王子朝， 吳劍榮， 朱 莉， 鄭志永， 高敏杰， 詹曉北

(1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 無錫 214122； 2. 江蘇瑞光生物科技有限公司， 無錫 214125)

XanthomonascampestrisCCTCC M2015714以甘油為底物發(fā)酵產(chǎn)黃原膠的性質(zhì)分析

王子朝1， 吳劍榮1， 朱 莉2， 鄭志永1， 高敏杰1， 詹曉北1

(1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 無錫 214122； 2. 江蘇瑞光生物科技有限公司， 無錫 214125)

主要研究以甘油為底物由XanthomonascampestrisCCTCC M2015714發(fā)酵合成的黃原膠，并分析黃原膠的特性。合成的黃原膠中含有葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸3種單糖，摩爾比為葡萄糖∶甘露糖∶葡萄糖醛酸=2.0∶1.65∶1.0。紅外光譜和核磁共振結(jié)果顯示：甘油產(chǎn)黃原膠的官能團(tuán)和化學(xué)結(jié)構(gòu)與商品級黃原膠基本一致。甘油產(chǎn)黃原膠的分子質(zhì)量 (3.0×106u) 約為商品級黃原膠的一半 (6.4×106u)，且其水溶液的黏度遠(yuǎn)低于商品級黃原膠。結(jié)果展示了甘油產(chǎn)黃原膠的優(yōu)良特性，同時(shí)為甘油的利用提供了一個(gè)有效途徑。

甘油；野油菜黃單胞菌；黃原膠；性質(zhì)分析

AbstractThis study focused on the xanthan gum produced byXanthomonascampestrisCCTCC M2015714 with carbon source of glycerol. The monosaccharide composition of xanthan gum was glucose, mannose and glucuronic acid, the molar ratio of three monosaccharides was glucose∶mannose∶glucuronic acid=2.0∶1.65∶1.0. The results of FT-IR and NMR showed that xanthan gum produced from glycerol had similar functional groups and chemical structure comparing with commercial xanthan. The molecular weight of xanthan gum produced using our method was 3.0×106u, which was about half of the commercial xanthan (6.4×106u). Moreover, the viscosity of xanthan gum produced from glycerol was significantly lower than that of the commercial xanthan. Depending on this work, xanthan gum produced from glycerol exhibited great characteristics and also supplied a valuable method for glycerol application.

Keywordsglycerol;Xanthomonascampestris; xanthan gum; characterization

黃原膠是被FDA和WHO公認(rèn)的安全、無添加量限制的食品添加劑。同時(shí)，良好的乳化性、懸浮性、增稠性和假塑性使其在食品、醫(yī)藥和石油開采等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1]。黃原膠在工業(yè)生產(chǎn)中一般采用玉米淀粉作碳源，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生產(chǎn)和研究也用蔗糖和葡萄糖做碳源。隨著全球人口的不斷增加，國內(nèi)外許多學(xué)者都在研究采用一些工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的副產(chǎn)物來代替玉米淀粉實(shí)現(xiàn)黃原膠的工業(yè)生產(chǎn)，如木糖、甘蔗糖漿、甜菜糖漿、乳清、脂肪酸和谷物水解物等[2]。

隨著全球能源危機(jī)加劇和環(huán)境惡化，人們努力尋找可以替代化石燃料的清潔能源。生物柴油的清潔、可再生和高燃點(diǎn)受到人們的廣泛好評，加上各國對生物柴油產(chǎn)業(yè)的政策扶持，生物柴油的產(chǎn)量越來越大。但是在生物柴油的轉(zhuǎn)脂化生產(chǎn)過程中，不可避免的會(huì)產(chǎn)生甘油這一副產(chǎn)物，且甘油的比例占生物柴油總量的10% (W/W)[4]。生物柴油的大量生產(chǎn)導(dǎo)致甘油的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其處理和回收利用的能力。

