李靜+韓書華

摘要利用熒光素（Fluorescein）對(duì)羅丹明6G（Rhodamine 6G）進(jìn)行修飾，得到熒光分子探針R6GFlu雜化物。此探針可特異性識(shí)別Al3+，檢出限可低至10

Symbolm@@ 8 mol/L級(jí)； 向含有探針分子的溶液中加入Al3+后，溶液的顏色由無色變?yōu)榉凵?，并且在紫外燈下發(fā)出綠色熒光，可實(shí)現(xiàn)肉眼對(duì)10 μmol/L Al3+的定性檢測。考察了不同pH值下R6GFlu的熒光性質(zhì)。 結(jié)果表明，此探針還可用于酸性范圍（pH 3.00～6.00）和堿性范圍（pH 8.00～10.50）內(nèi)pH值的精確檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，R6GFlu是一種可用于Al3+和pH值檢測的雙功能熒光分子探針。

關(guān)鍵詞雙功能； 熒光分子探針； pH值檢測； Al3+； 羅丹明衍生物

1引 言

目前使用的熒光分子探針，能夠?qū)崟r(shí)、原位地檢測對(duì)環(huán)境和生命過程有重要作用的pH值、分子和離子等，并且已經(jīng)廣泛應(yīng)用于溶液環(huán)境下的檢測和細(xì)胞成像等領(lǐng)域[1～3]。熒光分子探針通過特異性識(shí)別微觀環(huán)境中的目標(biāo)檢測物，具有選擇性高、靈敏度高和檢出限低等特點(diǎn)[4，5]。羅丹明染料的光物理性質(zhì)優(yōu)良，量子產(chǎn)率高，光穩(wěn)定性強(qiáng)，易于被修飾，得到對(duì)金屬離子有選擇性響應(yīng)的熒光分子探針[6～8]。羅丹明衍生物傳感機(jī)理是被分析物質(zhì)能夠引起其中的螺環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生“關(guān)開”轉(zhuǎn)變，相應(yīng)地?zé)晒獍l(fā)生“關(guān)開”的變化。螺環(huán)形式的探針溶液為無色溶液，無熒光發(fā)射； 開環(huán)形式的探針溶液變?yōu)橛猩芤?，并且有較強(qiáng)的熒光發(fā)射，因此羅丹明衍生物可分別通過溶液顏色的改變和熒光發(fā)射光譜的測定，實(shí)現(xiàn)對(duì)某特定物質(zhì)的肉眼定性檢測和定量檢測。

羅丹明衍生物對(duì)環(huán)境pH值的改變有靈敏的響應(yīng)。在堿性條件下，它保持螺環(huán)形式，無熒光發(fā)射； 但在酸性環(huán)境中有較強(qiáng)的熒光發(fā)射[9，10]。相反，熒光素（Fluorescein）在堿性條件下保持開環(huán)形式，發(fā)出熒光； 但在酸性條件下螺環(huán)關(guān)閉，無熒光發(fā)射[11，12]。本研究根據(jù)二者對(duì)pH值的敏感特性，以及羅丹明衍生物可用于金屬離子檢測的性質(zhì)[13～15]，利用熒光素對(duì)羅丹明6G（Rhodamine 6G）進(jìn)行修飾，得到一種新型熒光分子探針R6GFlu雜化物。此熒光分子探針中含有兩個(gè)內(nèi)酰胺的螺環(huán)結(jié)構(gòu)，分別對(duì)應(yīng)二者的熒光分子結(jié)構(gòu)。它既可用于環(huán)境pH值的響應(yīng)，還可用于Al3+的傳感，與文獻(xiàn)[13～15]報(bào)導(dǎo)的方法相比，R6GFlu對(duì)Al3+的選擇性更高，檢出限更低。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

AVANCE300核磁共振波譜儀（300 M， 瑞士Bruker公司）； U4100紫外可見近紅外分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）； LS55熒光磷光發(fā)光分光光度計(jì)（美國PerkinElmer公司）； PHS3C pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）。

