畢 可， 施曉文， 杜予民

(武漢大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖北武漢 430079)

甲胎蛋白(AFP)是一種由591個(gè)氨基酸殘基組成的糖蛋白，也是一種臨床中廣泛使用的癌癥標(biāo)志物，其在血清中的含量對(duì)原發(fā)性肝癌及畸胎瘤的診斷治療和愈后判斷具有指導(dǎo)意義[1 - 2]。目前，臨床用于AFP檢測(cè)的傳統(tǒng)方法，如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[3]、熒光免疫法(FIA)[4]、放射免疫法(RIA)[5]，存在靈敏度不高、步驟繁瑣、輻射及廢物污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)。近年來應(yīng)用的化學(xué)發(fā)光法(CLIA)[6]、電化學(xué)發(fā)光法(ECLIA)[7]等在以上問題有了一定的突破，但是仍存在需使用特殊設(shè)備，藥品昂貴的問題。而電化學(xué)檢測(cè)則具有設(shè)備簡(jiǎn)單，分析快速及易于小型化的特點(diǎn)，因此發(fā)展經(jīng)濟(jì)便捷且穩(wěn)定可靠的電化學(xué)傳感器對(duì)于癌癥標(biāo)志物的檢測(cè)具有重要價(jià)值。

針對(duì)AFP的電化學(xué)傳感器已有報(bào)道，但大多是基于玻碳電極[8 - 9]、金電極[10]等圓盤電極的電化學(xué)傳感器，雖然能夠重復(fù)使用，但是處理步驟復(fù)雜，不便于大規(guī)模使用。而近年來絲網(wǎng)印刷電極(SPE)的發(fā)展則有效規(guī)避了以上問題，SPE具有體積小、成本低廉的特點(diǎn)，使用一次后即可拋棄，避免多次使用產(chǎn)生的樣品污染，并且樣品體積需求小，結(jié)合便攜式的電化學(xué)檢測(cè)設(shè)備可發(fā)展個(gè)人醫(yī)療所需的電化學(xué)傳感器。本文在SPE上電沉積金納米粒子(AuNPs)改善了SPE的重現(xiàn)性，在保持其低成本優(yōu)勢(shì)的同時(shí)增強(qiáng)SPE的可靠性，通過靜電組裝捕獲包被抗體[11]，使用AuNPs/酶標(biāo)檢測(cè)抗體免疫探針作為檢測(cè)探針，構(gòu)建了一種基于雙抗夾心結(jié)構(gòu)的電化學(xué)免疫傳感器，利用AuNPs的雙重信號(hào)放大原理[12]，實(shí)現(xiàn)了原發(fā)性肝癌以及畸胎瘤中標(biāo)志物AFP的高靈敏檢測(cè)。該傳感器在低抗原濃度時(shí)即可獲得較強(qiáng)響應(yīng)信號(hào)，傳感靈敏度優(yōu)于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9,13-15]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Sigma場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(SEM)(德國(guó)，Zeiss公司)；CHI660e電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；3-30K高速離心機(jī)(德國(guó)，Sigma公司)。

AFP標(biāo)準(zhǔn)品、AFP鼠單抗、HRP酶標(biāo)記AFP鼠多抗(北京萬域美瀾科技有限公司)，HAuCl4(國(guó)藥集團(tuán))，對(duì)苯二酚(HQ，國(guó)藥集團(tuán))，牛血清白蛋白(BSA，博士德生物工程有限公司)，3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB，BIOSHARP)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭＝z網(wǎng)印刷電極(SPE)購于上海鉬鎂電子科技有限公司，實(shí)驗(yàn)用水均為電阻率達(dá)到18.25 MΩ·cm的超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1電沉積AuNPs修飾絲網(wǎng)印刷電極基底首先使用無水乙醇清洗SPE，隨后將其浸入0.5 mol/L H2SO4中，在-0.6～1.0 V間用循環(huán)伏安法(CV)活化電極20圈。再將其浸入含有0.01 mol/L K2SO4和0.001 mol/L HAuCl4溶液中，通過CV法沉積納米金，電位窗口為-0.5～1.1 V，掃描圈數(shù)為38，掃速為0.1 V/s。超純水清洗電極后氮?dú)獯蹈蓚溆谩㈦姌O浸入5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液中，通過微分脈沖伏安法(DPV)測(cè)試其重現(xiàn)性。

