鄭昕宇，王倩男，羅紅麗

(海南大學 熱帶農(nóng)林學院，海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室，海南 海口 570228)

巴西橡膠樹ADP核糖基化因子的鳥核苷酸交換因子基因(HbGNOM)的鑒定與表達

鄭昕宇，王倩男，羅紅麗

(海南大學 熱帶農(nóng)林學院，海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室，海南 ?？?570228)

在橡膠樹轉(zhuǎn)錄組測序的基礎上，通過RT-PCR技術擴增得到了橡膠樹的一個ADP 核糖基化因子的鳥核苷酸交換因子基因(HbGNOM)，該基因包含了一個4 410 bp的開放閱讀框，編碼了一個含1 470個氨基酸的蛋白.生物信息學的分析結(jié)果表明：橡膠樹HbGNOM蛋白與麻風樹、木薯、蓖麻和擬南芥的GNOM蛋白高度相似，相似性分別為97%，96 %，95 %和84%.半定量分析的結(jié)果表明：當橡膠樹受到白粉病菌侵染時，HbGNOM基因在葉片中的表達明顯升高，但其對炭疽病菌的侵染不產(chǎn)生應答；HbGNOM基因在葉片中的表達可受植物激素乙烯(ET)的誘導，但其對水楊(SA)和茉莉酸(JA)的處理沒有明顯應答，因此，HbGNOM可能與乙烯信號傳導途徑有關，并且參與了橡膠樹對白粉病的抗病反應.

巴西橡膠樹； HbGNOM； 表達分析

小 G 蛋白(Small GTPase)作為一種“分子開關”在真核生物的生命活動中起著重要的作用，它調(diào)控了多種信號轉(zhuǎn)導途徑，并與蛋白質(zhì)的分配運輸、細胞骨架的形成以及細胞分化有著密不可分的關系[1-2].小G蛋白功能的發(fā)揮依賴于被稱為鳥核苷酸交換因子(Guanine nucleotide exchange factors, GEFs)的附屬蛋白[3]，該附屬蛋白可以將小G蛋白從非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變/轉(zhuǎn)換為活化狀態(tài)，處于活化狀態(tài)的小G蛋白能夠與效應器分子作用而共同完成相應的生理功能[4].ADP 核糖基化因子(ADP-ribosylation factor, ARF)是最先報道的一種小G蛋白[5]，它的交換因子ARF-GEFs主要分布在各種生物膜系統(tǒng)中，它通過活化ARF來參與調(diào)控細胞內(nèi)蛋白的囊泡運輸和生物膜轉(zhuǎn)運，進而影響生物的生長發(fā)育和對生物脅迫的抗性[1,6].

在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中已經(jīng)鑒定了8個ARF-GEF，其首個ARF-GEF被命名為GNOM，它與人的ARF-GEF編碼基因 GBF1、酵母的ARF-GEF編碼基因Gea1p同源[6-7].擬南芥GNOM與植物的生長發(fā)育和生長素的正常運輸密不可分[8-10]，GNOM基因的功能缺失突變體gnom胚胎畸形，胚根缺失[11].GNOM蛋白可以介導生長素極性轉(zhuǎn)運載體元件 PIN1 向胞膜的運輸[12].不僅如此， GNOM還能夠調(diào)節(jié)植物根的向水性和向地性，但該過程與PIN介導的生長素運輸途徑無關[13].PEN1(PENETRATION 1)基因編碼了一個突觸融合蛋白(syntaxin)，參與了囊泡轉(zhuǎn)運和乳突的形成，它使植物對病原菌的穿透抗性得到了提高[14].GNOM通過促進植物PEN1的運輸，從而提高了植物對白粉病的抗性[15].

