而影響手術(shù)的成功率和患者的存活率。有研究發(fā)現(xiàn),P物質(zhì)(substance P,SP)通過SP/NK-1系統(tǒng)參與了心、腦、肝、胰腺、肺、結(jié)腸等多種內(nèi)臟器官的氧化應(yīng)激損傷[3-7]。N-乙酰-L-色氨酸(N-acetyl-L-tryptophan,L-NAT)具有拮抗NK-1受體的作用[8],但對(duì)肝臟缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)后小腸上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用尚未見報(bào)道。本研究通過建立肝臟IR模型,探討L-NAT對(duì)腸損傷的保護(hù)作用，為開發(fā)治療肝臟IR后腸損傷的新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組、動(dòng)物模型的制備和藥物預(yù)處理 健康成年雄性SD大鼠24只，購(gòu)自山東魯抗制藥有限公司，體質(zhì)量200～250 g。分為假手術(shù)組(Sham組)、IR組、IR加L-NAT組(IR+L-NAT組)，每組8只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，自由飲水。用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，上腹部正中切口，游離肝門血管，無創(chuàng)血管夾夾至肝左葉、中葉肝蒂的分支30 min，夾閉后肝的顏色由紅色變?yōu)榘底霞t色，表明模型制作成功。在30 min后去除血管夾復(fù)流形成再灌注，逐層關(guān)腹。6 h后開腹取小腸中段組織。IR+L-NAT組在制備IR模型前30 min腹腔注射10 mg/kg L-NAT，其他處理同IR組。Sham組僅行麻醉開腹分離至左葉、中葉的入肝管道，但不阻斷肝血流。

1.2取材與切片 取部分大鼠小腸組織，生理鹽水沖洗腸糞便物，組織置于多聚甲醛(4 g/L)固定，48 h后梯度濃度蔗糖沉底過夜，冰凍切片(厚10 mm),常規(guī)染色。

A～C:(×200)；D～F:(×400)

圖1小腸上皮細(xì)胞的形態(tài)變化(HE染色)

A～C:Bcl-2;D～F:Bax;G～I(xiàn):Caspase-3

圖2免疫組織化學(xué)染色顯示Bcl-2、Bax和Caspase-3在小腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)(×400)

1.3HE染色 常規(guī)冰凍切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察小腸絨毛和上皮細(xì)胞的變化。

1.4免疫組織化學(xué)染色 采用SP法進(jìn)行Caspase-3(Cell Signaling，1∶200)、Bcl-2(Santa Cruz,1∶200)、Bax(Santa Cruz,1∶200)免疫組織化學(xué)染色，以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1小腸光鏡病理觀察 HE染色顯示，Sham組腸絨毛完整，排列整齊,隱窩結(jié)構(gòu)明顯。IR組腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，絨毛頂部大量脫落破裂,潰瘍嚴(yán)重，上皮細(xì)胞變性壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腸壁各層出現(xiàn)出血，隱窩結(jié)構(gòu)破壞。IR+L-NAT組形態(tài)變化明顯減輕，小腸絨毛基本完整，小腸絨毛上皮細(xì)胞輕度水腫，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。

2.2免疫組織化學(xué)Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色顯示，免疫組織化學(xué)陽性信號(hào)可不同程度表達(dá)于小腸黏膜上皮細(xì)胞中，呈棕黃色或黃褐色顆粒，其中，Bax在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，Bcl-2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表達(dá)，Caspase-3在細(xì)胞核表達(dá)。Bax、Bcl-2和Caspase-3在Sham組均無表達(dá)。IR組Caspase-3、Bax、Bcl-2等陽性細(xì)胞數(shù)量均明顯增多。與IR組比較，L-NAT干預(yù)后Caspase-3與Bax的表達(dá)減弱，Bcl-2表達(dá)增加(圖2)。