1.2.2AuNPs/酶標(biāo)抗體免疫探針的制備參考文獻(xiàn)方法并根據(jù)檸檬酸鈉還原法制備AuNPs[11,16]。用0.2 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH到9.0以超過抗體等電點(diǎn)，加入適量HRP酶標(biāo)記AFP鼠多抗，4 ℃ 孵育12 h后用含10%BSA的TBS緩沖液調(diào)節(jié)BSA濃度至1%以穩(wěn)定并封閉納米粒子；再4 ℃孵育12 h后2 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，上清液12 000 r/min離心20 min，再棄去上清液，沉淀用含1%BSA的TBS緩沖液重懸，隨后離心重懸兩次得到純化的免疫探針[17]。使用TMB顯色液評(píng)價(jià)免疫探針的組裝結(jié)果[18]，確保沉淀的重懸液可以催化顯色液顯色，檢驗(yàn)合格后將其保存在4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.3雙抗夾心電化學(xué)傳感體系的構(gòu)建取AuNPs修飾的SPE，在工作電極表面滴涂8.75 μL AFP鼠單抗溶液，4 ℃吸附組裝12 h，用pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗未吸附抗體并氮?dú)獯蹈?。隨后將50 μL封閉液滴涂在整個(gè)三電極區(qū)域上，4 ℃封閉12 h。

將待測(cè)的AFP抗原用含0.1%BSA的PBS配制成一系列不同濃度的樣品，分別取8.75 μL滴涂于工作電極表面，37 ℃孵育1 h，用PBST洗滌緩沖液(0.05%Tween-20，pH=7.4，0.015 mol/L PBS)洗滌數(shù)次，氮?dú)獯蹈伞Ｔ賹⒚庖咛结樝♂尯蟮瓮坑诠ぷ麟姌O表面，37 ℃反應(yīng)40 min，隨后用PBST洗滌緩沖液洗滌數(shù)次，氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.2.4AFP抗原的電化學(xué)檢測(cè)通過DPV法在含有1 mmol/L對(duì)苯二酚(HQ)，5 mmol/L H2O2[19](測(cè)試時(shí)加入)，pH=5.4的檸檬酸-NaH2PO4緩沖液中測(cè)試組裝的傳感器。參數(shù)設(shè)置為電勢(shì)增量4 mV，振幅50 mV，脈沖寬度50 ms，采樣寬度40 ms，脈沖周期100 ms，靜置時(shí)間20 s，可以根據(jù)具體情況微調(diào)電位窗口。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于雙抗夾心法的傳感體系檢測(cè)原理

圖1 免疫傳感器的組裝示意圖Fig.1 Schematic illustration of the fabrication process of AFP immunosensor

基于雙抗夾心法的電化學(xué)傳感體系的組裝過程及檢測(cè)原理如圖1所示。SPE表面的AuNPs通過靜電作用吸附AFP鼠單抗(Anti-AFP)，并用BSA封閉剩余非特異性結(jié)合位點(diǎn)。AFP鼠單抗結(jié)合AFP抗原后進(jìn)一步與免疫探針結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，同時(shí)引入了相當(dāng)數(shù)量的HRP酶，起到放大電信號(hào)的作用[20]。因此，該傳感體系可以在HQ的存在下催化H2O2的還原，并利用還原電流與AFP濃度之間的關(guān)系實(shí)現(xiàn)其定量檢測(cè)。

2.2 修飾AuNPs提高電極基底重現(xiàn)性

在5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液中進(jìn)行DPV測(cè)試，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)AuNPs修飾的SPE的重現(xiàn)性較差，電極間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)達(dá)到4.63%，峰峰電位差高達(dá)277 mV，不能滿足實(shí)驗(yàn)要求。改變電沉積條件可以調(diào)節(jié)AuNPs形貌，粒徑較小時(shí)吸附的抗體量過低，導(dǎo)致響應(yīng)電流偏低，而粒徑較大時(shí)納米粒子形狀不再規(guī)則，且電極表面易形成缺陷，影響電極的重現(xiàn)性。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化電沉積條件，采用CV法在0.001 mol/L HAuCl4的溶液中沉積納米金，在-0.5～1.1 V區(qū)間內(nèi)以掃速0.1 V/s掃描38圈。對(duì)經(jīng)過電沉積處理后的電極進(jìn)行15圈CV測(cè)試的結(jié)果如圖2a所示，電極的峰電位差降低到80 mV內(nèi)，峰電流提高近一倍，且曲線基本重合，說明經(jīng)過AuNPs修飾，工作電極表面的導(dǎo)電性和平整度得到提升。在不同片電極間進(jìn)行DPV測(cè)試，結(jié)果如圖2b所示，電極間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差降低至1.27%，對(duì)同一片電極重復(fù)測(cè)試的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅有0.40%，重現(xiàn)性得到明顯提升。