微生物可以利用甘油合成不同的發(fā)酵產(chǎn)品，且微生物轉(zhuǎn)化法具有條件溫和、簡單易操作的特點(diǎn)。已報(bào)道的以甘油為原料合成的發(fā)酵產(chǎn)物有1,3-丙二醇、酯類、有機(jī)酸、生物乙醇、異性蛋白和生物表面活性劑等[3]。如果可以使微生物利用甘油實(shí)現(xiàn)黃原膠的工業(yè)化生產(chǎn)，不僅可以緩解甘油過剩和全球糧食短缺雙重危機(jī)，還可以降低黃原膠的生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

XanthomonascampestrisCCTCC M2015714，由本研究室馴化得到并保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 材料與試劑

甘油、魚粉蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、NaOH、HCl、NaNO3、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、無水乙醇和三氟乙酸等試劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；商品級黃原膠 (食品級) 購于山東淄博中軒生化有限公司；葡萄糖、巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和用于測定分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品等均購于美國Sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

BioFlo 115 7 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，美國New Brunswich Scientific公司；Waters1525高效液相色譜儀，美國Waters公司；ICS-5000離子色譜儀，美國Dionex公司；Nexus 470傅立葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet公司；Agilent 800 MHz核磁共振系統(tǒng)，美國Agilent公司；MCR301旋轉(zhuǎn)流變儀，奧地利Anton Paar公司；數(shù)顯恒溫金屬浴，美國Boekel公司；FreeZone冷凍干燥機(jī)，美國Labconco公司。

1.4 培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件

1.4.1 培養(yǎng)基組成

種子培養(yǎng)基 (g/L): 甘油 20.0，魚粉蛋白胨 5.0，牛肉浸膏 3.0，酵母浸膏 1.0，pH 7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L): 甘油 40.0，魚粉蛋白胨 1.5，酵母浸膏 1.0，NaNO30.8，MgSO4·7H2O 2.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，K2HPO4·3H2O 3.5，KH2PO42.0，pH 7.0～7.2。

1.4.2 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)：500 mL三角瓶中加入50 mL種子培養(yǎng)基，接種1～2環(huán)斜面菌體，30 ℃、200 r/min旋轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)24 h。

7 L機(jī)械攪拌罐發(fā)酵：7 L發(fā)酵罐中裝4 L發(fā)酵培養(yǎng)基，10% (V/V) 接種量，培養(yǎng)溫度30 ℃；攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min；通氣量0.4 vvm；培養(yǎng)過程中用3 mol/L HCl和3 mol/L KOH調(diào)節(jié)pH維持在7.0左右。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 樣品的提取與純化

發(fā)酵結(jié)束后，向發(fā)酵液中加入3倍體積去離子水對發(fā)酵液進(jìn)行稀釋，20 000 r/min離心30 min除菌體。將離心得到的上清倒出并向其中加入3倍體積無水乙醇沉淀多糖。將醇沉析出的多糖分為兩部分進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)：一部分多糖在40℃、0.1 MPa下真空干燥48 h后研究這一多糖和商品級黃原膠的流變學(xué)特性。

另一部分醇沉析出的多糖重新溶于去離子水中，然后用sevage法去除可能殘存在多糖中的蛋白，商品級黃原膠采用上述同樣方法去除可能殘留的蛋白。之后，向sevage法處理后的多糖溶液中加入3倍體積無水乙醇析出多糖，將析出的多糖重新溶于水中并冷凍干燥用于測量它們的分子特性，包括單糖組成、紅外光譜、核磁共振及分子質(zhì)量。

1.5.2 單糖組成分析

準(zhǔn)確稱取多糖和商品級黃原膠各12 mg，放入兩支具塞試管中，分別加入18 mL、2 mol/L的三氟乙酸，塞好塞子之后放入金屬浴中110℃水解3 h，水解之后轉(zhuǎn)入楔形瓶中，用純水沖洗3次也轉(zhuǎn)入楔形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40℃減壓蒸干，之后再加入3 mL甲醇繼續(xù)蒸干，重復(fù)4～5次以帶走殘留的三氟乙酸，蒸干之后，用1 mL純水溶解并沖洗楔形瓶，并將溶液收集到2 mL離心管中，定容后采用離子色譜儀檢測單糖組成。Dionex ICS5000系統(tǒng)包括：GS50四元梯度泵；ED50A電化學(xué)檢測器(金電極)；LC30柱溫箱；Chromeleon 7.0色譜工作站和CarboPac PA20陰離子交換分析柱(150 mm×3 mm i.d.)。采用2 mmol/L的NaOH進(jìn)行淋洗，流速0.45 mL/min，淋洗時(shí)間120 min。采用三元梯度洗脫，流動(dòng)相A是去離子水，B是0.25 mol/L的NaOH，C是1 mol/L的醋酸鈉。洗脫程序 (A% B% C%): 0 min：99.2, 0.8, 0；30 min: 99.2, 0.8, 0；40 min: 79.2, 0.8, 20；40.1 min: 20, 80, 0；60 min: 99.2, 0.8, 0，流速0.45 mL/min。進(jìn)樣體積20 μL，Au電極，Ag/AgCl參比電極，脈沖安培檢測器。

