馬 濤，劉為民，曲 琳，楊笑染，薛希均，劉銘芳，鄧 斌，周智勇，陶寶鴻

·臨床研究·

水蛭素對(duì)喉癌荷瘤小鼠的抑瘤作用研究

馬 濤1，劉為民1，曲 琳1，楊笑染1，薛希均2，劉銘芳1，鄧 斌1，周智勇1，陶寶鴻3

目的觀察水蛭素對(duì)喉癌荷瘤小鼠的抑瘤作用。方法將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，小鼠左前腋窩下皮下種瘤建立實(shí)體瘤模型，陽(yáng)性對(duì)照組以氟尿嘧啶20mg/kg腹腔注射；水蛭素高劑量組以2.5g/(kg·d)灌胃；陰性對(duì)照組以生理鹽水0.1mL/(10g·d)灌胃；水蛭素低劑量組以1.2g/(kg·d)灌胃。連續(xù)用藥14 d后處死小鼠取荷瘤鼠腫塊稱重，并將瘤組織包埋、固定、切片、染色等，計(jì)算抑瘤率，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測(cè)瘤組織中C-met的表達(dá)。結(jié)果水蛭素高、低劑量組對(duì)小鼠喉癌細(xì)胞均有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為40.1%、26.92%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4組中C-met均呈陽(yáng)性表達(dá)，水蛭素高、低劑量組C-met的表達(dá)均下調(diào)，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論水蛭素對(duì)小鼠喉癌細(xì)胞抑制作用顯著。

水蛭素;喉癌;C-met;抑瘤作用

美國(guó)的一項(xiàng)研究分析表明喉癌的發(fā)病率占頭頸癌的25%[1]，我國(guó)喉癌的發(fā)病率約占全身癌癥的1%～5%[2]。從水蛭中可以提取出一種活性成分較高的物質(zhì)——水蛭素(Hirudin),它可以抑制凝血酶。多項(xiàng)研究表明在全身腫瘤中，C-met基因均呈現(xiàn)過(guò)度表達(dá)。本研究中，我們建立喉癌荷瘤小鼠模型，觀察水蛭素對(duì)小鼠喉癌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：2015年自寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)小鼠雌雄各半共40只，周齡(8±1)周，體質(zhì)量(20±0.5)g。小鼠喉癌瘤細(xì)胞由南京科佰科技有限公司提供。自上海信裕生物科技公司購(gòu)買(mǎi)重組人水蛭素；自天津金耀氨基酸公司購(gòu)買(mǎi)氟尿嘧啶注射劑，規(guī)格10 mL，25 g/支；自北京哲成科技有限公司購(gòu)買(mǎi)C-met SP免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒。光學(xué)顯微鏡、恒溫干燥箱由寧夏人民醫(yī)院病理科提供；臺(tái)式高速離心機(jī)由寧夏人民醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組： 將40只小鼠隨機(jī)分為A、B、C、D 4組(A為陰性對(duì)照組、B為高劑量水蛭素組、C為陽(yáng)性對(duì)照組、D為低劑量水蛭素組)，每組10只。

1.2.2 模型動(dòng)物：抽取荷瘤喉癌小鼠瘤細(xì)胞(傳代6～8 d)，細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至3×106個(gè)/mL(利用滅菌注射用水稀釋)，各個(gè)小鼠左腋下嚴(yán)格消毒后皮下接種0.1 mL，接種后第2天開(kāi)始給藥：A組胃內(nèi)注入生理鹽水，濃度0.1 mL/(10 g·d)；B組水蛭素胃內(nèi)注入，濃度2.5g/(kg·d)； C組用氟尿嘧啶腹腔注射，濃度20 mg/(kg·d)；D組水蛭素胃內(nèi)注入，濃度1.2 g/(kg·d)。每日1次，每次0.5 mL，連續(xù)用藥14 d后處死小鼠并稱重量，然后切開(kāi)、分離、切除腫物并稱各自瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。

1.2.3 抑瘤率計(jì)算[3]:以百分比(%)表示,抑留率=(A組腫瘤質(zhì)量均值-B/C/D組腫瘤質(zhì)量均值)/A組腫瘤質(zhì)量均值×100%。

1.2.4 檢測(cè)C-met在腫瘤組織中的表達(dá)(免疫組化法)：用甲醛液(濃度10%)固定切除下來(lái)的瘤組織，然后對(duì)標(biāo)本進(jìn)行脫水、包埋、切片(厚度約4 μm)，對(duì)已經(jīng)備好的切片脫蠟、脫水、沖洗，然后加入3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化氫10 min，枸櫞酸鹽緩沖液抗原封閉，100 ℃條件下10min，經(jīng)過(guò)自然冷卻至室溫后，常溫下進(jìn)行PBS沖洗。PBS沖洗后標(biāo)本內(nèi)加入血清封閉，室溫放置10 min，然后去除血清后加入C-met一抗，4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗3次各5 min后，標(biāo)本內(nèi)加入聚合物輔助劑，在37 ℃條件下經(jīng)過(guò)20 min，再次PBS沖洗，加入IgG多聚體，在37 ℃條件下經(jīng)過(guò)20 min，重復(fù)利用PBS進(jìn)行標(biāo)本的沖洗，然后經(jīng)過(guò)顯色、復(fù)染、脫水、封片。

