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(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北武漢 430068)

大米谷蛋白熱聚集的鹽效應(yīng)及機制

袁江蘭,黃亞明,李傳雯,康旭

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北武漢430068)

大米谷蛋白易發(fā)生熱聚集,離子強度對大米谷蛋白熱聚集有明顯影響,研究揭示NaCl對大米谷蛋白的熱聚集的影響規(guī)律及機制。當(dāng)NaCl濃度從0增加至0.15 mol·L-1時,熱處理大米谷蛋白溶解度由13.78%降至12.49%,減小趨勢不明顯,濃度達到0.30 mol·L-1時,溶解度降至10.62%,并且出現(xiàn)了肉眼可見的渾濁。當(dāng)NaCl濃度從0 mol·L-1增加至0.30 mol·L-1時,熱處理大米谷蛋白的濁度由0.052顯著增加至0.191,平均粒徑由168 nm增至273 nm,并出現(xiàn)明顯的聚集峰,Zeta電位由-14.4減小至-5.61,疏水性由329.16增加至535.80,谷蛋白熒光發(fā)射光譜發(fā)生微小藍移,熒光強度增加。NaCl影響了谷蛋白分子的表面電荷和疏水性,當(dāng)濃度大于0.15 mol·L-1時明顯促進了大米谷蛋白分子熱聚集。

大米,谷蛋白,熱聚集,氯化鈉,疏水性

Abstract:Rice glutelin was prone to thermal aggregation,and ionic strength had obvious effect on its thermal aggregation. Here,the effect laws and mechanisms of rice glutelin thermal aggregation by NaCl were revealed. When NaCl concentration increased from 0～0.15 mol·L-1,solubility of rice glutelin treated by heat decreased from 13.78% to 12.49%,which seemed not to be obvious,but the solubility was 10.62% when NaCl concentration was 0.30 mol·L-1,and it appeared to be turbid. The turbidity of rice glutelin by heat treatment increased significantly from 0.052 to 0.191 when NaCl concentration increased from 0～0.30 mol·L-1,average particle size increased from 168 nm to 273 nm,and an aggregation peak rised,Zeta potential changed from -14.4 to -5.61,and hydrophobicity increased from 329.16 to 535.80,there was a slight blue shift for fluorescence emission spectrum of rice glutelin by heat treatment,and fluorescence intensity increased. NaCl affected surface charge and hydrophobicity of rice glutelin by heat treatment,and promoted its thermal aggregation when concentration of NaCl was more than 0.15 mol·L-1.

Keywords:rice;glutelin;thermal aggregation;sodium chloride;hydrophobicity

熱處理是食品工業(yè)中常用的操作單元,常常造成食品蛋白質(zhì)發(fā)生變性聚集,蛋白質(zhì)熱聚集對食品質(zhì)構(gòu)、營養(yǎng)和功能等均有一定影響。蛋白質(zhì)遇熱后結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,分子內(nèi)部的疏水基團暴露于分子表面,使分子之間的表面吸引力大于排斥力,而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集[1]。聚集會引起蛋白質(zhì)性質(zhì)和功能發(fā)生變化,如溶解性降低、生物活性喪失等[2]。球蛋白遇熱變性后,還可以形成可溶性聚集體,如果蛋白濃度超過臨界值則聚集體可交聯(lián)形成凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[3]。

探究食品蛋白質(zhì)熱聚集過程可以更好地控制加工操作參數(shù)從而控制食品品質(zhì)。離子強度是影響蛋白質(zhì)熱聚集的重要因素,NaCl是常用的食品添加劑,影響著食品中共存成分的微環(huán)境,從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性。如大豆蛋白中增加適當(dāng)?shù)柠}分可以有效降低蛋白的靜電斥力,使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,進一步促進改善大豆蛋白的乳化性和持油性等功能特性,同時產(chǎn)生了蛋白質(zhì)-鹽相互作用,因此利用鹽離子可以從分子水平上控制蛋白質(zhì)溶液的結(jié)構(gòu)以及熱力學(xué)性質(zhì)[4]。熱處理過程中,單價或二價的鹽離子對帶電蛋白質(zhì)產(chǎn)生的電荷屏蔽作用會增大蛋白質(zhì)之間的相互作用[5],使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集。β-乳球蛋白在pH7.0、低離子強度的條件下,有細長型聚集體形成,在較高離子強度的環(huán)境下,這些小的聚集體會發(fā)生相互纏結(jié)形成更大的聚集體[6]。

