陳聰，黃春宇，李玉葉，余姝毅，陳偉洪，林升來，杜晨陽，莫美蘭

(深圳市中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳 518043)

反復(fù)種植失敗患者與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者分泌期子宮內(nèi)膜自然殺傷細胞數(shù)量分析

陳聰，黃春宇，李玉葉，余姝毅，陳偉洪，林升來，杜晨陽，莫美蘭*

(深圳市中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳 518043)

目的研究子宮內(nèi)膜自然殺傷細胞(uNK)在反復(fù)種植失敗(RIF)患者與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RM)患者分泌期子宮內(nèi)膜的表達情況。方法選取2013年3月至2016年10月于本院生殖醫(yī)學助孕中心的RIF患者(20例)和RM患者(35例)，對照25例。于患者尿LH試紙檢測峰值出現(xiàn)后第7～9天，利用子宮內(nèi)膜取樣器刮取少量子宮腔內(nèi)膜組織；根據(jù)子宮內(nèi)膜形態(tài)學Noyes標準，確定RIF患者組(n=20)、RM患者組(n=35)與對照組(男性因素不孕患者，n=25)子宮內(nèi)膜分期；以CD56作為uNK的表面標記物，免疫組化技術(shù)檢測3組患者分泌期子宮內(nèi)膜CD56陽性細胞的數(shù)量，并利用Vectra?自動病理成像定量分析系統(tǒng)計算細胞陽性細胞率。結(jié)果3組患者內(nèi)膜形態(tài)學分期均有早、中、晚分泌期病例；RIF組與RM組患者分泌期子宮內(nèi)膜CD56陽性細胞率[分別為(17.59±12.59)%、(16.54±11.37)%]顯著高于對照組[(8.01±7.19)%](P<0.01)；3組患者子宮內(nèi)膜CD56陽性細胞率從分泌早期到分泌晚期均呈顯著遞增趨勢(P<0.05)；RIF組與RM組分泌早期、中期及晚期CD56陽性細胞率均顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)論 RIF與RM患者子宮內(nèi)膜分泌早、中、晚期uNK細胞數(shù)量異常升高，提示其可能影響子宮內(nèi)膜容受性，從而導(dǎo)致妊娠失敗。

反復(fù)種植失?。?復(fù)發(fā)性流產(chǎn)； 子宮內(nèi)膜自然殺傷細胞； CD56

Objective： To investigate the natural killer cells(uNK)levels in endomitrium of secretory phase in the patients with repeated implantation failure(RIF)or recurrent miscarriage(RM).

Methods： Endometrial samples were obtained with an endometrial curette from 7thday to 9thafter the LH surge.Endometrial stage was determined according to the Noyes standard of endometrial morphology.The number of CD56 positive cells in endometrial biopsies was detected by immunohistochemical technique with CD56 as the surface marker of uNK in 25 normal control women whose infertility caused by male factors，20 women with RIF and 35 women with RM.The percentage of CD56+cells were analyzed by Vectra?automatic pathological imaging quantitative analysis system.

Results： According to the Noyes standard of endometrial morphology，the endometrium in early-，mid-，late- secretory phase were confirmed in the patients of three groups.The percentage of uterine CD56+cells in secretory phase in RIF group [(17.59±12.59)%] or RM group [(16.54±11.37)%] was significantly higher than that in the control group[(8.01±7.19)%](P<0.01).The percentage of CD56+cells was gradually increased through the early-，mid- to late- secretory phase in all three groups(P<0.05).The percentage of CD56+cells in women with RM and RIF were significantly higher than that in normal control women in each phase(P<0.05).

Conclusions： The abnormal increase of uNK number in endometrium of early-，mid-，late- secretory phase in patients with RIF and RM may affect the endometrial receptivity，thus lead to pregnancy failure.

