陳俊+葉錦霞+林潔+林婧+林秋祥+劉獻(xiàn)祥+吳廣文

【摘 要】目的：觀察獨(dú)活寄生湯含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠退變軟骨細(xì)胞表達(dá)miRNA-140的影響，探討?yīng)毣罴纳鷾乐喂顷P(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法：4周齡SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨建立體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，采用Ⅱ型膠原原位雜交法對(duì)第3代（F3）軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。用10 ng·mL-1白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)F3軟骨細(xì)胞，復(fù)制退變軟骨細(xì)胞模型。成功后隨機(jī)分為模型組和獨(dú)活寄生湯含藥血清組，分別在培養(yǎng)24，48，72 h后采用TaqMan real-time PCR法檢測(cè)各組miRNA-140表達(dá)。結(jié)果：獨(dú)活寄生湯含藥血清組

miRNA-140相對(duì)表達(dá)量隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論：獨(dú)活寄生湯治療骨關(guān)節(jié)炎的部分作用機(jī)制是有效促進(jìn)退變軟骨細(xì)胞miRNA-140的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；獨(dú)活寄生湯；含藥血清；軟骨細(xì)胞；miRNA-140

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）屬中醫(yī)學(xué)“痿證”“痹證”“骨痹”范疇，肝腎虧虛致其虛為病之內(nèi)因，風(fēng)寒濕邪致其痹為病之外因，故本質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)、本痿標(biāo)痹[1]。獨(dú)活寄生湯出自唐·孫思邈《備急千金要方》，具有扶正祛邪、標(biāo)本兼顧的特點(diǎn)，能針對(duì)OA的病因病機(jī)起治療作用，能有效緩解膝OA的臨床癥狀[2-3]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，獨(dú)活寄生湯能有效促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖[4-5]，抑制軟骨細(xì)胞凋亡[6]，延緩軟骨退變[7]，但其作用機(jī)制尚未完全明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察獨(dú)活寄生湯含藥血清對(duì)白細(xì)胞介素（IL）-1β誘導(dǎo)的退變軟骨細(xì)胞表達(dá)miRNA-140的影響，進(jìn)一步探討?yīng)毣罴纳鷾委烵A的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 獨(dú)活寄生湯由獨(dú)活9 g，桑寄生、秦艽、杜仲、防風(fēng)各6 g等組成，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院藥劑科提供。使用時(shí)用蒸餾水1 L，煎煮2次，每次煎1 h，將2次藥液合并，濃縮成1 g·mL-1，保存在-20 ℃冰箱中，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量（250±10）g；4周齡SD大鼠10只，體質(zhì)量（100±10）g，均購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心具備清潔級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施，許可證號(hào)：SYXK（閩）2014-0006。

1.3 試劑和儀器 胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco公司）；IL-1β細(xì)胞因子（美國(guó)Peprotech公司）；DMEM低糖培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）；兔抗大鼠Ⅱ型膠原抗體，大鼠IgG二抗，免疫組化試劑盒（北京中杉金橋試劑公司）；提取試劑盒mirVana? miRNA Isolation Kit（美國(guó)Thermo Scientific公司）；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific公司）；TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑，探針標(biāo)記的miRNA-140（引物系列：CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG）、U6（引物系列：AGCCTCAAGATCATCAGCAATGCCTC）及PCR mastermix（美國(guó)Invitrogen公司）；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光

定量PCR儀（Applied Biosystems公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Heraeus公司）；熒光倒置顯微鏡（徠卡儀器公司）；超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器公司）。

2 方 法

2.1 獨(dú)活寄生湯含藥血清的制備 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將24只2月齡SD大鼠隨機(jī)分為空白血清組與含藥血清組，每組12只。給藥劑量參照藥理實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算[8]，含藥血清組大鼠給予4.65 g·kg-1·d-1獨(dú)活寄生湯灌胃，早晚各1次；空白血清組大鼠給予每日