大米谷蛋白的熱聚集是大米類食品加工和生產(chǎn)過程中常見的現(xiàn)象,NaCl也是大米類產(chǎn)品中常用的食品成分,與大米谷蛋白共存于食品中參與構(gòu)成食品的化學(xué)體系。NaCl對其他蛋白質(zhì)聚集的影響已有文獻報道,而它在大米谷蛋白聚集中的作用尚無人論及,本文探究NaCl對大米谷蛋白熱聚集的影響及機制,為大米谷蛋白理論研究和應(yīng)用推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米 為市售粳米(OryzasativaL.);1-苯氨基萘-8-磺酸(ANS)、牛血清白蛋白 為biosharp產(chǎn)品;氯化鈉等 均為國產(chǎn)分析純。

UV-2100紫外-可見分光光度計 尤尼柯儀器有限公司;Zeta-Sizer 2000電位儀 英國Malvern公司;日立F-7000熒光分光光度計 日立高新技術(shù)公司;ZNC-410超微粉粹機 北京興時利和科技發(fā)展有限公司

1.2 實驗方法

1.2.1 大米谷蛋白制備 采用堿溶酸沉法[7-8]。將大米超微粉碎得大米粉,將大米粉和0.05 mol·L-1NaOH溶液按固液比1∶10 (m∶v)混合,室溫磁力攪拌4 h,然后5000 r/min離心30 min,取上清液,再用0.05 mol·L-1的鹽酸調(diào)等電點到4.8,靜置12 h后,將樣品調(diào)到pH7.0。離心取沉淀,再用去離子水洗沉淀三次除去可溶性物質(zhì)。將沉淀用5% NaCl(w∶v/1∶8)提取3.5 h后,除去少量的清蛋白和球蛋白,再次離心取沉淀,沉淀采用75%乙醇(w∶v/1∶8)提取3.5 h后離心除去醇溶蛋白。最后冷凍干燥得到谷蛋白凍干粉。

1.2.2 不同NaCl濃度的谷蛋白樣品制備 大米谷蛋白凍干粉按照1/15 (w/v)加入至pH11.0磷酸鹽緩沖液中,制成分散液,室溫下磁力攪拌2 h,10000 r/min離心30 min取上清液,再經(jīng)0.45 μm醋酸纖維素膜過濾。將濾過液與不同濃度的NaCl溶液按照1∶2 (V∶V)混合均勻制成NaCl濃度分別為0、0.05、0.10、0.15、0.30 mol·L-1的谷蛋白溶液,再加至具塞試管中90 ℃加熱30 min,冷卻至室溫,得五組樣品,分別測定其溶解度、濁度、粒徑分布、Zeta電位、表面疏水性指數(shù)和熒光光譜。

1.2.3 蛋白質(zhì)溶解度測定 采用Bradford法[9]。將1.2.2中樣品10000 r/min離心30 min,取上清液,測定上清液蛋白質(zhì)含量,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。并按下式計算溶解度:

式中,S:溶解度(%);P0:上清液中蛋白質(zhì)的總量(mg);P1:凍干樣品中蛋白質(zhì)的總量(mg)。

1.2.4 濁度測定 測定樣品在600 nm處的吸光值,以表征其濁度。

1.2.5 粒徑分布 采用Malvern納米粒度分布儀,散射角度為173°,室溫測定。

1.2.6 Zeta電位 采用Malvern Zeta電位儀,一對0.45 cm2鉑電極,間距為0.4 cm,測定溫度25 ℃。

1.2.7 表面疏水性指數(shù) 采用ANS熒光探針法[10]。將1.2.2制備的樣品溶于pH7.0的PBS緩沖液中,每組樣品均制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的系列濃度溶液。測前加入8 mmol·L-1ANS儲液20 μL,振蕩均勻后測定其熒光強度(FI),激發(fā)波長為390 nm,發(fā)射波長為480 nm。均以谷蛋白濃度為0.02 mg/mL的樣品為基準(zhǔn),作相對熒光強度-谷蛋白濃度的直線,該直線的斜率作為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)(H0)。