白粉病和炭疽病是橡膠樹的重要葉部病害，它們嚴重影響了橡膠的產(chǎn)量.在前期研究中，利用RNA-Seq技術分別對橡膠樹葉片受白粉病菌和炭疽病菌侵染前后的基因差異表達情況進行了分析，研究發(fā)現(xiàn)在白粉病菌侵染前后的橡膠樹葉片中HbGNOM的cDNA序列的表達水平發(fā)生了明顯變化，但在炭疽病菌侵染前后的橡膠樹葉片中，其表達水平?jīng)]有明顯變化，故推測該基因與橡膠樹對白粉病的抗性有關.在橡膠樹GNOM 基因的研究尚未見報道，為此，本研究克隆了橡膠樹中GNOM的同源基因HbGNOM，對其表達模式進行了初步分析，旨在為進一步研究該基因在橡膠樹抗白粉病中的功能奠定基礎.

1 材料與方法

1.1實驗材料和菌種本研究以巴西橡膠樹熱研7-33-97品系嫁接的1年幼苗的淺綠期葉片為實驗材料，所用的大腸桿菌菌株、橡膠樹膠胞炭疽病菌菌株和橡膠樹白粉病菌菌株均由本實驗室提供.

1.2橡膠樹葉片的總RNA的提取及cDNA的合成采用改良的CTAB-LiCl沉淀法來提取橡膠樹葉片的總RNA[16]，并以橡膠樹總RNA樣品為模板，利用Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒來進行反轉(zhuǎn)錄反應，以合成第一鏈cDNA.

1.3橡膠樹GNOM引物設計及PCR擴增采用IlluminaHiSeqTM2000高通量測序技術對接種白粉病菌和炭疽病菌的橡膠樹葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序(未發(fā)表數(shù)據(jù)).在此基礎上，設計了HbGNOM基因的特異性擴增引物HbGNOM-F(ATGGGTCGCTTAAAGCTGCAA)和HbGNOM-R(TTAACCCCCAGTGCCAGAAC).PCR擴增HbGNOM體系：10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5μL，dNTP mix(10 mmol·L-1)0.5 μL，HbGNOM-F(10 μmol·L-1)和HbGNOM-R(10 μmol·L-1)各1μL，cDNA模板1 μL，高保真酶(2.5 U·μL-1)0.5 μL，加ddH2O補足至25μL.PCR反應條件為：94 ℃ 4 min； 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min， 32個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min.PCR擴增結(jié)束后，用w=1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，以凝膠回收試劑盒(Axygen)回收目的片段，并參照TransGen說明書將其與pEASY-Blunt載體連接后轉(zhuǎn)化到Trans1-T1菌株，然后將菌液送到深圳華大公司進行序列測定.

1.4 HbGNOM基因的生物信息學分析根據(jù)HbGNOM編碼區(qū)的測序結(jié)果，用DNAStar軟件推測HbGNOM的氨基酸序列；利用ExPasy在線工具ProParam(http:// web.expasy.org/protparam/)分析HbGNOM的相對分子質(zhì)量和等電點；利用HbGNOM 的氨基酸序列與GenBank中其他植物的GNOM氨基酸序列進行BLAST比對；利用GenBank的 CDD數(shù)據(jù)庫預測HbGNOM的保守功能結(jié)構(gòu)域；利用DNAMAN軟件對不同物種的GNOM蛋白進行同源性比較；利用MAGA7.0，并采用NJ法來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.5橡膠樹的病害接種配置密度為5×105個·mL-1膠孢炭疽病菌孢子的懸浮液，將其均勻噴灑在長勢一致的橡膠樹淺綠色葉片上，在25 ℃保濕培養(yǎng)，分別于0，1，2，3，5，7 d等時間點采集樣品，用液氮速凍后于-80 ℃保存，備用.

將白粉病菌分生孢子均勻撒在長勢一致的橡膠樹淺綠色嫩葉上，于25 ℃保濕培養(yǎng)，并分別于0，1，2 ，3，5，7 d等時間點采集樣品，用液氮速凍后于-80 ℃保存，備用.