1.5.3 紅外光譜分析

取大約1 mg多糖樣品與溴化鉀充分研磨并壓片，采用Nexus 470紅外光譜儀對多糖進(jìn)行紅外掃描，掃描波長范圍400～4000 cm-1，并用OMNIC-8.2軟件處理紅外數(shù)據(jù)。

1.5.41H核磁共振分析

將50 mg多糖樣品溶于0.5 mL D2O中，用Agilent 800 MHz的核磁共振儀進(jìn)行分析。以D2O作為內(nèi)標(biāo)物，樣品測試溫度35 ℃。

1.5.5 分子量測定

采用高效體積排阻色譜 (High-performance size exclusion chromatograph，HPSEC) 測定多糖的重均分子質(zhì)量(Weight-average molecular mass，MW)。儀器為Waters1525高效液相色譜儀，配有2414示差折光檢測器和Empower3工作站。色譜條件如下：UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mmid 二級串聯(lián)柱；流動(dòng)相0.1 mol/L NaNO3；流速0.9 mL/min；柱溫45℃；樣品制備：樣品溶于0.1 mol/L NaNO3中，用0.22 μm微孔濾膜過濾后供進(jìn)樣，進(jìn)樣體積20 μL。用MW分別為270、975、3680和13 535 ku的葡聚糖標(biāo)品繪制分子質(zhì)量校正曲線，根據(jù)樣品的保留時(shí)間和校正曲線計(jì)算多糖MW。

1.5.6 流變學(xué)特性分析

將多糖樣品溶于去離子水中配制成質(zhì)量濃度分別為0.1%、0.5%和1.0%的多糖溶液，室溫下磁力攪拌24 h后10 000 r/min離心30 min除去多糖溶液中的氣泡。采用安東帕Physica MCR301高級旋轉(zhuǎn)流變儀測量各溶液的流變學(xué)特性，測量溫度25℃。在測量每個(gè)樣品的黏度之前，先將樣品放到流變儀的樣品架上預(yù)停10 min，保證樣品在樣品架上分布均勻，同時(shí)使樣品的溫度達(dá)到測量溫度。剪切速率的掃描范圍是0.01～1000 1/S，采樣周期是8 s，每個(gè)樣品的采樣時(shí)間為10 min。樣品的稠度系數(shù) (K) 和流態(tài)特性指數(shù)(n)用儀器自帶的RheoPlus流變高級軟件進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 單糖組成分析

黃原膠在合成過程中，每一步都需要特殊的酶和前體物質(zhì)來完成，無論是前體物質(zhì)還是酶發(fā)生缺失，都會(huì)導(dǎo)致黃原膠的合成受阻而改變黃原膠的單糖組成和結(jié)構(gòu)[7]。Hassler和dohetry[8]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用X.campestris1361和X.campestris1419進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，得到的黃原膠其單糖組成和摩爾比為葡萄糖∶甘露糖∶葡萄糖醛酸=2.0∶1.0∶1.0；但當(dāng)發(fā)酵菌種為X.campestris1263和X.campestris1454時(shí)，這一值變?yōu)?.0∶1.0∶0。同時(shí)，Sutherland[5]發(fā)現(xiàn)，不同的野油菜黃單胞菌可以合成單糖組成和摩爾比相同的黃原膠。X.campestrisCCTCC M2015714以甘油為底物合成的黃原膠其單糖組成與摩爾比為2.0∶1.65∶1.0，這一值與商品級黃原膠十分相近 (2.0∶1.85∶1.0)。