1.2.8 熒光光譜分析 采用F-7000熒光分光光度計測定[11]。激發(fā)波長為290 nm,在300～400 nm掃描發(fā)射光譜,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm。

1.3 統(tǒng)計分析方法

每個樣品均做三個平行,每個平行測定重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。采用Origin 8.0處理和分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶解度變化

蛋白質(zhì)的溶解度受離子強度的影響[12]。由圖1可以看出,即使低濃度的NaCl共存,也會導(dǎo)致熱處理大米谷蛋白溶解度的下降,隨著NaCl濃度的增大,熱處理大米谷蛋白溶解度呈下降趨勢,當(dāng)NaCl濃度達到0.30 mol·L-1時,溶解度降至10.62%,溶液呈現(xiàn)明顯的渾濁,這與不加NaCl處理的對照組形成明顯區(qū)別,表明NaCl對谷蛋白的熱聚集具有明顯促進作用,特別是NaCl濃度較高時,聚集程度明顯增加。當(dāng)離子強度較低時,鹽離子中和蛋白質(zhì)表面的電荷,從而產(chǎn)生電荷屏蔽效應(yīng),若蛋白質(zhì)含有較高的非極性區(qū)域,則屏蔽效應(yīng)可降低其溶解度[5,13];當(dāng)NaCl濃度較高時,鹽離子與蛋白質(zhì)分子表面帶相反電荷的基團結(jié)合,中和了生物分子表面的電荷,降低了蛋白質(zhì)分子與水分子之間的相互作用,蛋白質(zhì)表面水化層逐漸被破壞,排斥力減小而發(fā)生聚集,另外,大量的鹽離子存在時,鹽離子自身的水合作用降低了自由水的濃度,使蛋白質(zhì)水化層脫去,疏水區(qū)域暴露而發(fā)生相互聚集[14]。表明谷蛋白分子表面的疏水性很強且電荷數(shù)很小,即使在遠高于其PI的堿性環(huán)境中也是如此,進一步說明了這一結(jié)構(gòu)特點。

圖1 NaCl對熱處理大米谷蛋白溶解度的影響Fig.1 Effect of NaCl on solubility of rice glutelin by heat treatment

2.2 濁度變化

對NaCl處理的樣品進行觀察,很明顯,在NaCl濃度低于0.15 mol·L-1時,溶液澄清透明,當(dāng)濃度為0.30 mol·L-1時,溶液變成乳狀渾濁液。由圖2可知,隨著NaCl濃度增加,大米谷蛋白在600 nm處的吸光值逐漸增大,即溶液濁度逐漸增加,當(dāng)NaCl濃度低于0.15 mol·L-1時,溶液濁度變化并不明顯,但是當(dāng)NaCl達到0.30 mol·L-1時,濁度顯著增加(p<0.05),并且肉眼可見透明溶液變成乳濁液,逐漸有沉淀析出。NaCl濃度從0～0.30 mol·L-1時,濁度值由0.052顯著增加至0.191。大豆分離蛋白在低離子強度下加熱,濁度不會明顯增加,而離子強度增大后,溶液變濁[4,15]。大豆球蛋白的聚集對離子強度也具有依賴性,對低離子強度下的熱處理敏感,易發(fā)生聚集[15]。NaCl在溶液中產(chǎn)生的靜電屏蔽作用促進了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用力,使得蛋白質(zhì)聚集,樣品的濁度增大[15-16]。熱處理的乳清分離蛋白和β-乳球蛋白在NaCl濃度大于0.054 mol·L-1時,隨著NaCl濃度增加,濁度急劇增加[17]。大米谷蛋白在NaCl共存時的濁度變化特點與大豆分離蛋白相似,在低鹽濃度下濁度變化不明顯,而鹽濃度為0.30 mol·L-1時,變濁變化明顯,反映出大米谷蛋白分子表面結(jié)構(gòu)上的疏水性和低電荷特點。