圖2 不同電極間的測(cè)試差異:電極修飾AuNPs前后對(duì)比(a)；修飾AuNPs后DPV的重現(xiàn)性(b) Fig.2 The differences between different electrodes:differences between bare SPE and AuNPs modified SPE(a);the recovery of AuNPs modified SPE(b)

2.3 傳感器的形貌表征

采用掃描電鏡(SEM)技術(shù)對(duì)組裝過程進(jìn)行了形貌表征。圖3為不同組裝步驟下電極的SEM照片。從圖3a可以看到未經(jīng)修飾的電極表面為聚合物黏結(jié)碳粉形成的片層狀結(jié)構(gòu)，這造成了電極界面性質(zhì)的不穩(wěn)定，但此結(jié)構(gòu)也具有較高的比表面積，可以修飾更多的AuNPs，增強(qiáng)其反應(yīng)性。經(jīng)過電沉積后，電極表面成功引入AuNPs，增強(qiáng)了電極表面的平整度(圖3b)，此粒徑下的電極對(duì)比圖3b和圖3c可以發(fā)現(xiàn)，包被過AFP抗體并用BSA封閉后，AuNPs的體積明顯增大，形狀更不規(guī)則，其邊緣相對(duì)模糊，這說明引入了導(dǎo)電性較差的蛋白。從圖3d可見，孵育AFP并與免疫探針形成免疫復(fù)合物后，電極表面結(jié)合了相當(dāng)數(shù)量的免疫探針。免疫探針相對(duì)于電沉積的金納米粒子粒徑更大，即使結(jié)合蛋白質(zhì)后也大體保持了其本身的形狀[21]。

圖3 不同組裝過程的掃描電鏡(SEM)圖Fig.3 SEM images of (a)bare SPE,(b)AuNPs,(c) AuNPs/Anti-AFP and (d)AuNPs/Anti-AFP/AFP/Immunoprobe

2.4 封閉條件

由于在電極表面引入了AuNPs，電極對(duì)蛋白質(zhì)的吸附能力極大增強(qiáng)，這也導(dǎo)致表面的非特異性吸附增加，因此需要特別優(yōu)化封閉條件。實(shí)驗(yàn)嘗試使用不同濃度的BSA及聚乙二醇(PEG20000)對(duì)電極進(jìn)行封閉。在K3[Fe(CN)6]溶液中進(jìn)行DPV測(cè)試，結(jié)果表明，BSA的封閉效果優(yōu)于PEG20000，而2%BSA的封閉效果與5%BSA效果差距不大，見圖4?？紤]到成本因素，實(shí)驗(yàn)確定含有2%BSA 的PBST緩沖液作為封閉液。

2.5 底物溶液的組成

實(shí)驗(yàn)采用HQ作為酶催化底物，HQ在堿性條件及某些金屬離子存在下容易發(fā)生氧化而在檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)較大的背景電流。如圖5所示，采用結(jié)合了免疫探針的傳感器在不同pH緩沖液中進(jìn)行測(cè)試，最終確定pH=5.4的0.1 mol/L檸檬酸-NaH2PO4緩沖液作為底物緩沖液[22 - 23]。 將含有1 mmol/L HQ的緩沖溶液放置一段時(shí)間后用于傳感器測(cè)試，背景電流沒有明顯增高,表明底物溶液相對(duì)穩(wěn)定(圖6)。

如圖7所示，配制不同HQ濃度的底物溶液，并使用結(jié)合了免疫探針的傳感器檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其響應(yīng)電流隨著HQ的濃度有先增加后緩慢降低的趨勢(shì)，HQ的優(yōu)化濃度為1 mmol/L。

圖4 不同封閉條件封閉后電極響應(yīng)電流對(duì)比Fig.4 Current response under different blocking conditions