Keywords： Repeated implantation failure； Recurrent miscarriage； uNK cells； CD56

(JReprodMed2017，26(10)：1016-1021)

反復(fù)種植失敗(RIF)和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RM)的病因多而且復(fù)雜，是生殖醫(yī)學領(lǐng)域待解決的難題。近年來，隨著生殖免疫的發(fā)展，人們逐漸認識到免疫因素在RIF和RM發(fā)病中的作用，越來越多的免疫機制被揭示，提示免疫因素在胚胎的種植以及妊娠的維持中扮演著重要角色。文獻報道，多數(shù)反復(fù)妊娠失敗與母胎界面免疫系統(tǒng)的失衡相關(guān)[1-2]。因此，分泌期母胎界面免疫微環(huán)境與子宮內(nèi)膜容受性的研究越來越重要。子宮自然殺傷(uNK)細胞是胚胎植入前子宮內(nèi)膜和早孕期蛻膜中數(shù)量最多的一類免疫細胞，特征表型是CD56+CD16-。uNK細胞隨月經(jīng)周期變化而變化，增殖期較低，而分泌中期其比例迅速上升，并在早孕期達高峰，隨著妊娠的進展又逐漸下降，直到分娩后恢復(fù)到月經(jīng)期水平[3-4]。胎兒的滋養(yǎng)層細胞侵入母體蛻膜后與uNK細胞相互作用。正常妊娠狀態(tài)下，uNK細胞分泌一系列細胞因子和血管生長因子，調(diào)控滋養(yǎng)層細胞入侵并參與子宮螺旋動脈的重塑，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性，參與胚胎種植[5-6]；近年來，uNK細胞已經(jīng)引起了廣泛學者的關(guān)注，研究表明，其數(shù)量與功能的異?？赡苁欠磸?fù)妊娠失敗的重要因素[6-8]。本研究通過免疫組化技術(shù)檢測RIF、RM患者與正常對照組分泌早、中、晚期uNK陽性細胞率，探討uNK細胞與反復(fù)妊娠失敗的關(guān)系。

材料與方法

一、研究對象

2013年3月至2016年10月期間于本院生殖醫(yī)學助孕中心接受治療的患者作為研究對象。

納入標準：(1)符合RIF定義(經(jīng)歷3個或3個以上取卵周期，且每個周期均有優(yōu)質(zhì)胚胎移植或多次移植的胚胎數(shù)量≥10個，仍妊娠失敗者)或RM定義(經(jīng)歷連續(xù)2次或2次以上的孕20周前自然流產(chǎn)的患者)；(2)月經(jīng)周期規(guī)律(周期26～31 d)；(3)夫婦雙方外周血染色體核型正常。

排除標準：(1)女方生殖解剖結(jié)構(gòu)異常；(2)女方基礎(chǔ)內(nèi)分泌異常；(3)女方患自身免疫性疾病；(4)女方凝血功能異常；(5)急性感染期；(6)納入研究前3個月內(nèi)曾接受過激素治療。

并募集同期因男方因素(無精癥、少精癥、畸精癥)所致不孕而進行第一周期IVF-ET且成功分娩活嬰的自愿者作為對照組(Ctrl組)。

共納入80例患者，其中RIF患者20例，RM患者35例，Ctrl組患者25例。所有入選患者均簽署了知情同意書，實驗流程獲得醫(yī)院學術(shù)與倫理學委員會許可。

二、研究方法

1.內(nèi)膜標本收集：自月經(jīng)周期第10天起，試紙監(jiān)測尿LH水平，于LH峰值出現(xiàn)后第7～9天，利用子宮內(nèi)膜取樣器刮取少量子宮腔內(nèi)膜組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗去除組織表面血污，于10%中性福爾馬林固定液中固定4～6 h。組織常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟及包埋。

2.免疫組化檢測方法及結(jié)果判定：包埋子宮內(nèi)膜組織作4 μm厚度切片，常規(guī)脫蠟，3%過氧化氫15 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶，5%胎牛血清封閉20 min阻斷非特異性染色。EDTA抗原修復(fù)液微波加熱處理后，鼠抗人CD56(Dako Cytomation，丹麥)抗體工作液37 ℃孵育1 h。以PBS代替一抗作為陰性對照，扁桃體作為陽性對照。滴加兔、鼠通用二抗(Dako Cytomation，丹麥)，37 ℃孵育30 min。滴加 DAB工作液(Dako Cytomation，丹麥)顯色，待顯色至棕黃色時終止。蘇木素復(fù)染，氨水返藍，梯度酒精脫水，樹膠封片。