圖2 NaCl對大米谷蛋白濁度的影響Fig.2 Effect of NaCl on turbidity of rice glutelin

2.3 粒徑變化

由圖3可知,隨著NaCl濃度增加,谷蛋白粒徑有增大趨勢,當(dāng)NaCl濃度從0增加至0.30 mol·L-1時,平均粒徑由168 nm增至273 nm,還出現(xiàn)了明顯的聚集峰。但NaCl濃度低于0.15 mol·L-1時,NaCl對谷蛋白粒度影響并不明顯,說明較低離子濃度不會明顯促進谷蛋白聚集,當(dāng)NaCl濃度進一步增加,谷蛋白粒徑有明顯增加趨勢,并且形成聚集峰。其它蛋白質(zhì)在離子的作用下,也存在聚集的趨勢。在低離子強度下加熱,卵白蛋白會形成線性聚集物,隨著離子強度增加,線性聚集向多膠束型聚集轉(zhuǎn)化,其中,疏水作用力均是聚集的重要誘導(dǎo)力[18]。

圖3 NaCl對大米谷蛋白粒徑的影響Fig.3 Effect of NaCl on size of rice glutelin

2.4 Zeta電位變化

Zeta電位是對膠體粒子之間相互排斥或吸引力的強度的度量,與膠態(tài)分散的穩(wěn)定性相關(guān),Zeta電位絕對值越高,體系越穩(wěn)定,溶液中蛋白質(zhì)溶解和分散狀態(tài)良好,而Zeta電位絕對值越低,體系蛋白質(zhì)則趨于聚集[4]。蛋白質(zhì)溶液是一種典型的膠態(tài)分散體系,Zeta電位是蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定性的有效度量參數(shù)。由圖4可知,未經(jīng)任何處理的大米谷蛋白溶液Zeta電位值較低,是一個不穩(wěn)定體系,有明顯的聚集趨勢,而NaCl的存在進一步降低了其Zeta電位值,進一步加劇了其聚集趨勢,顯然這種趨勢還與NaCl濃度具有明顯的相關(guān)性,相同條件下,NaCl濃度越高,聚集趨勢越明顯。NaCl對大米谷蛋白聚集的影響是通過改變谷蛋白Zeta電位值而實現(xiàn)的。NaCl濃度由0 mol·L-1遞增至0.30 mol·L-1,Zeta電位由-14.4變?yōu)?5.61,表明離子在大米谷蛋白靜電相互作用中產(chǎn)生了電荷屏蔽效應(yīng)[19],使蛋白質(zhì)分子之間的吸引力大于排斥力,穩(wěn)定的分散體系被破壞,谷蛋白聚集發(fā)生。

圖4 NaCl對大米谷蛋白Zeta電位的影響Fig.4 Effect of NaCl on Zeta potentional of rice glutelin

2.5 表面疏水性變化

蛋白質(zhì)表面疏水性的大小取決于疏水基團在蛋白質(zhì)表面的暴露程度,表面疏水性對蛋白質(zhì)的溶解特性有很大影響[20],從而直接影響蛋白質(zhì)聚集。圖5表明,對照組谷蛋白的表面疏水指數(shù)H0為329.15,而經(jīng)過不同濃度NaCl處理后,谷蛋白的疏水性呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。當(dāng)NaCl為0.30 mol·L-1時,谷蛋白疏水性顯著增加至535.80。大米谷蛋白疏水性與溶解性變化趨勢相反,原因在于蛋白質(zhì)的溶解性與蛋白質(zhì)的親水性/疏水性的平衡有關(guān)[12]。Na+可通過靜電屏蔽效應(yīng),使得大米谷蛋白表面電勢降低,疏水性增強,從而使這種平衡關(guān)系被打破,導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集析出。隨著鹽離子濃度增加,特別是鹽離子濃度較高時,明顯擾亂了水分子的組織結(jié)構(gòu)以及水分子和蛋白質(zhì)之間的相互作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性增強,蛋白質(zhì)之間通過疏水相互作用而聚集。NaCl對乳清分離蛋白和β-乳球蛋白表面疏水性的影響不同于大米谷蛋白,無論熱處理與否或鹽濃度高低,乳清分離蛋白和β-乳球蛋白表面疏水性均無明顯變化[17]。