圖1 HbGNOM 基因的cDNA 全長擴 增(M：Marker 5 000；1：HbGNOM 基因 cDNA 片段)

1.6不同信號分子對橡膠樹的處理配置SA(5 mmol·L-1，φ=0.1%的乙醇)，JA(1 mmol·L-1，φ=0.1%的乙醇)，ET(10 mmol·L-1，φ=0.1%的乙醇)等溶液，分別均勻噴霧于長勢一致的淺綠期橡膠樹葉片上，以φ=0.1%的乙醇處理作為對照，然后分別于處理后的0，12，24，36，48，72 h等時間點采集橡膠樹葉片樣品，用液氮速凍后于-80 ℃保存，備用.

1.7 RT-PCR半定量分析按1.2方法提取各樣品的總RNA，并合成cDNA.選用橡膠樹HbActin作為內(nèi)參基因，其HbActin特異性擴增引物序列為：HbActin-F(5′CAGTGGTCGTACAACTGGTAT3′)，HbActin-R(5′ATCCTCCAATCCAGACACTGT3′).PCR擴增體系：10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTP mix(10 mmol·L-1)1 μL，HbGNOM-F(10 μmol·L-1)和HbGNOM-R(10 μmol·L-1)各1μL，稀釋10倍的cDNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶 0.5 μL，加ddH2O補足至25μL.擴增HbGNOM的PCR反應條件：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，28個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min.擴增HbActin 的PCR反應條件：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，26個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min.

2 實驗結(jié)果

2.1巴西橡膠樹基因HbGNOM的克隆及生物信息學分析HbGNOM基因編碼區(qū)特異性擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1.序列測定結(jié)果表明：該片段包含了一個4 410 bp的開放閱讀框，編碼了一個含1 469個氨基酸的多肽(圖2).該蛋白的等電點為4.79，分子質(zhì)量為364.57 KD，屬于大型的ARF-GEF酸性蛋白.

圖2 橡膠樹HbGNOM的cDNA全長核苷酸序列及其ORF推測的氨基酸序列(圖中陰影部分為Sec7保守結(jié)構(gòu)域)

在GenBank的CDD數(shù)據(jù)庫中進行搜索時發(fā)現(xiàn)，HbGNOM蛋白的565-748氨基酸區(qū)段為Sec7保守結(jié)構(gòu)域(圖2).利用HbGNOM蛋白的全長氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對時發(fā)現(xiàn)，HbGNOM與麻風樹(Jatrophacurcas, XP_012067704)、木薯(Manihotesculenta,OAY_59447)、蓖麻(Ricinuscommunis, XP_002522485)以及擬南芥(Arabidopsisthaliana,NP_172851)的GNOM蛋白的相似性分別為97%，96 %，95 %和84%，其中，Sec7保守結(jié)構(gòu)域高度同源(圖3).

圖3 橡膠樹HbGNOM 與其它植物中的GNOM 氨基酸的Sec7 保守結(jié)構(gòu)域保守序列的比對結(jié)果

圖4 擬南芥ARF-GEF 家族成員及不同植物中GNOM 同源蛋白的系統(tǒng)進化分析

為了分析橡膠樹HbGNOM與擬南芥ARF-GEF成員以及與其他植物GNOM蛋白的親緣關系，利用鄰接法對擬南芥的ARF-GEF成員：AtGNOM(NP_172851)、AtGNL1(NP_198766)、AtGNL2(NP_1974621)、BIG1 (NP_195533)、BIG2 (NP_191645)、BIG3 (NP_171698) 、BIG4 (NP_195264) 和BIG5 (NP_001327198)，3個相同科屬的大戟科植物的GNOM蛋白(Jatrophacurcas，XP_012067704；Ricinuscommunis, XP_002522485;Manihotesculenta, OAY59447)，6個不同科屬的木本植物的GNOM蛋白(Citrussinensis, XP_006483104;Theobromacacao, XP_007045997;Vitisvinifera, XP_010663244;Gossypiumarboreum, XP_017641649;Juglansregia, XP_018821790;Eucalyptusgrandis, XP_010044471)，3個草本植物的GNOM蛋白(Solanumlycopersicum, XP_010320912;Nicotianaattenuata, XP_019234045;Brassicanapus, XP_013641356)，以及1個單子葉植物(水稻)的預測GNOM蛋白(Oryzasative, XP_015630801)構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4).結(jié)果表明，HbGNOM與擬南芥的AtGNOM歸為一類，其與同為大戟科的木薯、麻風樹、蓖麻的GNOM親緣關系最近，與單子葉植物(水稻)的親緣關系最遠.

