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(河南工業(yè)大學,糧油食品學院,河南鄭州 450001)

大豆主要過敏原β-伴大豆球蛋白β亞基的抗原表位分析及分段克隆

皮江一,席俊*,賀夢雪,李爽

(河南工業(yè)大學,糧油食品學院,河南鄭州450001)

利用生物信息學軟件SWISS-MODEL對大豆主要過敏原β-伴大豆球蛋白β亞基建立出三級結構模型,并根據(jù)DiscoTope 2.0服務器預測出該模型的構象表位相關區(qū)段,采用分段克隆方式擴增目的基因的3個片段區(qū)域,利用PCR技術擴增目的基因全長及3個互相重疊的片段(A、B、C)將其連接至pMD18-T載體,并轉化到大腸桿菌感受態(tài)JM109。經藍白斑篩選,以及對重組質粒進行PCR和雙酶切驗證,測序結果與設計的基因序列一致,成功得到了目的基因片段的陽性克隆子,為β-伴大豆球蛋白β亞基分段表達及抗原區(qū)域位置的篩選與鑒定提供參考。

β-伴大豆球蛋白,β亞基,生物信息學,抗原位點,克隆

Abstract:The model of tertiary ofβ-conglycinin beta-subunit was constructed by the bioinformation tool SWISS-MODEL,and the conformational epitopes were predicted by DiscoTope 2.0 server. The overlapping fragments ofβ-conglycinin beta-subunit genes were amplified by PCR and inserted into pMD-18T vector,then preserved into competent cell ofEscherichiacoliJM109. The recombinant plasmids were evaluated by blue-white selection,PCR and double enzyme digestion,and DNA sequence analysis showed that the cloned sequence was the very fragment designed. The successful cloning of the genes can provide a reference for the study of the expresstion ofβ-conglycinin beta-subunit and screening of antigenic epitopes.

Keywords:β-conglycinin;beta-subunit;bioinformation;antigenic epitopes;clone

大豆素有“田中之肉”、“綠色牛乳”之稱,是優(yōu)質蛋白的重要來源。但同時也是八大食物過敏原之一[1-2],調查顯示世界上約有4%的人口對食物過敏,其中就有25%的人口對大豆過敏[3]。β-伴大豆球蛋白是7S球蛋白的主要成分,約占7S組分的85%,是重要的大豆貯藏蛋白,占大豆總球蛋白含量的30%以上[4]。且β-伴大豆球蛋白比大豆球蛋白表現(xiàn)出更強的抗原性[5]。β-伴大豆球蛋白分子質量約180 kDa,是由α′(72 kDa)、α(68 kDa)和β(52 kDa)三種亞基組成三聚體復合物,其含量分別為45%、35%和20%[6]。其中β亞基由416個氨基酸組成[7],不含人體必需氨基酸,且經研究表明β亞基同樣具有免疫學活性[8],是大豆蛋白的主要過敏原之一。

導致食物過敏的是能引起免疫反應的食物抗原分子。按照抗原蛋白質內部結構的不同可將其分為線型和構象型表位。目前,對抗原表位的研究多為B細胞構象型表位,由于蛋白質空間結構的復雜性,所以預測存在一定的局限。許多學者對此采取了多種研究方法進行探討,包括酶解產生多肽片段進行篩選方法、根據(jù)氨基酸序列設計重疊多肽并用單克隆抗體進行篩選的方法、噬菌體展示庫肽技術以及利用NMR分析和X射線等手段對抗原位點進行分析與研究等等[9-10]。但是這些方法工作量大,存在操作繁瑣及效率低等弊端。β-伴大豆球蛋白β亞基作為重要的大豆過敏原,目前國內研究主要集中在β-伴大豆球蛋白檢測分析、致敏性鑒定及脫敏技術研究等方面。Maruyama等[11]研究分析了重組大豆和天然大豆β-伴大豆球蛋白β亞基的晶體結構,衛(wèi)會君等[12]通過篩選289份具有多樣種子外觀性狀的大豆種質,發(fā)掘出具有β亞基缺失性狀的大豆。對于大豆過敏原表位的定位研究主要采用的是重疊多肽技術。而噬菌體展示技術具有操作簡單、成本低等優(yōu)勢。楊廷亞等[13]應用噬菌體展示技術篩選出血癥病毒抗原模擬表位。但是應用噬菌體展示技術對大豆過敏原表位定位的研究還未見報道。生物信息學與噬菌體展示技術作為一種新的過敏原表位預測和定位技術,具有操作簡單、成本相對較低等優(yōu)勢。在分析食物過敏抗原表位方面具有廣闊的應用前景[14]。

