文艷清， 龍 倩， 張友玉， 李海濤,

(1.湖南安全技術(shù)職業(yè)學(xué)院，湖南長沙 410151； 2.湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長沙 410181)

適配體本質(zhì)上是采用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)從寡核苷酸文庫中篩選出來的隨機DNA(或RNA)序列，具有高親和力，能選擇性結(jié)合大量目標分子，如蛋白質(zhì)(凝血酶，黃曲霉毒素，血小板生長因子)[1 - 3]、小分子(ATP，可卡因)[4 - 6]和金屬離子(K+，Hg2+，Pb2+)[7 - 8]，還能用于微生物的檢測[9]。在生化分析中，適配體易于分離和修飾，穩(wěn)定性良好，容易儲存，應(yīng)用廣泛，親和力高而且體外選擇簡便，可以作為一種有前景的檢測工具。

凝血酶(因子Iia)是凝血過程中的一種重要的蛋白酶，可以加速和鞏固凝血過程，同時能抑制血栓并使血小板活化，對很多心血管疾病有重要的作用，并能調(diào)控很多炎癥和傷口愈合過程。因此，建立快速、高靈敏度檢測凝血酶的方法和傳感器在醫(yī)學(xué)上具有重要的意義。凝血酶適配體是最先從體外篩選出來的，并被廣泛的研究，且證明它能形成一種G -四重體空間結(jié)構(gòu)，并能在特定位點結(jié)合凝血酶[10]。目前，采用不同的方法利用其適配體定量檢測凝血酶，已有大量報道[11 - 12]，基于光譜的檢測方法也有不少研究[3,13 - 14]。這些方法雖然現(xiàn)象明顯，也有很好的特異性，靈敏度卻不是很高。然而，電化學(xué)方法簡單，靈敏，響應(yīng)快，處理方便，在蛋白質(zhì)檢測方面有明顯的優(yōu)勢[15 - 16]。

近年來，納米粒子由于其獨特的性質(zhì)越來越受到人們的重視。磁性納米粒子以其優(yōu)越的物理特性[17 - 18]，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。而半導(dǎo)體納米粒子，又可稱為量子點(QDs)，如CdS、CdTe和CdSe等，由于其獨特的發(fā)光及電化學(xué)特性，在生化分析中常被用做熒光或電化學(xué)探針[16,19]。本文以磁性納米粒子作為分離材料，適配體修飾的CdTe納米粒子作為探針，構(gòu)建了一個基于適配體的電化學(xué)檢測凝血酶的新方法。該方法中，金包覆的磁性納米粒子不僅用于分離，同時還是DNA的固定材料。巰基修飾的適配體互補鏈通過Au-S鍵被固定在金包覆的磁性微球表面，而經(jīng)半胱氨酸修飾的CdTe納米粒子，其表面的自由氨基與適配體鏈5′端磷酸基團連成亞磷酰胺鍵[10]，形成CdTe -Aptamer復(fù)合物，通過雜交反應(yīng)，得到Fe3O4/Au/DNA/Aptamer復(fù)合物。若分析物中存在凝血酶，其適配體與之形成G -四重體結(jié)構(gòu)，使雙鏈DAN解鏈。固液分離后，應(yīng)用差分脈沖伏安法(DPV)檢測上清液中的Cd，最終實現(xiàn)凝血酶的檢測，如圖1所示。這種適配體傳感器對檢測凝血酶特異性好，靈敏度高，操作簡單，在其他已被篩選出適配體的分析物的檢測中也有很好的應(yīng)用前景。

圖1 適配體傳感器形成及凝血酶檢測過程示意圖Fig.1 An illustration for aptasensor formation and thrombin detection process

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Nexus 670型傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet Instrument Co.,Madison,WI)；Picoscan 2100型原子力顯微鏡(Molecular Imaging Co.,USA)；I660A型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；采用三電極體系，工作電極為玻碳電極(直徑3 mm)，參比電極為飽和甘汞電極，對電極為石墨電極。

碲粉(99.0%)，CdCl2(99.0%)，L-半胱氨酸(98.5%)，NaBH4(98.0%)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，NaCl，MgCl2等均購自上?；瘜W(xué)試劑廠。凝血酶，牛血清白蛋白，人血清白蛋白，纖維原蛋白，萘酚均購自Sigma公司。所有試劑都直接使用，并用Milli-Q超純水配置。

合成的DNA片段購于上海生工生物工程技術(shù)與服務(wù)有限公司，其序列如下：適配體鏈：3′-GGT TGG TGT GGT TGG TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT-SH-5′；互補鏈：5′-TTT TTT TTT CCA ACC ACA CCA ACC-3′。DNA原液(100 μmol/L)用Tris-HCl緩沖液配制并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 CdTe 納米粒子的制備