3 討 論

肝臟是人體最大的實(shí)質(zhì)性器官，血供比較豐富。在肝臟移植、處理嚴(yán)重肝創(chuàng)傷等手術(shù)時(shí)，為減少術(shù)中出血，經(jīng)常需要阻斷肝門，而重新恢復(fù)血液供應(yīng)則可造成肝臟的缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)[9]。近年來有研究表明，肝臟缺血缺氧使大量Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)造成鈣超載，促使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，為氧自由基的產(chǎn)生提供催化劑。肝臟缺血缺氧時(shí)，肝細(xì)胞的無氧酵解，會(huì)使酸性代謝產(chǎn)物堆積過多，pH值降低，而灌注后pH值的改變，則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞死亡，加重缺血再灌注損傷(IRI)；同時(shí)，肝臟中的kupffer細(xì)胞被激活并釋放大量毒性介質(zhì)，干擾DNA的逆轉(zhuǎn)錄過程，使細(xì)胞內(nèi)具有酶活性的蛋白質(zhì)失活，細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的功能代謝紊亂，導(dǎo)致肝臟發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷[10-11]。另有研究表明，肝臟IR不僅影響肝臟結(jié)構(gòu)和生理功能，還參與多種遠(yuǎn)隔器官的缺血/缺氧損傷[12]。張東江等[13]發(fā)現(xiàn)，隨HIRI發(fā)生時(shí)間延長(zhǎng)，腎小球、腎小管細(xì)胞發(fā)生水腫壞死，出現(xiàn)嚴(yán)重腎功能不全表現(xiàn)。趙磊等[14]發(fā)現(xiàn)發(fā)生HIRI后肺泡腔完整性被破壞，間隔明顯增厚，肺泡上皮細(xì)胞變性壞死，并伴有肺水腫。楊進(jìn)城等[15]發(fā)現(xiàn)肝臟IR后，腎臟、胰腺、心臟中測(cè)得SOD活性下降及MDA水平升高，提示HIRI可誘發(fā)多器官功能障礙綜合征(MODS)[16]。

當(dāng)肝門被阻斷后，門靜脈的反流與入肝血量明顯減少，在加重肝臟缺血的同時(shí)，不可避免的造成了腸道的淤血損傷，出現(xiàn)小腸黏膜屏障破壞，腸黏膜通透性增高，造成細(xì)菌移位，形成內(nèi)毒素和菌血癥[17]。當(dāng)重新恢復(fù)血流后，內(nèi)毒素隨血液回流入肝臟，進(jìn)而加重HIRI。肝門阻斷后門脈回流受阻導(dǎo)致腸道淤血損傷，當(dāng)肝臟再灌注時(shí)毒性物質(zhì)又可經(jīng)血液流經(jīng)腸道，導(dǎo)致腸道的雙重?fù)p害[18]。因此，腸道被譽(yù)為是外科手術(shù)的“中心器官”。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，肝門阻斷后小腸會(huì)出現(xiàn)淤血性損傷[19]。周京安等[20]發(fā)現(xiàn)由于小腸絨毛發(fā)卡式結(jié)構(gòu)的存在，其頂部黏膜層細(xì)胞易出現(xiàn)脫落壞死、線粒體腫脹和細(xì)胞連接松弛。趙佐慶等[21]發(fā)現(xiàn)犬小腸在IR后腸黏膜淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞數(shù)量增多，同時(shí)Bax、c-Fos基因表達(dá)增多，提示小腸IRI與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。綜上所述，在肝臟缺血手術(shù)中保持腸黏膜完整性，減少腸道的損傷具有重要的意義。

細(xì)胞凋亡是IR中細(xì)胞死亡的重要方式，而線粒體途徑是凋亡的主要途徑。Bcl-2家族和Caspase家族在線粒體途徑中有極為重要的調(diào)控作用。Caspase-3在促進(jìn)細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，是內(nèi)源性細(xì)胞凋亡和外源性細(xì)胞凋亡共同的效應(yīng)分子，可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，從而形成Caspases依賴性的細(xì)胞凋亡[22]。Bcl-2家族中Bax、Bcl-2是目前已知的與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的功能相對(duì)立的基因。研究表明，抗凋亡基因Bax和促凋亡基因Bcl-2的比例可影響細(xì)胞凋亡的狀態(tài),即當(dāng)Bcl-2與Bax比值增高時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞存活，否則促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]。Bcl-2、Bax作為上游調(diào)控基因可改變線粒體膜的通透性，控制下游Caspase-3蛋白酶的活性和Cyt-c的釋放。線粒體釋放的Cyt-c與Apaf-1、dATP結(jié)合形成凋亡體，并招募pro-Caspase-9使其激活為活性Caspase-9，后者又可激活Caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24-27]。由此可見，在細(xì)胞程序性死亡中，Cyt-c發(fā)揮最后通路的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與IR組比較，IR+L-NAT組Caspase-3與Bax表達(dá)減弱，Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，Caspase-3的表達(dá)降低。說明L-NAT可以通過抑制Cyt-c從線粒體向胞質(zhì)中釋放，減少活化型Caspase-3的表達(dá)，從而減少細(xì)胞的凋亡。

