魏 寧，候震坤，謝景興，劉兆軍，楊公社，龐衛(wèi)軍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

ε-聚賴氨酸對關(guān)中黑豬精液常溫保存效果研究

魏 寧，候震坤，謝景興，劉兆軍，楊公社，龐衛(wèi)軍*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

欄目協(xié)辦

試驗通過對在常溫保存的關(guān)中黑豬精液中添加ε-聚賴氨酸效果的研究，探究新的減少稀釋液中抗生素使用的可能性。向稀釋后的精液中分別添加0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 g/L的ε-聚賴氨酸，檢測其保存1～5 d的精液質(zhì)量。結(jié)果表明：ε-聚賴氨酸在濃度為0.04～0.64 g/L不會影響精液滲透壓，添加ε-聚賴氨酸可以提高關(guān)中黑豬精液的保存效果，其中最適濃度為0.16 g/L。

ε-聚賴氨酸；公豬精液；常溫保存

由于采精不可能在無菌條件下操作，精液不可避免地會受到來自周圍環(huán)境如空氣、糞便、尿液等中細菌的污染，故能從精液中檢測出細菌。相關(guān)研究表明，污染精液的細菌主要是革蘭氏陰性菌，其中以腸桿菌科菌為主，且精液中細菌的濃度一般為104～105cfu/mL[1]。精液中的細菌會降低精子的品質(zhì)，影響母豬的繁殖成績[2]。

目前，主要通過在稀釋液中添加抗生素來抑制精液中的細菌生長。然而，由于近年來抗生素在畜牧業(yè)中的濫用導(dǎo)致許多抗藥性細菌的產(chǎn)生，使得添加在稀釋液中的抗生素效果大大降低。一份報告表明，某公豬站中的公豬精液由于受到對慶大霉素具有耐藥性的粘質(zhì)沙雷氏菌污染，精液在常溫保存36～48 h后發(fā)生大量的凝集，精子的運動能力顯著降低[3]。若繼續(xù)在精液中添加常規(guī)抗生素，則可能會使精液中耐藥性細菌定向感染母豬。因此，尋找新的抗菌物質(zhì)完全替代或部分替代傳統(tǒng)抗生素是解決這一問題的主要方法之一。

ε-聚賴氨酸（ε-PL）是一種天然的陽離子抗菌肽，ε-PL的特點是對人體無毒無害，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在高溫下仍然具有抗菌活性，易溶于水[4]，故ε-PL對于環(huán)境幾乎不會造成任何影響[5]。由于ε-PL具有安全無害，抗菌廣譜和可被生物降解等特點。目前該物質(zhì)已經(jīng)被廣泛用于食品、工業(yè)、醫(yī)療等領(lǐng)域。在美國和日本，已允許在食品中添加ε-PL。本實驗室過去通過體外抑菌試驗已知ε-聚賴氨酸擁有一定的抑菌能力，并可以替代一定量的抗生素。本試驗在關(guān)中黑豬精液中添加不同濃度ε-PL，探究其對關(guān)中黑豬精液的影響，為其在關(guān)中黑豬精液常溫保存的使用提供實踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 關(guān)中黑豬精液精液來源于西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧生產(chǎn)實踐基地成年健康關(guān)中黑豬公豬。使用BTS液進行稀釋，試驗組分別添加 0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 g/Lε-聚賴氨酸，放入17℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

異硫氰酸熒光素-花生凝集素（FITC-PNA），羅丹明(Rh123)，碘化丙啶(PI)。

1.1.3 儀器

CASA（計算機精子輔助分析儀），滲透壓測定儀，無菌操作臺，17℃恒溫培養(yǎng)箱，熒光顯微鏡，37℃恒溫水浴鍋等。

1.2 方法

1.2.1 精液滲透壓的測定

使用滲透壓測定儀進行滲透壓檢測。

1.2.2 不同時間段中精液中菌落數(shù)的測定

根據(jù)常溫保存的時間段，將精液用無菌水稀釋至合理的倍數(shù)。取100 μL稀釋后的精液均勻涂抹于LB固體培養(yǎng)基表面，而后倒置放37℃恒溫培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)12 h。計數(shù)不同稀釋倍數(shù)下培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)（每個平板上以30～300個菌落為宜），乘以相應(yīng)的倍數(shù)即為對應(yīng)精液中細菌的個數(shù)。

1.2.3 精子活率的測定

取出關(guān)中黑豬精液，將精液輕輕搖勻，取200 μL公豬精液置于1.5 mL的離心管中，放37℃水浴鍋中孵育4 min，并將蓋玻片和載玻片放37℃恒溫載物臺上預(yù)熱。使用精子計算機輔助分析系統(tǒng)（CASA）檢測精子活率。分別記下3個視野下精子的活率，取其平均值。