圖5 緩沖液pH對(duì)響應(yīng)電流的影響Fig.5 Effect of pH on the current response

圖6 底物溶液的穩(wěn)定性Fig.6 The stability of substrate with time

圖7 HQ濃度對(duì)響應(yīng)電流的影響Fig.7 Effect of HQ concentration on the current response

圖8 孵育不同濃度AFP的傳感器響應(yīng)電流(a)和峰電流擬合曲線(b)Fig.8 DPV current under different AFP concentration(a) and fitting curve(b)

2.6 傳感器的響應(yīng)特性

取兩組同樣孵育過20 ng/mL AFP的SPE，分別測(cè)試直接結(jié)合酶標(biāo)抗體和使用免疫探針進(jìn)行放大的傳感器信號(hào)，發(fā)現(xiàn)前者對(duì)應(yīng)的峰電流僅為后者的6.9%，免疫探針的放大效果較為明顯。

在最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，將8片孵育過不同濃度AFP抗原并結(jié)合免疫探針的傳感器浸入底物溶液中進(jìn)行DPV檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明響應(yīng)電流隨著AFP濃度的提高先增加，后趨于不變，這是由于與免疫探針反應(yīng)形成的復(fù)合物體積較大，基本覆蓋了電極的表面，無法引入更多的酶提升催化電流。如圖8所示，當(dāng)AFP濃度范圍在2.5～30 ng/mL時(shí)，響應(yīng)電流(I)與傳感器工作電極孵育的AFP濃度(c)成線性關(guān)系，線性方程為：I=2.780×10-7c+8.073×10-7，檢出限為0.16 ng/mL。通常臨床檢驗(yàn)時(shí)需要稀釋血清樣品，因此本傳感器所具有的窄范圍高靈敏度響應(yīng)的優(yōu)勢(shì)突出，如表1所示本傳感器靈敏度優(yōu)于同類報(bào)道[9,14 - 15]。傳感器與ELISA法對(duì)照結(jié)果如表2所示，制備的傳感器與ELISA結(jié)果吻合度較為理想。

表1 不同AFP傳感器性能的對(duì)比

表2 傳感器與ELISA結(jié)果對(duì)比

2.7 傳感器的特異性

圖9 傳感器的特異性分析Fig.9 Specificity of the immunosensor

對(duì)傳感器的特異性問題進(jìn)一步測(cè)試，避免復(fù)雜的檢測(cè)體系中存在假陽性反應(yīng)造成干擾。實(shí)驗(yàn)選取其他四種癌癥標(biāo)志物，即糖類抗原19-9(CA19-9)、癌胚抗原(CEA)、人絨毛促性腺激素(HCG)、前列腺特異抗原(PSA)(濃度均為20 ng/mL)，測(cè)試傳感器的抗干擾能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，AFP的響應(yīng)電流可達(dá)6.81 μA，而分別及混合測(cè)試其他幾種標(biāo)志物的響應(yīng)電流均在0.2 μA以下，說明該傳感體系具有良好的選擇性，抗干擾能力較強(qiáng)。

2.8 傳感器的重現(xiàn)性及使用壽命

制備6片傳感器，將其浸入30 ng/mL的AFP溶液中按照上述步驟孵育并結(jié)合免疫探針，浸入底物溶液進(jìn)行DPV測(cè)試，6片傳感器響應(yīng)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.53%，重現(xiàn)性相對(duì)良好。制備6片傳感器并放置在盛有PBS(pH=7.4)的濕盒中并于4 ℃保存，經(jīng)過28 d后孵育30 ng/mL的AFP抗原并結(jié)合免疫探針，響應(yīng)電流僅降低3.5%，表明傳感器的使用壽命良好。

3 結(jié)論

在絲網(wǎng)印刷電極基底上電沉積金納米粒子，改善了電極的表面平整度，增強(qiáng)了其電極反應(yīng)的重現(xiàn)性，以金納米粒子捕獲樣品中的AFP抗原并與金納米粒子和酶標(biāo)抗體組裝而成的免疫探針進(jìn)行免疫反應(yīng)，在對(duì)苯二酚的存在下，免疫探針可以催化底物H2O2放大響應(yīng)電流，增強(qiáng)靈敏度，建立定量測(cè)定AFP抗原的傳感器，該傳感體系有望應(yīng)用于構(gòu)建其他免疫原的傳感器。