羅丹明6G（日本TCI公司）； 水合肼（80%）、NaOH（分析純）（天津登科化學(xué)試劑有限公司）； 乙二醛（40 wt%水溶液，阿拉?。?； 熒光素（90%，分析純，阿拉?。?乙腈（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、冰乙酸（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）； 磷酸（分析純，萊陽市康德化工有限公司）； 硼酸（分析純，天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠）。金屬離子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Ni2+、Cu2+、Pb2+、Cd2+、Co2+、Hg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cr3+、Al3+）的原液0.01 mol/L）采用其相應(yīng)的氯鹽進(jìn)行配制，Ag+（0.01 mol/L）原液采用AgNO3配制。BrittonRobinson緩沖溶液由磷酸、硼酸和冰乙酸配制，并用NaOH（0.2 mol/L）溶液在酸度計(jì)上調(diào)至所需pH值。所有試劑未進(jìn)一步純化，直接使用。

2.2化合物的合成與表征

熒光分子探針R6GFlu的合成路線如圖1所示。其中所有化合物的鑒定均通過1H NMR進(jìn)行了表征判斷。

2.2.1化合物1的合成與表征化合物1的合成與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的方法相同。將羅丹明6G（9.58 g， 0.02 mol）溶解于300 mL乙醇中； 室溫下充分?jǐn)嚢?。?7 mL水合肼（0.76 mol）逐滴滴加到上述溶液中，滴加完畢后升溫至80℃回流。2 h后，溶液中羅丹明6G的熒光消失。冷卻，過濾，所得固體用乙醇洗滌數(shù)次。干燥， 得到粉色固體7.06 g（產(chǎn)率82.0%）。1H NMR表征結(jié)果：δH（300 MHz，DMSOd6， Me4Si） 1.20（6H，t，CH3）； 1.87（6H，s，ArCH3）； 3.08～3.17（4H，m，ArNHCH2）； 4.22（2H，s，NH2）； 5.00（2H，t，ArNH）； 6.09（2H，s，ArH）； 6.26（2H，s，ArH）； 6.91～6.94（1H，m，ArH）； 7.44～7.47（2H，m，ArH）； 7.74～7.77（1H，m，ArH）。

2.2.2化合物2的合成與表征將化合物1（3.00 g，6.99 mmol）溶解于乙醇/二氯甲烷（2∶3，V/V）混合溶劑中。在N2氛圍下，將上述溶液逐滴滴加于乙二醛（19.86 mL，174.75 mmol）的乙醇溶液中（濃度為2.92 mol/L），在室溫下反應(yīng)12 h。反應(yīng)完畢后， 減壓旋蒸， 除去大部分溶劑，剩余少量溶劑，加入30 mL乙醇，即析出大量黃色固體。過濾，使用乙醇充分洗滌，干燥后得到黃色固體2.63 g（產(chǎn)率80.2%）。1H NMR表征結(jié)果： δH（300 MHz，DMSOd6，Me4Si）1.20（6H，t，CH3）； 1.85（6H，s，ArCH3）； 3.09～3.18（4H，m，ArNHCH2）； 5.16（2H，t，ArNH）； 6.18（2H，s，ArH）； 6.31（2H，s，ArH）； 7.02～7.04（1H，d，ArH）； 7.28～7.28（1H，d，ArH）； 7.57～7.69（2H，m，ArH）； 7.98～8.00（1H，d，NCH）； 9.23～9.26（1H，d，CHO）。δH 4.22（NH2）處峰的消失和δH 7.98（NCH）與δH 9.23（CHO）處峰的出現(xiàn)，表明化合物2被成功合成。endprint