功能化CdTe納米粒子的合成在文獻中[20]已有了詳細的描述。NaBH4和蹄粉以2∶1的摩爾比在冰浴和強磁力攪拌及氮氣保護下避光反應(yīng)，離心后得到NaHTe上清液，將該上清液與Cd2+以L-半胱氨酸作為穩(wěn)定劑，在堿性條件下反應(yīng)30 min左右，得到CdTe前驅(qū)體溶液，再于100 ℃下回流1 h后得到CdTe納米粒子。

1.3 Fe3O4/Au納米粒子的制備

Fe3O4/Au納米粒子采用共沉淀法[21]合成，用1.5 mol/L NaOH 作為沉淀劑合成Fe3O4納米粒子。FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O溶解在HCl中，在氮氣的保護下劇烈攪拌，逐滴加入沉淀劑，產(chǎn)生大量黑色沉淀，通過磁性分離多次清洗至中性，分散至一定量超純水中，緩慢加入HAuCl4水溶液(加入的時間至少為10 min)，混合均勻，使Au3+充分吸附于種子顆粒表面；最后，加入還原劑鹽酸羥胺，混合均勻，反應(yīng)進行1 h左右，形成核/殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4/Au磁性復(fù)合微粒。磁性分離，除去上清液，用超純水洗滌至中性，最后分散至超純水中備用。

1.4 凝血酶適配體傳感器的制備

取適量Fe3O4/Au磁性復(fù)合納米粒子儲備液至20 mmol/L Tris-HCl(100 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl,1 mmol/L MgCl2,2 mmol/L EDTA,pH=7.4)緩沖液中，超聲分散30 min，加入5 μL適配體的互補鏈在室溫下攪拌2 h，再清洗三遍，分離出未連接到磁性納米粒子上的DNA。磁性分離后，沉淀分散到500 μL 1%巰基乙醇中浸泡15 min以封閉多余的金表面，清洗后分散到500 μL雜交緩沖液中(2×SSC,0.05%Tween-20)，與5 μL巰基修飾的適配體鏈在60 ℃下攪拌2 h，磁性分離后得到Aptamer-DNA-Au/Fe3O4復(fù)合物，分散到400 μL Tris-HCl緩沖液中，并加入100 μL CdTe納米粒子，反應(yīng)24 h后，磁性分離，清洗沉淀5次，以除去多余的和非特異性結(jié)合的物質(zhì)，得到CdTe -Aptamer-DNA-Au/Fe3O4復(fù)合物，即凝血酶適配體傳感器。最后，將此沉淀分散到500 μL Tris-HCl緩沖液中，并與一定濃度的凝血酶在室溫下反應(yīng)1 h，通過磁性分離棄去沉淀，所得到的上清液將用于DPV法檢測。

1.5 電化學(xué)檢測

往10 μL上清液中加入25 μL 1 mol/L HNO3，然后將混合溶液加入到5 mL 0.1 mol/L的乙酸緩沖溶液(pH=4.5)中，再加入10 μL 1 mg/mL Bi(NO3)3溶液。將玻碳電極用0.05 μm Al2O3拋光粉拋光，乙醇中超聲10 min，清洗后氮氣吹干。在玻碳電極表面滴加5 μL Nafion溶液(1%，用無水乙醇配制)，自然風(fēng)干。設(shè)定初始電位-1.0 V，終止電位-0.5 V，富集電位-1.0 V，清洗電位0.3 V，振幅50 mV，脈沖寬度50 ms，設(shè)置適當(dāng)?shù)母患瘯r間、清洗時間、靈敏度等參數(shù)，并記錄溶出伏安曲線，記錄Cd(-0.84 V)的溶出峰高。所有實驗均在室溫下進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-半胱氨酸修飾的CdTe納米粒子的表征

分別用紅外(IR)光譜和原子力顯微鏡(AFM)對合成的CdTe納米粒子進行了表征，其結(jié)果見圖2。圖2(a)和2(b)分別為L-半胱氨酸和L-半胱氨酸修飾的CdTe納米粒子IR譜圖。圖2(b)中2 549 cm-1(υS-H)歸屬為-SH基團的特征吸收峰，2 968 cm-1歸屬為-CH2基團的特征吸收，1 589 cm-1處歸屬為-NH2基團的特征吸收峰。比較兩張譜圖，CdTe納米粒子經(jīng)L-半胱氨酸修飾后，紅外光圖譜中出現(xiàn)了-NH2基團和-CH2基團的吸收峰，同時官能團-SH吸收峰消失，說明L-半胱氨酸已成功修飾到CdTe納米粒子表面。AFM結(jié)果顯示了CdTe納米粒子呈球形，分布比較均勻，平均粒徑約25 nm(圖2(c))。