圖5 NaCl處理的大米谷蛋白表面疏水性Fig.5 Surface hydrohobicity of rice glutelin after NaCl treatment

2.6 內(nèi)源熒光變化

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來自色氨酸和酪氨酸殘基,其中色氨酸內(nèi)源熒光光譜對微環(huán)境的變化很敏感,其峰位一般在325～350 nm之間波動,蛋白質(zhì)分子和周圍溶劑或其它分子相互作用會導(dǎo)致其熒光發(fā)射光譜發(fā)生紅移或藍移,常用來探究蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象變化。當(dāng)生色基團周圍的微環(huán)境或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時也會導(dǎo)致熒光增強或猝滅。由圖6可知,與對照相比,NaCl共存時使谷蛋白熒光強度增加,表明相同條件下NaCl的存在可增加發(fā)色團的量子產(chǎn)率[21],其它金屬離子也有類似現(xiàn)象,如Zn2+對血紅蛋白有較強的熒光增強作用,Cu2+對血紅蛋白具有較強的熒光淬滅作用[22]。但當(dāng)NaCl濃度達到0.30 mol·L-1時,熒光強度明顯下降,這與該濃度下熱處理的谷蛋白發(fā)生聚集有關(guān),谷蛋白聚集引起蛋白質(zhì)濃度下降,因此熒光強度降低。另外,NaCl共存還使大米谷蛋白熒光光譜發(fā)生了藍移,說明在NaCl作用下,大米谷蛋白色氨酸周圍微環(huán)境的疏水性有所增強。NaCl趨向于其周圍的水分子,使蛋白質(zhì)表面自由水分子降低,使蛋白質(zhì)的水化層發(fā)生重排,疏水基團暴露程度增加,從而使蛋白質(zhì)表面疏水性增加[23]。各實驗結(jié)果相互印證,共同說明了大米谷蛋白分子表面的結(jié)構(gòu)特點及其在NaCl共存時的變化規(guī)律。

圖6 NaCl處理的大米谷蛋白內(nèi)源熒光光譜Fig.6 Endogenous fluorescence spectra of rice glutein treated by NaCl

樣品NaCl濃度(mol·L-1)00.050.100.150.30λmax(nm)348.4347.2346.6346345.6Fmax334375.3396.2440.2312.9

3 結(jié)論

在pH11.0的堿性水溶液環(huán)境中,大米谷蛋白依然是一個不穩(wěn)定體系,低鹽濃度即可促進其熱聚集。隨著鹽離子濃度的增加,熱處理的大米谷蛋白溶解度降低,濁度增大,尤其是鹽離子濃度較高時,這種現(xiàn)象尤為明顯,更易形成大分子聚集體。NaCl濃度高于0.15 mol·L-1時即可對大米谷蛋白微環(huán)境中的電荷產(chǎn)生屏蔽作用,對蛋白質(zhì)微環(huán)境的水化層形成破壞作用,蛋白質(zhì)表面疏水作用增強,分子間斥力減小,發(fā)生聚集。通過鹽離子效應(yīng)綜合分析,大米谷蛋白分子表面具有極強的疏水性,并且表面電荷數(shù)較少,因此在低鹽離子共存時,即可發(fā)生靜電屏蔽作用,導(dǎo)致的蛋白質(zhì)疏水作用增強,從而使大米谷蛋白聚集。

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Salteffectandmechanismsofthermalaggregationofriceglutelin

YUANJiang-lan,HUANGYa-ming,LIChuan-wen,KANGXu

(Academy of Bioengineering and Food,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

TS210.1

A

1002-0306(2017)18-0069-05

2017-02-28

袁江蘭(1970-)，女，博士研究生，副教授，研究方向：蛋白質(zhì)化學(xué)與工程，E-mail：jlyuan1229@163.com。

國家自然科學(xué)基金資助項目(31371741)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.014