Vectra?自動病理成像定量分析系統(tǒng)(Perkin Elmer，美國)定量分析CD56陽性細胞率，操作流程參考文獻[9]所述。納入被組織覆蓋面積超過80%的圖像，陽性細胞率定義為DAB陽性細胞數(shù)/子宮內(nèi)膜總細胞數(shù)×100%。

3.性激素水平測定：月經(jīng)第2～3天收集患者外周血，采用羅氏電化學發(fā)光儀(Cobas e601，Roche，瑞士)檢測血清FSH、E2、孕酮(P)及LH水平，所用配套試劑盒均購于瑞士Roche公司。

4.子宮內(nèi)膜形態(tài)學分期：常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，根據(jù)Noyes標準，光鏡顯微鏡下確定子宮內(nèi)膜分期。

三、統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布資料以均數(shù)±標準差表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù))表示。正態(tài)分布數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，非正態(tài)分布資料比較采用Mann-Whitney U檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、患者一般資料

本項研究共納入80例研究對象，其中RIF組20例，RM組35例，Ctrl組25例?；颊吣挲g27～40歲，平均(32.63±2.60)歲。3組患者間年齡、體重指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)激素值(FSH、E2、P、LH)圴無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 3組患者一般資料比較(-±s)

注：△資料呈非正態(tài)分布，表達為中位數(shù)(下四分位數(shù)-上四分位數(shù))[M(QL-QU)]

二、子宮內(nèi)膜HE染色分期結(jié)果

根據(jù)Noyes子宮內(nèi)膜形態(tài)學分期標準，分泌期早期子宮內(nèi)膜腺體管腔擴張、出現(xiàn)明顯核空泡，間質(zhì)局部水腫；分泌期中期，腺體更擴張、腺上皮細胞呈明顯的頂部分泌大泡，但沒有核下空泡，間質(zhì)水腫明顯，間質(zhì)細胞呈裸核狀，螺旋小動脈明顯可見；分泌期晚期腺體呈明顯“鋸齒”狀，腺體細胞胞漿腫脹，突入管腔，間質(zhì)從致密到松散，“小動脈珠”可見(圖1)。本研究納入的三組患者中，分期情況分別是：RIF組患者(早期6例、中期8例、晚期6例)，RM組患者(早期9例、中期17例、晚期9例)，Ctrl組患者(早期7例、中期14例、晚期4例)。

三、各組患者分泌期子宮內(nèi)膜CD56陽性細胞率比較

CD56陽性信號分布在子宮內(nèi)膜間質(zhì)中，集中分布在血管和腺體周圍，以胞膜或胞質(zhì)著色(圖2)。分泌期(包括早、中、晚期)Ctrl組uNK陽性細胞率(8.01±7.19)%，顯著低于RIF組[(17.59±12.59)%]及RM組[(16.54±11.37)%](P<0.01)。

A：分泌早期；B：分泌中期；C：分泌晚期圖1 子宮內(nèi)膜HE染色分期情況 HE染色 ×200

各圖中右上角圖像為相應(yīng)區(qū)域的放大圖(×400)圖2 CD56陽性細胞在3組患者分泌期子宮內(nèi)膜中的定位及分布 免疫組化染色 ×200

四、各組患者分泌期各期子宮內(nèi)膜CD56陽性細胞率比較

本研究進一步將RIF/RM組與Ctrl組患者分泌早、中、晚期子宮內(nèi)膜CD56陽性細胞率分別進行了比較。結(jié)果顯示，RM組分泌早期CD56陽性細胞率均顯著高于Ctrl組(P<0.05)，而RIF組較對照組有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；RIF組與RM組分泌中、晚期CD56陽性細胞率均顯著高于Ctrl組(P<0.05)(表2，圖3)

另外，本項研究還對各組組內(nèi)分泌各期子宮內(nèi)膜CD56陽性細胞率進行了比較。結(jié)果表明，3組患者子宮內(nèi)膜CD56陽性細胞率從分泌早期到分泌晚期均呈遞增趨勢，并具有顯著差異性(P<0.05)(表2、圖4)。

早、中、晚分別示分泌早期、中期和晚期；相互比較，*P<0.05圖3 3組患者分泌各期CD56陽性細胞率組間比較

表2 3組患者分泌早、中、晚期子宮內(nèi)膜CD56陽性細胞率(%)