2.2 紅外光譜分析

圖1中，3200～3500 cm-1的吸收峰是由-OH的軸向形變引起，對應(yīng)黃原膠中的羥基；2900 cm-1處的吸收峰是由-CH2的軸向形變引起；1600 cm-1處的吸收峰由丙酮酸鹽上的-C=O伸縮振動(dòng)引起；酯基、羧基、醛基和酮基的吸收峰在1700～1730 cm-1，而1700 cm-1處的吸收峰則對應(yīng)黃原膠側(cè)鏈上葡萄糖醛酸中的羧基。800～1500 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰最多，這些吸收峰是由官能團(tuán)的軸向形變和整個(gè)分子的伸縮振動(dòng)引起，對于辨別和區(qū)分兩種化合物十分重要。圖1中甘油產(chǎn)黃原膠的紅外掃描結(jié)果和商品級黃原膠一致，說明以甘油為底物發(fā)酵得到的多糖可能是黃原膠。Faria 等[9]研究甘蔗渣水解液發(fā)酵產(chǎn)黃原膠和Gunasekar 等[10]研究木薯淀粉酸解液發(fā)酵產(chǎn)黃原膠時(shí)得到了與我們相同的紅外掃描結(jié)果。

圖1 商品級黃原膠和甘油產(chǎn)黃原膠的紅外掃描結(jié)果

2.3 核磁共振分析

從圖2-a商品級黃原膠的1H核磁掃描結(jié)果可以看出，0 ppm的峰歸因于實(shí)驗(yàn)所用內(nèi)標(biāo)物D2O中的H；1.2 ppm左右的峰是由黃原膠側(cè)鏈上丙酮酸修飾基團(tuán)中的H所引起；黃原膠側(cè)鏈上乙?；蠬的吸收峰在1.8～1.9 ppm；在2.1～2.7 ppm之間的峰，是由糖醛或糖醛酸上-CH2中的H所引起，在黃原膠中對應(yīng)側(cè)鏈上的葡萄糖醛酸；羥基上H的吸收峰在3.4～3.9 ppm。從圖2-b可以看出，甘油產(chǎn)黃原膠的NMR吸收峰與商品級黃原膠基本吻合，加上單糖組成和紅外掃描結(jié)果，基本可以說明X.campestrisCCTCC M2015714以甘油為碳源發(fā)酵生產(chǎn)的多糖是黃原膠。這一結(jié)果與Sutherland[5]的報(bào)道一致，即野油菜黃單胞菌只能合成黃原膠這一種胞外多糖。

圖 2 商品級黃原膠(a)和甘油產(chǎn)黃原膠(b)的1H核磁結(jié)果

2.4 分子質(zhì)量測定

由圖3-a可知，商品級黃原膠的相對分子質(zhì)量約為6.4×106u，而以甘油為碳源發(fā)酵得到的黃原膠其分子量約為3.0×106u(圖3-b)，是商品級黃原膠的一半。一般來說，在微生物多糖的合成過程中，鏈的長短是由微生物體內(nèi)特殊的酶和基因進(jìn)行調(diào)控[11]。如Sanchez等[12]報(bào)道用不同的野油菜黃單胞菌可以得到分子質(zhì)量不同的黃原膠產(chǎn)品。此外，黃原膠分子質(zhì)量的大小還受培養(yǎng)基組成、發(fā)酵條件和提取條件的影響。當(dāng)培養(yǎng)基中添加木糖[13]或者培養(yǎng)基中氮源NH4Cl濃度發(fā)生變化[14]時(shí)，黃原膠的分子質(zhì)量發(fā)生變化；同時(shí)，培養(yǎng)過程中pH、攪拌轉(zhuǎn)速以及提取時(shí)發(fā)酵液溫度的變化都會(huì)影響到黃原膠的分子質(zhì)量[15]。X.campestrisCCTCC M2015714以甘油為碳源馴化得到，黃原膠分子質(zhì)量的減小可能與其體內(nèi)甘油代謝途徑相關(guān)酶的活性有關(guān)[16]。這一低分子質(zhì)量黃原膠對研究黃原膠的分子質(zhì)量與流變學(xué)、分子質(zhì)量與應(yīng)用十分有幫助。同時(shí)，對采用發(fā)酵法生產(chǎn)其他低分子質(zhì)量多糖具有一定指導(dǎo)意義。