2.2 HbGNOM基因?qū)ο鹉z樹白粉病菌和炭疽病菌侵染的應答在內(nèi)參基因HbActin表達水平一致的情況下，對照組橡膠樹葉片HbGNOM基因的表達水平無明顯變化，而接種白粉病菌3天時檢測出HbGNOM基因的表達量明顯上調(diào)(圖5).但是，接種炭疽病菌后，HbGNOM基因在不同時間點的表達量也無明顯變化，與對照(未接種)中的表達水平相似.這些結(jié)果說明：HbGNOM參與了橡膠樹對白粉病菌侵染的應答，但不應答炭疽病菌的侵染.

圖5 白粉病菌(Odium heveae Steinm)和炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)接種橡膠樹葉片對HbGNOM 基因表達的影響

2.3不同抗病信號分子處理對橡膠樹葉片中HbGNOM基因表達的影響在內(nèi)參基因HbActin表達量相同的情況下，與對照處理相比，ET處理橡膠樹葉片12 h后HbGNOM基因的表達明顯加強，72 h之后逐漸恢復正常表達水平，而SA和JA處理后對HbGNOM的表達沒有影響(圖6).這些結(jié)果說明：HbGNOM基因與ET介導的抗病信號途徑有關，而與SA、JA介導的信號途徑關系不明顯.

圖6 不同激素處理橡膠樹葉片對bGNOM 基因表達的影響

3 討 論

ARF 的鳥核苷酸交換因子(ARF-GEFs)能夠?qū)⒎腔罨癄顟B(tài)的ARF-GDP 轉(zhuǎn)換成活化態(tài)的 ARF-GTP，從而發(fā)揮其生物學功能[17].ARF-GEFs均含有Sec7保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠促進ARF和GEF的結(jié)合并催化GDP/GTP的交換[18].模式植物擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)8個ARF-GEF家族成員：AtGNOM(NP_172851)、AtGNL1(NP_198766)、AtGNL2(NP_1974621)、BIG1(NP_195533)、BIG2(NP_191645)、BIG3(NP_171698)、BIG4(NP_195264)和BIG5(NP_001327198)，均含有Sec7保守結(jié)構(gòu)域[1].GNL1是與GNOM最近的同源蛋白，它在內(nèi)體和高爾基體的運輸中起著重要作用[6].擬南芥的8個ARF-GEF家族成員在細胞內(nèi)的定位各不相同，其中GNOM蛋白定位于細胞的內(nèi)體，參與蛋白的分揀[1]，GNL1主要位于高爾基體，為蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基運輸所必需的成員[19]，其他成員的定位和功能還不清楚.本研究克隆和鑒定了橡膠樹中GNOM的同源基因HbGNOM，從序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果來看，該基因編碼的蛋白與其他植物來源的GNOM具有高度同源性，且含有保守的Sec7保守結(jié)構(gòu)域.根據(jù)這些結(jié)構(gòu)特征推斷，HbGNOM是橡膠樹ARF-GEF基因家族的成員，是擬南芥AtGNOM的同源蛋白.