2次4.65 mL·kg-1·d-1生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃7 d，最后一天連續(xù)2次灌胃，中間間隔2 h。采血前禁食12 h，2 h后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%水合氯醛麻醉下腹主動(dòng)脈采血。將所得全血在37 ℃恒溫水浴箱中靜置30 min后，離心機(jī)3000 r·min-1離心15 min，取上清于56 ℃水浴鍋中滅活30 min，0.22 μm一次性針頭濾器過(guò)濾，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 軟骨細(xì)胞的培養(yǎng) 將4周齡SD大鼠，用體積分?jǐn)?shù)為750 mL·L-1的乙醇浸泡后，分離雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，帶入無(wú)菌操作臺(tái)，取脛骨平臺(tái)和股骨下端的軟骨，剪成1 mm3大小，轉(zhuǎn)移入盛有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%Ⅱ型膠原酶的培養(yǎng)瓶，37 ℃恒溫水浴搖床上消化2 h，取上清液，200目尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾，離心機(jī)1000 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基（含青霉素、鏈霉素各100 U·mL-1）重懸細(xì)胞，封口放置。原消化瓶中再加入Ⅱ型膠原酶5 mL，重復(fù)以上步驟2次，獲取細(xì)胞懸液。把3次消化所得的軟骨細(xì)胞懸液混勻，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105·mL-1，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加5 mL，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)（F0），待瓶底鋪滿80%后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，依次標(biāo)記為第1代軟骨細(xì)胞（F1），第2代軟骨細(xì)胞（F2），第3代軟骨細(xì)胞（F3）。

2.3 退變軟骨細(xì)胞模型的復(fù)制及鑒定 F3軟骨細(xì)胞以1×105·mL-1的濃度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，用含10 ng·mL-1 IL-1β無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)

24 h復(fù)制退變軟骨細(xì)胞模型[9]。同時(shí)運(yùn)用倒置顯微鏡觀察，免疫組化等方法鑒定退變軟骨細(xì)胞。免疫組化方法參照SABC免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，簡(jiǎn)要步驟如下：取出預(yù)先置于25 cm2培養(yǎng)瓶底部的蓋玻片，多聚甲醛固定15 min；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的H2O2孵育10 min；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Triton X-100 PBS液37 ℃孵育30 min；37 ℃血清封閉10 min。一抗37 ℃溫育1 h；PBS液清洗5 min，3次；二抗37 ℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)脂封片，光鏡觀察。endprint

2.4 TaqMan real-time PCR檢測(cè)各組退變軟骨細(xì)胞miRNA-140表達(dá) 將退變軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為模型組（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的空白血清+ DMEM低糖培養(yǎng)基）和獨(dú)活寄生湯組（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的獨(dú)活寄生湯含藥血清+ DMEM低糖培養(yǎng)基）。2組細(xì)胞分別培養(yǎng)24，48，72 h后，棄培養(yǎng)液，PBS輕柔淋洗1 min，用胰酶消化后離心機(jī)1000 r·min-1低速離心5 min，收集細(xì)胞。Trizol法提取總RNA，取2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板行TaqMan real-time PCR擴(kuò)增miRNA-140及U6。探針標(biāo)記的miRNA-140和U6均由Applied Biosystems合成。擴(kuò)增反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，5 ℃ 10 min；92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行基因表達(dá)的差異分析，以U6表達(dá)為內(nèi)參照基因，檢測(cè)待測(cè)樣品中目的基因的表達(dá)水平，以對(duì)照組數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)樣本，各實(shí)驗(yàn)組為待測(cè)樣品，比較待測(cè)樣本相對(duì)校準(zhǔn)樣本的表達(dá)差異。因?qū)崟r(shí)PCR對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析需要特殊的公式、假設(shè)以及對(duì)這些假設(shè)的驗(yàn)證。2-ΔΔCt方法可用于計(jì)算定量PCR實(shí)驗(yàn)基因表達(dá)的相對(duì)變化，2-ΔΔCt公式的推導(dǎo)，以及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，有效性評(píng)估在Applied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中均有介紹，且用2-ΔΔCt方法分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)在文獻(xiàn)中已有報(bào)道[10-11]。故本實(shí)驗(yàn)采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-140基因相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用One-Way ANOVA方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程 剛接種的軟骨細(xì)胞圓形通亮，懸浮于培養(yǎng)液中，24 h后開(kāi)始貼壁，36 h后更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第8天，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%，呈不規(guī)則立體“鋪路石”樣外觀（F0）。傳代培養(yǎng)后可見(jiàn)F1～F3軟骨細(xì)胞增殖速度快，形態(tài)規(guī)則、大小均勻。見(jiàn)圖1。