2.2.3化合物3的合成與表征化合物3的合成采用文獻(xiàn)[17]報(bào)道的方法。將熒光素（7.00 g，18.95 mmol）分散于300 mL乙醇中，得到橙色懸濁液。向上述懸濁液中加入過量水合肼（37 mL，0.76 mol），加熱回流12 h，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，懸浮顆粒逐漸消失，最終得到暗紅色澄清透明溶液。減壓旋蒸至剩余少許溶劑，加入200 mL去離子水，析出淡黃色固體，靜置3 h后，過濾，用去離子水和乙醇交替洗滌數(shù)次，干燥后得到淡黃色粉末6.15 g（產(chǎn)率93.7%）。1H NMR表征結(jié)果：δH（300 MHz，DMSOd6，Me4Si）4.37（2H，s，NH2）； 6.38～6.47（4H，m，ArH）； 6.58～6.59（2H，d，ArH）； 6.97～7.00（1H，m， ArH）； 7.45～7.52（2H，m，ArH）； 7.76～7.79（1H，m，ArH）； 9.62（2H，s，ArOH）。

2.2.4熒光分子探針R6GFlu的合成與表征將化合物2（1.20 g，2.55 mmol）溶解于200 mL氯仿中，化合物3（1.04 g，3 mmol）溶解于100 mL乙醇中，二者混合，加熱到80℃，回流12 h，反應(yīng)結(jié)束后為橙色澄清透明溶液，減壓旋蒸，剩少許溶劑時(shí)加入100 mL乙醇，析出橙黃色固體，過濾，濾餅用乙醇洗滌，直至濾液變?yōu)闊o色透明。干燥后得到橙色粉末1.59 g（產(chǎn)率78.0%）。1H NMR表征結(jié)果： δH（300 MHz， DMSOd6，Me4Si）1.17～1.24（6H，m，CH3）； 1.76～1.85（6H，m，ArCH3）； 3.09～3.18（4H，m，ArNHCH2）； 5.03～5.06（2H，t，ArNH）； 6.09（2H，s，ArH）； 6.30～6.31（2H，d，ArH）； 6.38～6.44（4H，m，ArH）； 6.64～6.65（2H，d，ArH）； 6.91～7.00（2H，m，ArH）； 7.47～7.60（4H，m，ArH）； 7.74～7.77（1H，m，NCH）； 7.87～7.90（3H，m，2ArH + NCH）； 9.95（1H，s，ArOH）。

2.3紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的測定

2.3.1R6GFlu對(duì)金屬離子選擇響應(yīng)性的探究R6GFlu母液（1 mmol/L）用乙腈配制； 向R6GFlu的乙腈溶液中分別加入不同的金屬離子（Ag+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Ni2+、Cu2+、Pb2+、Cd2+、Co2+、Hg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cr3+和Al3+），R6GFlu和金屬離子的最終濃度分別為1.0 μmol/L和10 μmol/L。放置2 h后進(jìn)行測試，以保證探針分子和金屬離子的充分絡(luò)合。

2.3.2不同濃度Al3+存在下體系的紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的測定保持R6GFlu濃度為10 μmol/L， Al3+濃度從1.0 μmol/L增加到15 μmol/L。紫外可見吸收光譜的測試在光程為1 cm的石英比色池中進(jìn)行； 熒光發(fā)射光譜的采集采用500 nm為激發(fā)波長，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別為6.0 nm和2.5 nm。

2.3.3不同pH值下R6GFlu熒光發(fā)射光譜的測定配制BrittonRobinson緩沖溶液，用0.20 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值，使溶液的pH值在3.00～10.50之間，再向其中加入0.1 mmol/L R6GFlu。

2.4熒光分子探針R6GFlu對(duì)Al3+檢出限的確定

檢出限（Limit of detection，LOD）由公式（1）[18]計(jì)算求得：

LOD=3σbim（1）

其中， σbi是空白溶液測量（即不加金屬離子時(shí)）的標(biāo)準(zhǔn)偏差。m是信號(hào)強(qiáng)度與Al3+濃度（[Al3+]）線性關(guān)系圖的斜率。在本實(shí)驗(yàn)中，測定了20個(gè)R6GFlu溶液的光譜，得到空白測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差σbi； 根據(jù)2.3節(jié)所測定的不同濃度Al3+存在下體系的紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜數(shù)據(jù)，作528 nm處吸光度和554 nm處熒光強(qiáng)度與[Al3+]的線性關(guān)系圖，得到斜率m， 計(jì)算出檢出限。