圖2 L-半胱氨酸修飾的CdTe納米粒子(a)和L-半胱氨酸(b)的紅外光(IR)譜圖； CdTe納米粒子的原子力顯微鏡(CAFM)圖(c)Fig.2 IR spectra of L-cysteinemodified CdTe nanoparticles(a) and L-cysteine(b);AFM imag of CdTe nanoparticles(c)

2.2 Fe3O4/Au納米粒子的表征

分別用X-射線衍射(XRD)和AFM對合成的Fe3O4/Au納米粒子進行了表征。圖3(a)為XRD譜圖，從圖中可以看出，譜圖中2θ為38.24o、44.29o、64.78o、77.64o處出現(xiàn)了Au的特征衍射峰，表明合成的磁性復(fù)合物是由Au和Fe3O4構(gòu)成的。AFM結(jié)果顯示了Fe3O4/Au納米粒子尺寸大小比較均勻，平均粒徑約50 nm(圖3(b))。

圖3 Fe3O4/Au納米粒子的X-射線衍射(XRD)譜圖(a)及原子力顯微鏡(AFM)圖(b)Fig.3 XRD pattern(a) and AFM imag(b) of Fe3O4/Au core/shell nanoparticles

2.3 凝血酶的檢測原理

圖4 不同凝血酶濃度下體系的DPV曲線Fig.4 DPV curres of the system with different concentration of thrombin a-e:0,1.5×10-12,2.5×10-12,7.0×10-12,13.0×10-12(mol/L).

圖1描述了適配體傳感器檢測凝血酶的過程。通過Au-S鍵的共價結(jié)合和DNA的雜交反應(yīng)，適配體互補鏈、適配體依次固定到了磁性納米粒子表面，再將CdTe納米粒子連接到適配體上，磁性分離后，得到的CdTe -Aptamer-DNA-Au/Fe3O4復(fù)合物(凝血酶適配體傳感器)。重新分散到Tris-HCl 緩沖液中，并往該懸浮液中加入不同濃度的凝血酶，反應(yīng)后再磁性分離，應(yīng)用差分脈沖溶出法對上清液進行檢測。結(jié)果如圖4所示，不加凝血酶時，上清液中幾乎檢測不到Cd的電化學(xué)信號(a)，當(dāng)加入一定濃度的凝血酶時，由于凝血酶與適配體發(fā)生特異性結(jié)合，形成G -四重體穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNA雙鏈解旋，CdTe -Aptamer-thrombin復(fù)合物從磁性納米粒子上分離，分散到緩沖液中，上清液中即可檢測到Cd的電化學(xué)信號，且隨著凝血酶濃度的增加，信號不斷增強(b～e)，從而達到檢測凝血酶的目的。

2.4 實驗條件的優(yōu)化

為了得到更高的檢測靈敏度，優(yōu)化了各種實驗條件。首先考察了緩沖液pH 值對適配體-凝血酶結(jié)合反應(yīng)的影響，考察范圍從pH為4.5至8.5。圖5(A)顯示了pH 值對檢測結(jié)果的影響，從圖中可以看出，當(dāng)pH值為7.4時，其電化學(xué)響應(yīng)最大，而高于或低于此值則響應(yīng)較小，但影響并不大。因此，選擇pH=7.4作為檢測最佳的pH。我們還考察了溫度對適配體與凝血酶結(jié)合的影響。如圖5(B)所示，當(dāng)溫度為15 ℃時上清液中Cd的峰電流最大，并且隨著溫度的升高，其峰電流不斷減小。結(jié)果表明，四重體結(jié)構(gòu)在溫度較低時穩(wěn)定性更高，孵化溫度對適配體與凝血酶的結(jié)合有很重要的影響。但由于15 ℃與25 ℃時的峰電流響應(yīng)區(qū)別不大，最終選擇25 ℃作為孵化溫度。在本實驗中，反應(yīng)時間包括適配體與凝血酶的結(jié)合時間以及磁性分離時間。如圖5(C)所示，很明顯，Cd的峰電流信號隨著反應(yīng)時間的增加也不斷增大，且在5 min到45 min范圍內(nèi)變化較大，而當(dāng)時間長于45 min后，變化卻很小，因此，選擇60 min作為本實驗的反應(yīng)時間。

圖5 溶液pH值(A)、反應(yīng)溫度(B)和反應(yīng)時間(C)對檢測結(jié)果的影響 Fig.5 Effects of pH(A),incubation temperature(B) and incubation time(C) on the stripping peak current The aptasensor has been prepared with 2.0×10-12 mol/L of thrombin.