目前關于GNOM的研究主要集中在擬南芥，認為其是通過參與植物的囊泡運輸來影響植物的生長發(fā)育的，例如參與生長素運輸?shù)恼{(diào)控、影響植物根部的生長、調(diào)解植物根部的向水性和向地性等[6,11-12].此外，植物在受到生物脅迫時，GNOM可以通過調(diào)控植物囊泡運輸來參與蛋白的運輸，從而影響植物的抗病防衛(wèi)反應[20].擬南芥的GNOM蛋白可以通過介導乳突合成關鍵元件PEN1的運輸以及增加胼胝質(zhì)的累積來提高植物抵抗白粉病菌入侵的能力，從而提高植物對白粉病的抗性，該過程需要SA、JA和ET等信號傳導途徑的參與[14,21].目前，還沒有關于HbGNOM基因參與植物對其他病害抗性的報道.本研究發(fā)現(xiàn)，外源ET能夠誘導HbGNOM基因的表達，但SA、JA等信號分子對HbGNOM基因的表達影響不明顯，白粉病菌侵染橡膠樹葉片也能夠引起HbGNOM基因的上調(diào)表達，暗示HbGNOM 基因參與了橡膠樹對白粉病菌的抗病反應，且該過程與ET信號傳導途徑有關.這說明橡膠樹HbGNOM與擬南芥AtGNOM在抗白粉病方面可能具有相似的生物學功能，但其中涉及到的信號傳導途徑存在差異.此外，在對白粉病的抗性方面，HbGNOM是否也是通過橡膠樹PEN1同源蛋白來發(fā)揮其作用等，對于此類問題還需要做進一步的研究和探討.

[1] Anders N, Jurgens G. Large ARF guanine nucleotide exchange factors in membrane trafficking[J]. Cell Mol Life Sci, 2008, 65(21): 3 433-3 445.

[2] Lee D M,Harris T J. An Arf-GEF regulates antagonism between endocytosis and the cytoskeleton for drosophila blastoderm development[J]. Current Biology,2013,23(21): 2 110-2 120.

[3] Mouratou B, BiouV, Joubert A, et al. The domain architecture of large guanine nucleotide exchange factors for the small GTP-binding protein Arf[J]. BMC Genomics, 2005, 6(1): 20.

[4] Gillingham AK, Munro S. The small G proteins of the Arf family and their regulators[J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2007, 23(23): 579-611.

[5] Yang Z. Small GTPase: versatile signaling switches in plants[J]. The Plant Cell, 2002, 14(suppl): 375-388.

[6] Liu S P,Wang L,Xue Y H. Research progress in ARF-GEF gene family[J]. Hereditas, 2009,31(10): 982-992.

[7] Shevell D E, Leu W M, Gillmor C S, et al. EMB30 is essential for normal cell division, cell expansion, and cell adhesion inArabidopsisand encodes a protein that has similarity to Sec7[J]. Cell, 1994, 77 (7): 1 051-1 062.

[8] Okumura K, Goh T, Toyokura K, et al. GNOM/FEWER ROOTS is required for the establishment of an auxin response maximum forArabidopsislateral root initiation[J]. Plant & Cell Physiology,2013,54(3): 406-417.

[9] Tanaka H, Nodzyński T, Kitakura S. BEX1/ARF1A1C is required for BFA-sensitive recycling of PIN auxin transporters and auxin-mediated development inArabidopsis[J]. Plant & Cell Physiology, 2014,55(4): 737-749.

[10] Naramoto S, Otegui M S, Kutsuna N, et al. Insights into the localization and function of the membrane trafficking regulator GNOM ARF-GEF at the golgi apparatus inArabidopsis[J]. The Plant Cell, 2014, 26(7): 3 062-3 076.

[11] Geldner N, Richter S, Vieten A, et al. Partial loss-of-function alleles reveal a role for GNOM in auxin transport-related, post-embryonic development ofArabidopsis[J]. Development, 2004, 131(2): 389-400.

[12] Doyle S M,Haeger A, Vain T, et al. An early secretory pathway mediated by GNOM-LIKE 1 and GNOM is essential for basal polarity establishment inArabidopsisthaliana[J]. PNAS,2015,112(7):806-815.