2.5結(jié)合常數(shù)的確定

Al3+與R6GFlu的結(jié)合常數(shù)通過BenesiHildebrand（BH）方程（2）[19]計(jì)算：

1F-F0=1{Ka×（Fmax-F0）×[Al3+]}（2）

其中， F為不同濃度Al3+存在下所測得的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)max和F0分別為Al3+濃度最大和無Al3+時(shí)的熒光強(qiáng)度，[Al3+]為與F相對(duì)應(yīng)的Al3+濃度，測試方法按照2.3節(jié)進(jìn)行。

2.6Al3+與R6GFlu的配合物的摩爾吸光系數(shù)（ε）和熒光量子產(chǎn)率（）的確定

摩爾吸光系數(shù)根據(jù)朗伯比爾定律A=εbc確定，本實(shí)驗(yàn)A為528 nm處的吸光度，光程b為1 cm，c為Al3+R6GFlu配合物的濃度。

熒光量子產(chǎn)率由公式（3）確定[20，21]：

x=n2xn2s·FxAsFsAx（3）

其中，、n、F和A分別為物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率、所采用溶劑的折射率、最大吸收波長激發(fā)下測得的熒光積分面積和最大吸收波長處的吸光度； x為待測物， s為標(biāo)準(zhǔn)物。本實(shí)驗(yàn)中溶劑均采用乙醇； 標(biāo)準(zhǔn)物選用羅丹明B，s=0.89。

3結(jié)果與討論

3.1熒光分子探針R6GFlu對(duì)金屬離子的響應(yīng)特性

3.1.1R6GFlu對(duì)Al3+選擇響應(yīng)性

首先研究了R6GFlu的光譜性質(zhì)，如圖2所示。R6GFlu在可見光區(qū)無吸收峰（圖2A插圖），也無熒光發(fā)射峰（圖2B），說明此時(shí)它是以螺環(huán)形式存在。當(dāng)加入不同金屬離子后，Al3+會(huì)引起R6GFlu的光譜發(fā)生明顯變化，528 nm處出現(xiàn)了的新吸收峰， 554 nm處出現(xiàn)熒光發(fā)射峰。Cr3+也可引起相似的光譜變化，但其變化程度遠(yuǎn)小于Al3+。其它金屬離子均未引起光譜的顯著變化，因此可以認(rèn)為該探針能夠優(yōu)先識(shí)別Al3+。endprint

向R6GFlu溶液中加入混合金屬離子（Al3+和另一種干擾離子）后，與僅含Al3+的體系相比，其吸收峰和熒光發(fā)射峰強(qiáng)度均沒有顯著的變化（相對(duì)誤差分別為2.6%和1.6%），表明R6GFlu對(duì)其它的共存干擾離子有較好的耐受性。

3.1.2不同濃度Al3+存在下體系的紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜不同濃度Al3+存在時(shí)體系的紫外可見吸收光譜如圖3A插圖所示，528 nm處的吸收峰可歸屬為Al3+與R6GFlu形成的配合物，在此配合物中，羅丹明部分螺環(huán)結(jié)構(gòu)處于“開環(huán)”狀態(tài)，

該吸收峰的強(qiáng)度隨著Al3+濃度的增加而線性增強(qiáng)（圖3A）。通過朗伯比爾定律可確定配合物溶液的摩爾吸光系數(shù)ε= 6180 m2/mol。

熒光發(fā)射光譜也表現(xiàn)出相似的變化趨勢（圖3B），隨Al3+濃度的不斷增加，554 nm處熒光發(fā)射峰持續(xù)增強(qiáng)。當(dāng)加入15 μmol/L Al3+時(shí)，熒光強(qiáng)度值達(dá)到最大。此探針對(duì)Al3+的線性檢測范圍為1.0～15.0 μmol/L。

紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜空白測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.0017和0.2095。分別利用圖3A和3B中線性關(guān)系圖的斜率，根據(jù)公式（1）求得檢出限分別為6.67×10

此外，當(dāng)向10 μmol/L R6GFlu中加入等濃度Al3+后，溶液發(fā)生顯著變化，由無色變?yōu)榉凵?，在紫外燈?65 nm）照射下，發(fā)出綠色熒光（圖4）。此現(xiàn)象說明R6GFlu可用于低至10 μmol/L Al3+的肉眼識(shí)別。因此，R6GFlu可通過顏色和光譜雙信號(hào)的改變，分別實(shí)現(xiàn)對(duì)Al3+的定性與定量的檢測。

3.1.3R6GFlu與Al3+結(jié)合常數(shù)的確定根據(jù)BenesiHilderbrand （BH） 方程繪制工作曲線（見圖5），由此可計(jì)算出R6GFlu和Al3+的結(jié)合常數(shù)K=2.81×104 L/mol。

3.2熒光分子探針R6GFlu對(duì)pH的響應(yīng)性質(zhì)

不同pH值下R6GFlu的熒光發(fā)射光譜如圖6插圖所示。在pH 3.00～6.00范圍內(nèi)， R6GFlu表現(xiàn)出羅丹明6G部分的熒光發(fā)射峰（541 nm），并且熒光強(qiáng)度隨著pH值的降低而線性增強(qiáng)，在pH 8.00～10.50范圍內(nèi)，此分子呈現(xiàn)出熒光素部分的熒光發(fā)射峰（524 nm），其強(qiáng)度隨著pH值的增加也呈線性增強(qiáng)。據(jù)此可繪制出pH 3.00～6.00和pH 8.00～10.50的工作曲線（圖6），從而實(shí)現(xiàn)在相應(yīng)范圍內(nèi)的pH值檢測。R6GFlu 對(duì)pH值傳感機(jī)理如圖7所示，在酸性環(huán)境下，R6GFlu分子中的羅

丹明部分質(zhì)子化造成螺環(huán)結(jié)構(gòu)的開環(huán)； 在堿性條件下， 此分子的熒光素部分上的酚羥基的解離造成其螺環(huán)結(jié)構(gòu)的開環(huán)。

4結(jié) 論

熒光分子探針R6GFlu可選擇性識(shí)別Al3+，并且具有較低的檢出限和良好的選擇性，還可通過直觀的溶液顏色改變實(shí)現(xiàn)對(duì)Al3+肉眼定性識(shí)別； 此探針對(duì)pH值具有高度敏感性，可對(duì)小范圍變化的pH值進(jìn)行精確測定。因此，R6GFlu是一種雙功能的熒光分子探針，可以作為檢測微環(huán)境中Al3+和pH值改變的有力工具。

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Bifunctional Fluorescence Molecular Probes for

Detection of Aluminum and pH

LI Jing， HAN ShuHua*

（School of Chemistry and Chemical Engineering， Shandong University， Jinan 250100， China）

AbstractA fluorescent molecular probe R6GFlu was prepared by modifying fluorescein onto Rhodamine 6G. The probe could be used to recognize Al3+ specifically， and the detection limit could reach as low as 10-8 mol/L. After addition of Al3+ （10 μmol/L） to the probe， the solution showed a color change from colorless to pink， and green fluorescence was observed under the UV irradiation， which could be perceived by the naked eye. By measuring the fluorescence emission intensity of R6GFlu at different pH， the probe could also be used to determine pH in acidic pH range （3.00-6.00） and basic pH range （8.00-10.50）. The detection results of Al3+ and pH indicated that the R6GFlu was a dualfunctional fluorescent molecular probe.

KeywordsBifunctional； Fluorescence molecular probe； pH detection； Aluminum； Rhodamine derivatives

（Received 2 March 2017； accepted 23 June 2017）endprint