3.2 IL-1β誘導(dǎo)大鼠退變軟骨細(xì)胞模型鑒定 光鏡下可見(jiàn)經(jīng)過(guò)無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基+ 10 ng·mL-1 IL-1β誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞呈多邊形改變，可見(jiàn)少量指狀突起，體積增大，折光度下降；胞核增大染色變淺，胞膜和胞漿不清晰，細(xì)胞增殖速度減慢。Ⅱ型膠原免疫組化結(jié)果：用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的正常軟骨細(xì)胞胞漿染色較深，經(jīng)過(guò)無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基+ 10 ng·mL-1 IL-1β誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞胞漿染色變淺，胞核不染色。見(jiàn)圖2。

3.3 獨(dú)活寄生湯含藥血清對(duì)退變軟骨細(xì)胞表達(dá)miRNA-140的影響 獨(dú)活寄生湯組miRNA-140表達(dá)量隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，干預(yù)24，48，72 h后分別為1.2651±0.095，1.6324±0.0534，1.9772±0.0146，各時(shí)間點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖3。

4 討 論

軟骨退變是OA最主要的病理變化，圍繞保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨以防治OA成為治療的關(guān)鍵。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，OA屬于“痿證”“痹證”范疇，其核心病機(jī)為本痿標(biāo)痹，因此筆者提出以補(bǔ)腎柔肝（治痿）為主，輔以活血祛風(fēng)（治痹）作為治療OA的根本大法[12-13]。在獨(dú)活寄生湯組方中，獨(dú)活長(zhǎng)于祛下焦風(fēng)寒濕邪，蠲痹止痛，為君藥。秦艽、防風(fēng)祛風(fēng)勝濕；肉桂溫里祛寒，通利血脈；細(xì)辛祛寒止痛，均為臣藥。佐以桑寄生、杜仲、牛膝、芍藥補(bǔ)腎柔肝，強(qiáng)壯筋骨；當(dāng)歸、川芎、干地黃養(yǎng)血活血；人參、茯苓補(bǔ)氣健脾。甘草擅治四肢拘攣，緩急止痛，更具調(diào)和諸藥為使藥。諸藥合用，共奏補(bǔ)肝腎、益氣血、祛風(fēng)濕、止痹痛之效，能針對(duì)OA的病因病機(jī)起治療作用，長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床，療效顯著[2-3]。