1.2.4 精子質(zhì)膜完整性的測定

按檸檬酸鈉7.35 g/L，果糖13.5 g/L配制檸檬酸鈉-果糖低滲液（現(xiàn)配現(xiàn)用），待溶液溶解后，從各試驗組中吸取1 mL精液，分別加入9 mL檸檬酸鈉—果糖低滲液，在37 ℃條件下水浴30 min，期間不時輕晃試管，以免精子沉積。完畢后，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察精子彎尾率。計算在200個精子中尾部彎曲的精子所占比例，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5 精子頂體完整性的測定

使用熒光染料異硫氰酸熒光素-花生凝集素（FITC-PNA）對精子進行染色檢測頂體完整率。取30 μL精液均勻涂抹于干凈的載玻片上，自然風(fēng)干。風(fēng)干后的樣品玻片置于無水甲醇中，固定10 min后放置于空氣中，自然風(fēng)干。取30 μL FITC-PNA工作液，均勻覆蓋樣品，再將玻片置于濕盒內(nèi)，37℃，避光孵育30min。孵育結(jié)束后使用PBS沖洗玻片2～3次，洗去浮色，后迅速在熒光顯微鏡下觀察拍照，使用450～490 nm紫外光激發(fā)。選擇5個以上清晰的視野，且每個視野精子數(shù)200個以上，計算頂體完整精子比例。試驗全程避光操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2016進行統(tǒng)計整理，利用 SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），最終以Mean±SD形式表現(xiàn)。P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ε-PL對稀釋液滲透壓的影響

由表1可知ε-聚賴氨酸對精液的滲透壓影響很小。ε-PL添加量在0.04～0.64 g/L以及0.25 g/L慶大霉素時對于精液的滲透壓影響不大（P＞0.05），當(dāng)該物質(zhì)添加至1.28 g/L時，精液中的滲透壓顯著高于其他組（P＜0.05）。

表1 不同濃度ε-聚賴氨酸對精液滲透壓的影響

2.2 ε-PL對精液中菌落數(shù)的影響

由圖1可知，在稀釋液中添加0.04～1.28 g/L的ε-聚賴氨酸在常溫1～3 d內(nèi)能有效抑制細菌的生長。當(dāng)保存至第3天，0.04 g/L與0.16 g/L組內(nèi)的細菌開始迅速生長，但這兩組的菌落數(shù)量仍然低于空白對照組，說明在此濃度下ε-聚賴氨酸仍然具有抑菌效果；隨著保存時間的增加，ε-聚賴氨酸的抑菌能力降低；而0.64 g/L，1.28 g/L處理組在1～5d內(nèi)均保持強抑菌效果。

2.3 ε-PL對精子活率的影響

如表2所示常溫保存第1天后各處理組與對照組的精子活率差異不明顯（P＞0.05)。當(dāng)保存至第2天時對照組和添加0.08 g/L ε-PL處理組的活率顯著高于其他組（P＜0.05）。隨著保存時間增加，當(dāng)保存至第3天時0.04 g/L，0.08 g/L，0.16 g/L ε-PL的處理組顯著高于其他組（P＜0.05）。而其他處理組精子的活力均高于對照組。當(dāng)保存至第4、5天時0.16 g/L ε-PL處理組的保存效果最好。此外，各處理組的精子活力均高于對照組。因此，相比于其他處理組添加0.16 g/L ε-PL常溫保存5 d后精子活率最高。

圖1 不同濃度ε-聚賴氨酸對精液中菌落數(shù)的影響

表2 不同濃度ε-聚賴氨酸對精子活率的影響

2.4 ε-PL對精子質(zhì)膜完整性影響

如表3所示常溫保存兩天后，添加0.64 g/L、1.28 g/L ε-PL處理組的質(zhì)膜完整性顯著低于其他組（P＜0.05）。當(dāng)保存至第3天時，0.16 g/L ε-PL處理組的精子質(zhì)膜完整性最高。各處理組的質(zhì)膜完整性高于對照組。而當(dāng)保存至第5天時，各處理組的質(zhì)膜完整性均顯著高于對照組（P＜0.05)。相對于其他處理組，0.16 g/L ε-PL的處理組質(zhì)膜完整率最高。

2.5 ε-PL對精子頂體完整性影響

關(guān)中黑公豬精液在常溫保存第1、2天，公豬精子的頂體完整性差異不顯著（P＞0.05）。當(dāng)保存至第3天時，各處理組中的精子頂體完整性顯著高于對照組（P＜0.05），而處理組間添加0.16 g/L ε-PL的處理組精子頂體完整性最高。在第4天時，各處理組的精子頂體完整性仍顯著高于對照組，其中0.04g/L、0.08 g/L、0.16 g/L3個處理組精子頂體完整性相近（P＞0.05），且高于其他處理組（P＜0.05）。第 5天時0.16 g/L ε-PL的處理組頂體完整性最高。