1.2.5 結(jié)果判定:利用分析軟件計(jì)算出平均光密度值，用此值代表C-met在組織表達(dá)水平的數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 瘤質(zhì)量的測(cè)定:試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)抑瘤率的計(jì)算，水蛭素高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、水蛭素低劑量組的抑瘤率分別為40.10%、59.89%、 26.92%。與陰性對(duì)照組比較，水蛭素高、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組瘤質(zhì)量及抑瘤率比較

注：*與陰性對(duì)照組比較，P<0.05。

2.2 C-met的表達(dá):將棕黃色的C-met的表達(dá)定義為陽(yáng)性，本研究中不同的組別均表現(xiàn)為陽(yáng)性表達(dá)，但除陰性對(duì)照組外，其余組別均表現(xiàn)為表達(dá)下降(圖1，目錄后)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 4組C-met平均光密度值表達(dá)情況

注：*與陰性對(duì)照組比較，P<0.05。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，高凝狀態(tài)是大多腫瘤患者血液的特定表現(xiàn)形式，而這樣的高凝狀態(tài)決定了抗癌藥物很難被吸收而發(fā)揮作用[4]。水蛭為環(huán)節(jié)動(dòng)物水蛭螞蟥寬體金線蛭，具有很強(qiáng)的活血功效，Hirudin則是在水蛭中提取出的最具活性的一種成分，具有強(qiáng)大的抑制凝血酶的作用。研究表明，Hirudin能顯著降低血液黏度，具有抗凝、抗血栓的作用[5]，這種功效有利于藥物進(jìn)入組織殺滅腫瘤細(xì)胞，促使腫瘤細(xì)胞逐步走向凋亡[6-7]，從而使其抗腫瘤效力得以發(fā)揮。此次實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)數(shù)據(jù)提示，對(duì)于荷瘤鼠喉癌，Hirudin能明顯抑制腫瘤的發(fā)生，其抑瘤率在高、低劑量組分別為40.10%、26.92%。

C-met是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(HGFR)，在正常組織中表達(dá)很低。研究表明，在多種腫瘤患者中，分子機(jī)制可以激活C-met，均檢測(cè)出C-met高水平表達(dá)[8]和基因擴(kuò)增。因此認(rèn)為，C-met高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，C-met高表達(dá)，能使腫瘤細(xì)胞的活躍程度和對(duì)周?chē)M織、全身的破壞性明顯增加，在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。本次試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同分組中，C-met均呈陽(yáng)性表達(dá)，但是在高、低劑量組其表達(dá)下降。多組均數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明Hirudin能抑制喉癌實(shí)體瘤C-met的表達(dá)，具有明顯的抗腫瘤作用，這可能是Hirudin抗喉癌的作用機(jī)制。

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Inhibitoryeffectofhirudinonthelaryngealcarcinomatumor-bearingmice

MATao1,LIUWeiming1,QULin1,YANGXiaoran1,XUEXijun2,LIUMingfang1,DENGBin1,ZHOUZhiyong1,TAOBaohong3.

1.DepartmentofOtorhinolaryngology,NingxiaPeople’sHospital,Yinchuan750002；2.DepartmentofOtorhinolaryngology,KunmingGeneralHospitalofPLA,Kunming650021,China；3.TaizhouMunicipalHospital，Taizhou318000,China

Correspondingauthor:LIUWeimin,Email：lwm2313@163.com

AbstractObjectiveTo investigate the inhibitory effect of hirudin on the laryngeal carcinoma tumor-bearing mouse.Methods40 mice were randomly divided into 4 groups (n=10),and planted with laryngeal cancer cells subcutaneous at the left armpit to set the tumor model.In positive control group,mice were intraperitoneal injected with fluorouracil (20 mg/kg);in negative control group,mice received NS 0.1ml/ (10 g·d),in high-dose hirudin group,mice were accepted 2.5 g/(kg·d).While low-dose hirudin group received 1.2 g/(kg·d).Mice were sacrificed after continuously treatment for 14 days,and the tumor were taken and weighed,the tumor tissue were prepared for immunostaining to calculate the tumor inhibition rate and the expression of C-met.ResultsBetween the high-dose and low-dose of hirudin inhibited the laryngeal cancer cells,the tumor inhibition rate was 40.1%,26.92% respectively,which had significant difference compared with control group (P<0.05),C-met positive staining was observed in 4 groups while the expression was down-regulated in both high-dose and low-dose hirudin groups,which had significant difference compared with control (P<0.05).ConclusionThe inhibitory effect of hirudin is significant on the laryngeal carcinoma tumor-bearing mice.

Hirudin;Laryngealcancer;C-met;Tumorsuppressioneffect

10.13621/j.1001-5949.2017.09.0792

寧夏自然基金資助項(xiàng)目(NZ1319)

1.寧夏人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，寧夏 銀川 750002 2.解放軍昆明總醫(yī)院耳鼻咽喉科，云南 昆明 650021 3.浙江省臺(tái)州市市立醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 318000

劉為民,Email：lwm2313@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170926.1024.024.html

R739.65

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2017-05-25責(zé)任編輯馬興忠