表1 β-伴大豆球蛋白β亞基基因分段引物Table 1 Primer for β-conglycinin beta-subunit gene segments

本研究利用生物信息學技術分析方法,運用SWISS-MODEL服務器及DiscoTope 2.0服務器構建β-伴大豆球蛋白β亞基蛋白三維晶體結構以及對抗原表位進行預測。利用PCR技術分別擴增β亞基基因片段,構建克隆載體,為研究利用噬菌體展示β-伴大豆球蛋白β亞基的分段表達及抗原表位的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-伴大豆球蛋白β亞基基因(1320 bp) 由上海生工生物工程股份有限公司合成并保存于PUC57載體質粒中;大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞、pMD18-T克隆質粒及限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ 大連寶生物公司;質粒小提試劑盒及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 康為世紀生物公司;X-Gal、IPTG及Ex-Taq DNA酶、基因分段引物 上海生工生物工程股份有限公司。

PCR儀 Eppendorf公司;瓊脂糖凝膠電泳儀、凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1β-伴大豆球蛋白β亞基氨基酸序列 通過NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫檢索到β-伴大豆球蛋白β亞基(LOC547465)的氨基酸序列:

1.2.2β-伴大豆球蛋白β亞基三級結構構建 登錄PDB(Protein Data Bank，蛋白質資料庫)數(shù)據(jù)庫檢索β-伴大豆球蛋白β亞基蛋白質,作為三級結構模板。登錄SWISS-MODEL服務器,選擇Alignment Mode模式,分別上傳β-伴大豆球蛋白β亞基的氨基酸序列,對β-伴大豆球蛋白β亞基的三級結構進行構建。

1.2.3β-伴大豆球蛋白β亞基的B細胞構象表位預測 根據(jù)β-伴大豆球蛋白β亞基三級結構模型,在DiscoTope 2.0服務器中預測其構象表位,并找出預測抗原區(qū)域主要位置。

1.2.4 引物設計 根據(jù)蛋白質三級結構及B細胞構象表位預測區(qū)段位置,本實驗將β-伴大豆球蛋白β亞基基因分為3段:A(73～600 bp),B(478～930 bp),C(808～1317 bp)。相鄰片段之間設置約120 bp重疊區(qū)域。引物設計利用primer 5.0軟件,依據(jù)結構:5′-保護堿基+酶切位點+引物配對區(qū)-3′,上游酶切位點設計為EcoRⅠ,下游為HindⅢ,且引物溶解溫度設計為58 ℃左右。具體見表1。

1.2.5β-伴大豆球蛋白β亞基基因的克隆及載體構建

1.2.5.1β-伴大豆球蛋白β亞基全長及片段A,B,C的擴增 使用PCR儀擴增目的基因片段,反應體系見表2。

表2 PCR反應體系Table 2 Reaction system for PCR

反應參數(shù):94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸90 s,共30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產物以2%瓊脂糖電泳檢查,將擴增片段分別命名為β亞基、A、B、C。

1.2.5.2 克隆載體的構建 DNA回收試劑盒將β-伴大豆球蛋白β亞基全長及片段A、B、C基因回收,具體參照試劑盒操作手冊。將片段與pMD18-T載體相連,16 ℃水浴過夜,反應體系為:pMD18-T vector 2.0 μL;DNA 3.0 μL;ligation 5.0 μL。用預冷槍頭吸取10 μL連接產物轉移至50 μL感受態(tài)細胞中,輕輕搖勻,置于冰上30 min,然后42 ℃水浴60～90 s,隨后在冰中冷卻5 min,最后加入900 μL 37 ℃預熱LB培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h。此時將50 μL x-gal(20 mg/mL)和13 μL IPTG(50 mg/mL)涂布含50 μg/mL氨芐青霉素(Amp+)的LB瓊脂平板上,37 ℃預熱0.5 h。吸取100 μL培養(yǎng)液吹打在預熱平板上,37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h。挑選白色菌落擴大培養(yǎng),用質粒小提試劑盒提取質粒。將重組質粒分別命名為pTβ、pTA、pTB、pTC。

1.2.5.3 重組質粒的鑒定 對重組質粒進行PCR和雙酶切鑒定,酶切體系為:重組質粒1.0 μL,10×M Buffer 5.0 mol/L,EcoRⅠ 1.0 μL,HindⅢ 1.0 μL,無菌超純水39.0 μL,總體系50.0 μL,混勻后37 ℃水浴4 h。PCR反應體系參照表2?；厥债a物用2%瓊脂糖凝膠分析初步鑒定后,送至TaKaRa測序。