軟骨退變作為啟動(dòng)OA病變進(jìn)程的重要病理變化一直受到研究者的關(guān)注。本課題組采用退變軟骨細(xì)胞作為OA體外研究的細(xì)胞模型，在前期實(shí)驗(yàn)中，筆者采用Ⅱ型膠原酶消化法獲取原代軟骨細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)剛接種的軟骨細(xì)胞圓形通亮，懸浮于培養(yǎng)液中，24 h后開(kāi)始貼壁，36 h后更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第8天，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%，呈不規(guī)則立體“鋪路石”樣外觀。傳代培養(yǎng)后可見(jiàn)F1～F3軟骨細(xì)胞增殖速度快，形態(tài)規(guī)則、大小均勻。此細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程與筆者前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[14-15]。IL-lβ在OA發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，是最重要的致炎因子之一[16]，其主要通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）途徑加速軟骨基質(zhì)中蛋白多糖和Ⅱ型膠原的降解，抑制二者的合成，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡[17]，同時(shí)還可以誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的產(chǎn)生并增強(qiáng)其功能，進(jìn)一步加速軟骨退變進(jìn)程[18]，引導(dǎo)軟骨降解并最終導(dǎo)致OA形成[19]。因此，有學(xué)者在體外實(shí)驗(yàn)中也運(yùn)用IL-lβ誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞，成功復(fù)制退變軟骨細(xì)胞模型[20]。結(jié)合Sanchez等[21]的既往研究，本研究將10 ng·mL-1作為IL-1β誘導(dǎo)濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞呈多邊形改變，邊緣可見(jiàn)少量指狀突起，體積增大，折光度下降；胞核增大染色變淺，胞膜和胞漿不清晰，細(xì)胞增殖速度減慢。

Ⅱ型膠原免疫組化染色也顯示IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞胞漿染色變淺，胞核不染色。該鑒定結(jié)果與前期研究結(jié)果一致[22]，也進(jìn)一步證實(shí)IL-lβ誘導(dǎo)復(fù)制退變軟骨細(xì)胞模型的可行性，也為本實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

miRNA是非編碼蛋白的RNA分子，由20～22個(gè)核苷酸組成，能夠通過(guò)對(duì)信使RNA的負(fù)性調(diào)節(jié)從而調(diào)控人類基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，成熟的miRNA在物種進(jìn)化過(guò)程中相當(dāng)保守，其轉(zhuǎn)錄過(guò)程具有嚴(yán)格的時(shí)空特異性[23-24]。miRNA-140特異性表達(dá)于軟骨組織中，隨著軟骨細(xì)胞分化成熟其表達(dá)量逐漸增加，是維持軟骨組織分化、成熟、形態(tài)和功能最重要的miRNA之一[25]。研究表明，miRNA-140高表達(dá)可顯著抑制IL-1β產(chǎn)生[26-27]。endprint

Miyaki等[26]通過(guò)miRNA-140基因敲除小鼠模型的觀察，發(fā)現(xiàn)基因缺陷小鼠四肢短小、顱面畸形，關(guān)節(jié)軟骨在幼齡即出現(xiàn)蛋白多糖的丟失和細(xì)胞外基質(zhì)的降解從而出現(xiàn)OA樣改變。而過(guò)表達(dá)miRNA-140的小鼠則能夠抵抗引起OA的各種因素，預(yù)防OA的發(fā)生。Karlsen等[28]通過(guò)研究體外誘導(dǎo)出miRNA-140高表達(dá)的軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miRNA-140可從多種途徑延緩OA的發(fā)展：

miRNA-140可降低炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-8的表達(dá)，減輕OA軟骨組織的炎癥反應(yīng)；增加軟骨保護(hù)性蛋白SOX9、ACAN和CSGALNACT1的水平；下調(diào)ADAMTS5引起的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，并提高其抑制劑SDC4的水平。進(jìn)一步驗(yàn)證了miRNA-140在軟骨細(xì)胞的修復(fù)過(guò)程中的重要意義（P < 0.05），為關(guān)節(jié)軟骨再生機(jī)制提供了一種新的見(jiàn)解，有潛在的治療意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，獨(dú)活寄生湯含藥血清組miRNA-140相對(duì)表達(dá)量隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，在24，48，72 h分別為1.2651±0.095，.6324±0.0534，1.9772±0.0146，各時(shí)間點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），表明獨(dú)活寄生湯含藥血清能增加退變軟骨細(xì)胞中miRNA-140的表達(dá)。由此推測(cè)獨(dú)活寄生湯治療膝OA的可能分子機(jī)制是通過(guò)增加

miRNA-140表達(dá)，進(jìn)而降低IL-1β和ADAMTS-5表達(dá)，減輕炎癥對(duì)軟骨組織的刺激，對(duì)OA起防治作用，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

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