表3 不同濃度ε-PL對精子質(zhì)膜完整性影響

表4 不同濃度ε-PL對精子頂體完整性影響

3 討論

稀釋液的穩(wěn)定滲透壓為保證精子在液態(tài)常溫保存，而精子的耐受滲透壓為240～380 mosm之間，過低的滲透壓會影響精子質(zhì)膜的完整性[6-7]。本試驗發(fā)現(xiàn)在使用BTS稀釋后的關(guān)中黑豬精液中添加0.04～0.64 g/L ε-PL后，其滲透壓基本不變，說明該物質(zhì)對于滲透壓的影響較小。

ε-PL是一種由賴氨酸殘基構(gòu)成的陽離子抗菌肽，其表面帶有大量的正電荷，能黏附到帶有大量負電荷的菌體膜上，使菌體膜表面成孔洞狀以影響細菌的正常生命活動，從而起到抑菌的作用[8]，其對于G+和G-均具有不錯的抑制效果[9]。本試驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)精液中ε-PL添加量為0.04 g/L時，在0～3 d能有效抑制精液中細菌的生長，但隨著保存時間的增加抑制效果逐漸降低。當(dāng)保存時間在3～5 d時，0.16 g/L處理組精液中細菌含量接近于空白對照組中第2天的細菌數(shù)量。因此，在0.16 g/L時就已經(jīng)能夠?qū)⒐i精液中的細菌量控制在安全范圍內(nèi)（不損傷精子）。但當(dāng)精液常溫保存超過5 d，添加0.16 g/L ε-PL對精液中細菌控制效果可能會大大降低。

精子活率是評價精子運動能力的重要指標之一，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用精子活率低于60%的精液輸精，會降低母豬的繁殖成績[10]。精子活率是評價常溫保存后精子受精能力的重要指標[11]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)精液常溫保存至第2天時，對照組中的精子活率高于其他處理組，一方面可能是因為ε-PL對精子有輕微的毒害作用，另一方面是由于常溫保存至第2天精液中存在細菌還不足以影響到精子的運動。

精子質(zhì)膜和頂體是否完整是精子能否發(fā)揮其正常生理功能的保證。2004年曾發(fā)現(xiàn)與用傳統(tǒng)的精子活率估計母豬繁殖成績相比，精子質(zhì)膜和頂體完整性能更準確地評估輸精后母豬的繁殖成績[11]。精子的受精能力不僅與質(zhì)膜完整性有關(guān)還與頂體完整性相關(guān)。本試驗發(fā)現(xiàn)，在常溫保存第1天各組間的質(zhì)膜和頂體完整性差異不顯著。當(dāng)保存至第2天時高濃度ε-PL處理組（0.64 g/L，1.28 g/L），精子質(zhì)膜完整性顯著低于低濃度及對照組。這是由于ε-PL對于精子可能具有輕微的毒性作用。由于公豬精子與其他哺乳動物精子相比，質(zhì)膜中的膽固醇含量較低，因此，陽離子抗菌肽可能會結(jié)合到豬精子膜表面輕微的影響精子質(zhì)膜和完整性，而公豬精子的頂體幾乎未受到影響?？傊褐械募毦焕诰拥某乇４?，其會損傷精子的質(zhì)膜和提前引發(fā)精子的頂體反應(yīng)。而對照組的質(zhì)膜和頂體完整性在常溫保存第3天后顯著低于處理組，是因為細菌在第2天開始大量的繁殖，保存至第3天對照組中的細菌數(shù)量已威脅精子存活。當(dāng)保存至第4、5天時，各處理組的質(zhì)膜和頂體完整性均高于對照組，而在0.04 g/L處精子仍能夠保持較高的頂體完整性，仍可能是由于ε-聚賴氨酸減少了細菌對精子的黏附作用[12]。

4 結(jié)論

0.04～0 .64 g/Lε-PL不影響稀釋精液的滲透壓，但能有效控制精液中細菌的生長，提高關(guān)中黑豬精液的保存效果，其中ε-PL的最佳濃度為0.16 g/L。

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2017-08-04）

國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-36）和西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗示范站（基地）科技成果推廣項目（TGZX2015-18）

魏寧(1993-)，男，在讀碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：wein0513@163.com通訊作者：龐衛(wèi)軍(1972-)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：肌肉生物學(xué)與豬遺傳改良，E-mail：pwj1226@nwafu.edu.cn