注：與同期Ctrl組比較，*P<0.05；組內(nèi)各期之間比較，#P<0.05

早、中、晚分別示分泌早期、中期和晚期；相互比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖4 3組患者分泌各期CD56陽性細胞率組內(nèi)比較

討 論

在正常規(guī)律的月經(jīng)周期中，排卵后6～8 d，即LH峰出現(xiàn)后7～9 d黃體發(fā)育達到高峰期，因此一般將LH+7～9 d判斷為分泌中期。然而，子宮內(nèi)膜的形態(tài)是否真正發(fā)育到分泌中期，仍需進一步通過組織學染色進行確認。本研究中，3組人群均在LH+7～9 d在本中心進行子宮內(nèi)膜活檢，然后通過HE染色鑒別和分析子宮內(nèi)膜的形態(tài)。結(jié)果顯示僅有部分患者子宮內(nèi)膜處于分泌中期，其中RIF組患者處于分泌早期6例、中期8例、晚期6例；RM組患者處于分泌早期9例、中期17例、晚期9例；Ctrl組患者處于分泌早期7例、中期14例、晚期4例。這一數(shù)據(jù)提示通過LH+7～9 d判別子宮內(nèi)膜處于分泌中期，存在偏差。推測可能與個體體內(nèi)激素水平、子宮內(nèi)膜相關(guān)受體數(shù)量及排卵時間不同有關(guān)。因此，對于黃體分期的判斷，應(yīng)結(jié)合子宮內(nèi)膜的形態(tài)學情況加以分析。

胎兒是攜帶父方基因的同種異體抗原組織，在正常妊娠中，卻沒有受到母體免疫系統(tǒng)攻擊而存活并直至分娩，這一過程與母胎界面的免疫微環(huán)境平衡息息相關(guān)。子宮內(nèi)膜作為胚胎植入與生長的土壤，和外周血一樣，存在著各種不同的免疫細胞群，其數(shù)量及功能有著周期性的變化。uNK細胞是胚胎植入前內(nèi)膜和早孕期蛻膜中數(shù)量最多的一類免疫細胞[10]，其不受人類白細胞抗原(HLA)的限制，就能對抗原進行識別，即能殺滅一些腫瘤細胞和感染細胞。uNK細胞分泌各種細胞因子和血管生成因子，如：粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、集落刺激因子(CSF-1)、白細胞抑制因子(LIF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、干擾素(IFN-γ)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等，對內(nèi)膜血管生成和胚胎植入起積極作用，對子宮內(nèi)膜容受性發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，其數(shù)量和功能的失衡可能引起胚胎著床失敗和流產(chǎn)[11-12]。

在正常月經(jīng)周期中，增生期uNK細胞占子宮內(nèi)膜淋巴細胞的比例較低，到分泌中期迅速增加；而在妊娠狀態(tài)下，uNK數(shù)量在孕早期達到峰值，隨后開始下降。在本研究人群中，育齡女性分泌期uNK占內(nèi)膜總細胞的8%左右，而妊娠失敗患者(包括RIF和RM)uNK所占比例較高，約為17%左右；進一步對分泌早、中、晚期uNK的數(shù)量進行分析，發(fā)現(xiàn)RM組分泌早期uNK數(shù)量顯著高于Ctrl組；RIF組、RM組分泌中、晚期uNK的數(shù)量均顯著高于Ctrl組，即RIF、RM患者uNK細胞在分泌早、中、晚期的各階段均表達異常，與已發(fā)表文獻數(shù)據(jù)一致[13-14]。Clifford等[13]的研究表明，反復(fù)早期妊娠丟失患者uNK細胞水平明顯高于正常對照；Tuckerman等[14]研究了RIF患者LH+7～9 d子宮內(nèi)膜CD56+、CD16+和CD69+細胞的水平，結(jié)果表明，RIF患者CD56+細胞水平顯著高于對照組，而CD16+和CD69+細胞沒有顯著差異。這些研究和我們的數(shù)據(jù)均提示，RIF和RM患者子宮內(nèi)膜uNK數(shù)量比例發(fā)生失調(diào)，其可能打破了子宮內(nèi)膜免疫微環(huán)境的平衡，影響子宮內(nèi)膜容受性，從而導(dǎo)致了反復(fù)妊娠失敗的發(fā)生。