圖6 ip-cThrombin校準曲線；插圖為不同凝血酶濃度下體系的DPV曲線Fig.6 Calibration curve between ip and cThrombin;Insert: DPV curves of the system with different concentration of thrombin a-k:0,0.5×10-12,1.0×10-12,1.5×10-12,2.0×10-12,2.5×10-12,5.0×10-12,7.0×10-12,9.0×10-12,13.0×10-12,15.0×10-12(mol/L).

2.5 凝血酶的檢測

根據(jù)凝血酶與適配體的特異性結(jié)合，在最佳條件下檢測凝血酶。圖6顯示了峰電流與不同濃度的凝血酶的關(guān)系圖，如圖所示，隨著凝血酶濃度的增大，Cd的峰電流信號也不斷增強(圖6，插圖曲線a～k)，其峰電流與凝血酶濃度有很好的線性關(guān)系，其線性范圍為5.0×10-13～1.5×10-11mol/L，相關(guān)系數(shù)R2=0.9878，線性關(guān)系良好，檢測限(S/N=3)達0.13 pmol/L，大大低于很多其他方法得到的檢測限(1 pmol/L～11 nmol/L)[10,15]。

2.6 特異性實驗

圖7 特異性實驗Fig.7 Specificity of the aptasensor(1) without thrombin,(2) 2.0×10-12 mol/L thrombin,(3) 3.5×10-6 mol/L BSA,(4) 3.5×10-6 mol/L HSA,(5) 3.5×10-6 mol/L Fibrinogen,(6) 2.0×10-12 mol/L thrombin 3.5×10-6 mol/L BSA.

為了證實所研究的電化學(xué)生物傳感器對凝血酶蛋白具有特異性識別能力，分別考察了BSA、HAS、纖維原蛋白與適配體作用后的電化學(xué)響應(yīng)。BSA、HSA及纖維原蛋白的濃度均為3.5×10-6mol/L，而凝血酶的濃度為2.0×10-12mol/L。結(jié)果如圖7所示，只有凝血酶顯示出明顯的響應(yīng)(柱2)，而其他蛋白質(zhì)的響應(yīng)(柱3、柱4和柱5)與空白(柱1)相近，幾乎可以忽略。結(jié)果表明，該適配體傳感器對目標分子凝血酶有很好的特異性。此外，還考察了BSA共存下凝血酶與適配體作用后的電化學(xué)響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)BSA(3.5×10-6mol/L)共存下凝血酶與其適配體反應(yīng)后的峰電流與沒有BSA存在下的峰電流相比，沒有明顯的變化(比較圖7柱2和柱4)，同樣說明適配體與BSA沒有特異性結(jié)合，而且BSA的存在對于適配體與凝血酶的結(jié)合沒有影響。

2.7 實際樣品分析

為了驗證本方法的實用性，對兩個全血樣品進行加標實驗，全血樣品來源于醫(yī)院，并用Tris-HCl緩沖液稀釋10 000倍。檢測結(jié)果如表1所示。數(shù)據(jù)表明凝血酶的回收率在95.5%～105.0%之間。表明本方法能很好的應(yīng)用于血樣中凝血酶的檢測。

3 結(jié)論

本文報道了一種超靈敏的基于適配體的凝血酶檢測方法，該方法利用CdTe納米粒子作為電化學(xué)探針，形成一種Fe3O4/Au-DNA-適配體-CdTe復(fù)合物，通過凝血酶與其適配體的特異性結(jié)合來檢測凝血酶，檢測限達到0.13 pmol/L，并且其他蛋白質(zhì)(BSA、HSA及纖維原蛋白)并不影響凝血酶的檢測，對全血中凝血酶的含量分析有很好的應(yīng)用。這種適配體傳感器有很多優(yōu)點，一方面，采用CdTe納米粒子作為電化學(xué)探針，能達到很低的檢測限，并只需很少量的樣品；另一方面，利用Fe3O4/Au磁性納米粒子進行DNA的固定及分離，樣品不需要進一步的富集及提純，既經(jīng)濟又省時。總的來說，這種適配體傳感器為凝血酶等的檢測提供了一個靈敏、簡便的方法，同時本方法經(jīng)濟省時，特異性高，為食品安全和疾病診斷中目標物的檢測提供了有力的工具。