研究表明，P物質(zhì)是一個(gè)由11個(gè)氨基酸組成的多肽，它作為一種興奮性胃腸激肽大量分布在腸道的肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢。P物質(zhì)通過與NK-1受體結(jié)合，刺激腸黏膜分泌水和電解質(zhì)，加快離子轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致腸管擴(kuò)張，通透性增加，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)TNF-α和分泌TNF-α調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子[3]。朱金照等[26]發(fā)現(xiàn)，肝衰竭時(shí)小腸的功能減弱與P物質(zhì)的分布有一定的關(guān)系。L-NAT是P物質(zhì)特異性受體NK-1的拮抗劑，是由美國(guó)FDA批準(zhǔn)的用于治療惡心、嘔吐和精神病變的藥物。有學(xué)者已證實(shí)L-NAT對(duì)新生鼠腦缺血缺氧具有保護(hù)作用[27-28]，但對(duì)肝臟缺血后腸損傷的保護(hù)作用未見報(bào)道。本研究通過肝門阻斷法完全阻斷肝臟血流，制備肝臟IR模型。研究發(fā)現(xiàn)Sham組腸絨毛完整，排列整齊。IR組腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，頂部絨毛大量脫落破裂,上皮細(xì)胞變性壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而IR+L-NAT組形態(tài)變化明顯減輕，小腸絨毛基本完整，較IR組有較大改善。因此可以說明L-NAT對(duì)肝臟缺血后腸損傷具有保護(hù)作用。

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ProtectiveeffectofN-acetyl-L-tryptophanonintestinaldamageafterrathepaticischemiareperfusion*

WangShuhui1,JiangHongxin2,LiXiaoshuang2,HuMengqi3,YuHai2,ZhangMing2,YuShuna2,WangJianxin2,JiangJiying2△

(1.Class17ofGrade2013,ClinicalMedicalCollege,WeifangMedicalCollege，Weifang,Shandong261053,China;2.TeachingandResearchingSectionofAnatomy，WeifangMedicalCollege，Weifang,Shandong261053,China;3.Class7ofGrade2013,ClinicalMedicalCollege,WeifangMedicalCollege,Weifang,Shandong261053,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of N-acetyl-L-tryptophan (L-NAT) on intestinal damage after rat hepatic ischemia reperfusion.MethodsTwenty-four healthy adult rats were divided into the sham operation group (Sham),ischemia reperfusion group (IR),ischemia reperfusion and N-acetyl-L-tryptophan group(IR+L-NAT).The hepatic ischemia reperfusion model was established by occluding the afferent vessels of the left and middle lobes.The morphological structures of the small intestine were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining.The expressions of active caspase-3,Bax and Bcl-2 were detected by immunohistochemistry staining.Results(1) In the IR group,the structure of intestinal villis was destroyed,the intestinal mucosa showed congestion and exfoliation,the epithelial cells had degeneration and necrosis,and infiltration of inflammatory cells appeared;which could be alleviated by L-NAT.(2)The immunohistochemistry showed that compared with the Sham group,the expression of active caspase-3,Bcl-2 and Bax in the IR group was increased,after L-NAT intervention,the Bax and caspase-3 expression was decreased,while the Bcl-2 expression was further increased.ConclusionL-NAT could inhibit the apoptosis of small intestinal epithelial cells caused by liver ischemic reperfusion and attenuates intestinal epithelial damage.

ischemia-reperfusion injury;small intestine;N-acetyl-L-tryptophan;apoptosis；rat

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.002

R657.3

A

1671-8348(2017)27-3748-04

2016-11-05

2017-05-21)

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2010HM006;ZR2014HL020；ZR2014HL021)；山東省教育廳資助課題(J11LF14)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃資助課題(2014WS0464)；濰坊醫(yī)學(xué)院科技創(chuàng)新研究基金資助項(xiàng)目(K1301001)；濰坊醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(KX20150091)；2015年地方高校國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201510438010;201510438007)。

王淑惠(1994-)，本科,主要從事肝損傷研究?！?/p>

，E-mail:jiangjiying2002@163.com。