[13] Moriwaki T, Miyazawa Y, Fujii N, et al. GNOM regulates root hydrotropism independently of PIN-mediared auxin transport[J].Plant Science,2014,215-216(215-216c):141-149.

[14] Takemoto D, Jones A, Hardham R A. Re-organization of the cytoskeleton and endoplasmic reticulum in theArabidopsispen1-1 mutant inoculated with the non-adapted powdery mildew pathogen,Blumeriagraminisf. sp.Hordei[J].Molecular Plant Pathology, 2006, 7(6 ): 553-563.

[15] Nielsen M E, Feechan A, Bohlenius H, et al.ArabidopsisARF-GTP exchange factor, GNOM, mediates transport required for innate immunity and focal accumulation of syntaxin PEN1[J]. PNAS, 2012, 109(28): 11 443-11 448.

[16] Verwoerd T C, Dekker B M, Hoekema A. A small-scale procedure for the rapid isolation of plant RNAs[J]. Nucleic Acids Research, 1989, 17(6): 2 362.

[17] Casanova J E. Regulation of Arf activation: the Sec7 family of guanine nucleotide exchange factors[J]. Traffic, 2007, 8(11): 1 476-1 485.

[18] Richter S, Geldner N, Schrader J, et al. Functional diversification of closely related ARF-GEFs in protein secretion and recycling[J]. Nature, 2007, 448(7 152): 488-492.

[19] Richardson B C, Mcdonold C M, Fromme J C. The Sec7 Arf-GEF is recruited to the trans-Golgi network by positive feedback[J]. Developmental Cell,2012,22(4):799-810.

[20] Frei dit Frey N, Robatzek S. Taf cking vesicles: Pro or contra pathogens?[J].Curr Opin Plant Biol, 2009, 12(4): 437-443.

[21] Zhang Z, Feechan A, Pedersen C, et al. A SNARE-protein has opposing functions in penetration resistance and defence signalling pathways[J]. The Plant Journal, 2007, 49(2): 302-312.

Abstract：The ARF guanine nucleotide exchange factors (ARF-GEF), together with small G protein, plays roles in vacuolar sorting and protein targeting. In the study，based on the transcriptome data ofHeveabrasiliensis, an ARF-GEF was amplified by RT-PCR and named as HbGNOM. The ORF of HbGNOM was 4 410bp, encoding 1 470 amino acids. Bioinformatics analysis results showed that compared with that of GNOM fromJatrophacurcas,Manihotesculenta,RicinuscommunisandArabidopsisthaliana, the homogenicity of amino acid sequence of HbGNOM is 97%, 96%, 95% and 84%，respectively. Semi-quantitative RT-PCR analysis results indicated that the expression of HbGNOM in rubber tree leaves was significantly induced by ethylene (ET), while there are no obvious responses to salicylic acid (SA) and jasmonic acid (JA). The expression of HbGNOM was significantly induced in rubber tree leaves inoculated withOdiumheveaeSteinm, but there is no responses observed when the rubber leaves were infected withColletotrichumgloeosporoiodes. These findings suggested that HbGNOM might involve in the ET-mediated signaling pathway and the rubber tree resistance to powdery mildew.

Keywords：Heveabrasiliensis; HbGNOM; expression analysis

CloningandExpressionAnalysisofanARFGuanineNucleotideExchangeFactorsNamedasHbGNOMinHeveabrasiliensis

Zheng Xingyu, Wang Qingnan, Luo Hongli

(Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource, Institute of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou 570228, China)

Q 3

A DOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2017.0039

2017-04-12

國家自然科學基金項目(31160151，31360424)；海南省自然科學基金項目(314047)

鄭昕宇(1992-)，男，吉林舒蘭人，海南大學熱帶農(nóng)林學院2014級碩士研究生

羅紅麗(1973-)，女，河南鄧縣人，研究員，碩士研究生導師，研究方向：植物與病原微生物的相互作用，E-mail：hlluo@hainu.edu.cn

1004-1729(2017)03-0246-07