妊娠期間，uNK細胞的主要功能是參與子宮螺旋動脈的重新構(gòu)建，并通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞侵入生長而促使胎盤形成[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠早期，胎兒絨毛外滋養(yǎng)層細胞(EVT)和uNK細胞的相互作用有助于蛻膜動脈血管的重塑，以保證為胎兒提供足夠的血容量[16-17]。胎兒滋養(yǎng)層細胞可分泌可溶性的HLA-G(sG)，sG通過與uNK的受體KIR2DL4識別后經(jīng)內(nèi)吞作用而被內(nèi)體吞噬，從而引起持續(xù)性的促炎和促血管生成反應(yīng)，進一步促使血管重構(gòu)[18]。同時，由于uNK細胞能夠與胎兒滋養(yǎng)層細胞直接作用，一旦子宮內(nèi)局部環(huán)境改變或者發(fā)生炎癥反應(yīng)，uNK細胞的比例將會失調(diào)，此時uNK可能從保護性作用轉(zhuǎn)化為毒性殺傷作用，亦可能成為致使胚胎遭受攻擊的主要因素；而過高的uNK可使內(nèi)膜血管形成增多，過早過快形成母胎循環(huán)，胚胎植入時形成了過量的氧化應(yīng)激，或影響子宮內(nèi)膜細胞因子的平衡，最終導(dǎo)致著床失敗。既往研究證實了妊娠失敗患者子宮內(nèi)膜有較高uNK數(shù)量，提示在臨床上可對uNK細胞數(shù)量過高的患者進行免疫干預(yù)。文獻報道，強的松龍治療能下調(diào)RIF患者uNK細胞的水平，并顯著提高成功率[19]。我們中心的數(shù)據(jù)也表明，對uNK細胞數(shù)量過高的患者進行干預(yù)，uNK細胞數(shù)量降低后，妊娠成功率明顯提高(未公開發(fā)表)。

綜上所述，uNK細胞是分泌期和早孕期較多的一類免疫細胞，分泌多種細胞因子和血管生長因子，調(diào)控著內(nèi)膜螺旋動脈的重塑和滋養(yǎng)層細胞的侵入。我們的數(shù)據(jù)顯示了分泌早、中、晚期RIF和RM患者uNK細胞數(shù)量發(fā)生異常。但是，uNK細胞除了主要特征表型CD56brightCD16-外，還存在其它表型，如CD56dimCD16+[20]，其在功能及基因表達上與CD56brightCD16-型uNK細胞存在很大的不同。CD56dimCD16+型uNK細胞通過釋放胞內(nèi)殺傷性物質(zhì)(穿孔素、顆粒酶等)，來發(fā)揮細胞毒性殺傷作用，或通過抗體依賴性細胞毒性作用(ADCC)來殺傷目標細胞[21]；而本研究中采用的是免疫組化單染技術(shù)，只分析了子宮內(nèi)膜CD56+型uNK細胞，并未闡明各種類型uNK細胞數(shù)量、功能與妊娠的關(guān)系。另外，本項研究納入的樣本量較少，因此，擬在后續(xù)研究中，在加大樣本量的同時，采用流式細胞術(shù)對uNK細胞表型進一步分類及胞內(nèi)殺傷性物質(zhì)(如穿孔素、顆粒酶等)進行檢測，分析uNK細胞在妊娠期以及生殖失敗患者中的功能及其可能的作用機制。

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[編輯：羅宏志]

Quantitativeanalysisofnaturalkillercellsinendometriumofsecretoryphaseinwomenwithrepeatedimplantationfailureorrecurrentmiscarriage

CHENCong，HUANGChun-yu，LIYu-ye，YUShu-yi，CHENWei-hong，LINSheng-lai，DUChen-yang，MOMei-lan*

ReproductiveCenterofShenzhenZhongshanUrologicalHospital，Shenzhen518043

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.10.012

2017-04-02；

2017-05-30

深圳市科創(chuàng)委基礎(chǔ)研究項目(JCYJ20150402165325178)，中華醫(yī)學會臨床醫(yī)學科研專項資金-生殖醫(yī)學青年醫(yī)師研究與發(fā)展項目(16020200636)

陳聰，男，廣東茂名人，本科，檢驗技師(初)，醫(yī)學檢驗專業(yè).(*

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