2 結果與分析

2.1 β-伴大豆球蛋白β亞基蛋白的三級結構構建

通過PDB數(shù)據(jù)庫搜索到蛋白質三級結構模型(登錄號:1ipk.1.A),氨基酸序列相似度達到99.52%,模型即為蛋白質亞基結構。從得到的蛋白質三級結構圖(圖1)可以看出,有部分α-螺旋和β-轉角及無規(guī)則卷曲結構在蛋白質外側,絕大部分β-折疊在蛋白質中心區(qū)域。構象表位一般位于蛋白質表面的無規(guī)則卷曲等優(yōu)勢區(qū)域,一般認為α-螺旋、β-折疊常位于蛋白質內部化學鍵能較高處,其形態(tài)結構比較穩(wěn)定且受外界物理化學等因素影響較小。而β-轉角和無規(guī)則卷曲多位于蛋白質表面,容易與抗體嵌合,因而成為抗原表位的可能性大[15]。

圖1 β-伴大豆球蛋白β亞基蛋白的三級結構模型Fig.1 Model of tertiary structure of β-conglycinin beta-subunit

2.2 β-伴大豆球蛋白β亞基B細胞構象表位的預測

DiscoTope 2.0服務器根據(jù)建立的β-伴大豆球蛋白β亞基三級結構模型預測出了91個B細胞構象表位的氨基酸殘基。這91個氨基酸位于30個區(qū)段,分別為31、33、39～40、48～50、58、60～68、70、81～82、111～112、117、137～141、154～157、167、190、200～204、207、212、214～220、222～227、229～238、245～246、261～263、265、268～269、312～324、326、366～367、398、402、408。如圖2所示,預測的抗原表位絕大部分位于蛋白質模型的β轉角和無規(guī)則卷曲處。

圖2 β-伴大豆球蛋白β亞基部分抗原表位示意圖Fig.2 Sketch map of epitopes of β-conglycinin beta-subunit注:以上四組圖片為β亞基模型的不同視角。

2.3 基因的分段克隆及重組質粒構建

2.3.1 目的基因片段的克隆 將載體質粒PUC57中的目的基因經PCR擴增,得到全片段β亞基及分段片段A、B、C。擴增片段經瓊脂糖電泳顯示,可觀察到條帶大小與實驗預先設計的片段A、B、C長度相符,表明已正確擴增出目的片段,見圖3。

圖3 β亞基全片段及A,B,C基因擴增電泳圖Fig.3 Amplified electrophoresis of β-subunit and A,B,C bypass PCR注:M:DL1500Marker;1～4分別為β亞基全片段及片段A、B、C。

2.3.2 重組質粒構建及PCR、雙酶切鑒定 PCR擴增目的基因片段經切膠回收與pMD18-T載體相連,并轉化到JM109感受態(tài)細胞,挑取3個白色菌落進行擴大培養(yǎng),經PCR和雙酶切鑒定,如圖4、圖5的1、2、3、4泳道分別出現(xiàn)與β亞基全片段及片段A、B、C長度大小相符的條帶,表明重組質粒構建成功[16]。

圖4 重組質粒pTβ、pTA、pTB、pTC的PCR電泳圖Fig.4 Amplified electrophoresis of pTβ,pTA,pTB,PTC by PCR注：M:DL1500Marker;1～4分別為重組質粒pTβ、pTA、pTB、pTC。

圖5 重組質粒pTβ、pTA、pTB、pTC雙酶切電泳圖Fig.5 Electrophoresis of pTβ,pTA,pTB,pTC by double enzyme digestion注:M:DL1500Marker;1～4分別為重組質粒pTβ、pTA、pTB、pTC。

3 討論與結論

本研究利用生物信息學方法,對β-伴大豆球蛋白β亞基進行分段,克隆出β-伴大豆球蛋白β亞基基因及分段基因,并成功構建克隆載體。下一步,將利用T7噬菌體展示系統(tǒng)分別表達β亞基及片段,結合分子生物學、免疫學、生物信息學對β-伴大豆球蛋白β亞基過敏表位進行定位研究。對探明β-伴大豆球蛋白β亞基致敏性的分子機制、開展無過敏和低過敏的食品研究、防止食物過敏疾病的發(fā)生以及過敏性疾病的診斷提供了理論和實踐依據(jù)。

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Analysisofantigenicepitopesandcloningofsoybeanmajorallergenβ-conglycininbeta-subunit

PIJiang-yi,XIJun*,HEMeng-xue,LIShuang

(College of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)

TS201.6

A

1002-0306(2017)18-0090-04

2017-02-23

皮江一(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：食品免疫學，E-mail:577129671@qq.com。

*通訊作者:席俊(1977-)，女，博士，副教授，研究方向：食品免疫學，E-mail:Xijunhnu@163.com。

國家自然科學基金項目(31671778；31301409)；河南省高等學校重點科研項目(16A550001)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.018