2.5 流變學(xué)特性

一般來說，黃原膠的黏度與其分子質(zhì)量成正比，分子質(zhì)量大對應(yīng)的黏度大，反之則黏度較小[10]。由圖4可知，在低剪切速率時(shí)，1.0%和0.5% (W/V) 商品級黃原膠和甘油產(chǎn)黃原膠溶液的黏度隨剪切速率的增大而增大，對這一現(xiàn)象的解釋是Liu等[17]提出的“液體流動(dòng)引起的大分子聚集現(xiàn)象”理論。在高剪切速率下，黃原膠聚合體結(jié)構(gòu)解聚為無規(guī)則線團(tuán)結(jié)構(gòu)使黏度迅速降低。

圖3 商品級黃原膠(a)和甘油產(chǎn)黃原膠(b)的高效體積排阻色譜圖

圖4 商品級黃原膠(a)和甘油產(chǎn)黃原膠(b)的流變學(xué)特性

對于1.0%(W/V) 的兩種黃原膠溶液來說，甘油產(chǎn)黃原膠的稠度系數(shù)為1.7958，而商品級黃原膠的稠度系數(shù)則為21.0842，是甘油產(chǎn)黃原膠的10倍多，說明甘油產(chǎn)黃原膠的黏度明顯低于商品級黃原膠；甘油產(chǎn)黃原膠的流態(tài)特性指數(shù)為0.235，這一值比商品級黃原膠 (0.109) 的2倍還要大，說明甘油產(chǎn)黃原膠的剪切變稀能力不如商品級黃原膠。但甘油產(chǎn)黃原膠的流態(tài)特性指數(shù)n小于1.0，說明其仍是假塑性流體，在應(yīng)用時(shí)仍然具有假塑性流體的特性。黃原膠的黏度受酸、堿、鹽、溫度和分子質(zhì)量等眾多因素的影響，但從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，黃原膠是一個(gè)例外。低黏度黃原膠在一些工業(yè)和食品領(lǐng)域應(yīng)用極廣，如作為膳食纖維或者膳食纖維輔料，預(yù)防和治療糖尿病、高血壓、高血脂、肥胖等[18]。許多學(xué)者[19-20]采用超聲或者熱處理的方法降低黃原膠黏度，而本文通過發(fā)酵直接獲得一種低黏度黃原膠，既可以降低產(chǎn)品處理過程中的能耗，又能保證產(chǎn)品的安全性。

3 結(jié)論

通過單糖組成、紅外光譜和核磁共振分析，基本可以確定X.campestrisCCTCC M2015714以甘油為碳源發(fā)酵生產(chǎn)的胞外多糖是黃原膠。HPSEC結(jié)果顯示甘油產(chǎn)黃原膠的分子質(zhì)量僅為商品級黃原膠的一半。雖然甘油產(chǎn)黃原膠溶液的黏度明顯低于商品級黃原膠，但其仍表現(xiàn)出假塑性流體的特性。同時(shí)，較低的溶液黏度可以增加其在食品中的添加量，使其作為膳食纖維或者膳食纖維輔料。

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Characterization of xanthan gum produced from glycerol byXanthomonascampestrisCCTCCM2015714

WANGZi-chao1，WUJian-rong1，ZHULi2，ZHENGZhi-yong1，GAOMin-jie1，ZHANXiao-bei1

(1.School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122; 2.Jiangsu Ruiguang Biotech Co. Ltd., Wuxi 214125, China)

TQ920.6

A

2095-1736(2017)05-0015-05

2016-08-26；

2016-09-05

國家自然科學(xué)基金 (31171640)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目 (JUSRP51632A，JUSRP51504)

王子朝，博士，主要從事微生物多糖的發(fā)酵生產(chǎn)及應(yīng)用研究，E-mail: 6832917@163.com

詹曉北，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事高黏度反應(yīng)器和微生物多糖的研究，E-mail:xbzhan@yahoo.com

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.05.015