周祥羽，岳賀，李春苑，龔夢鵑，王淑美，梁生旺，鄒忠杰

·藥理毒理·

左金丸對胃熱證大鼠炎癥因子、氧化應(yīng)激因子及凋亡因子的影響

周祥羽1,2,3，岳賀1,2,3，李春苑1,2,3，龔夢鵑1,2,3，王淑美1,2,3，梁生旺1,2,3，鄒忠杰1,2,3

目的：探討左金丸干預(yù)大鼠胃熱證的作用機(jī)制。方法：將大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組和左金丸組，通過灌胃辣椒煎液和無水乙醇建立大鼠胃熱證模型，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和化學(xué)比色法測定各組大鼠血清中的炎癥因子如白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-6、IL-10、IL-1β和髓過氧化物酶（MPO）；氧化應(yīng)激因子如還原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）和凋亡因子如B細(xì)胞淋巴瘤因子-2（Bcl-2）的活性或含量。結(jié)果：左金丸能顯著減少胃熱證大鼠胃黏膜損傷面積，顯著升高胃熱證大鼠血清中GST、GSH-Px、CAT、SOD活性和GSH、IL-10、Bcl-2的含量，顯著降低胃熱證大鼠血清中MPO活性和IL-2、IL-6、IL-1β、MDA的含量。結(jié)論：左金丸可通過抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡作用干預(yù)胃熱證。

左金丸；胃熱證；抗炎；抗氧化；抗凋亡

左金丸源自朱丹溪的《丹溪心法?火六》，方由黃連、吳茱萸（6:1）組成，具有瀉火疏肝、和胃止痛的功效，用于肝火犯胃、胃失和降所致的脘脅疼痛、口苦嘈雜、嘔吐吞酸等，主治胃實(shí)熱證。臨床上要用于肝火犯胃型急慢性胃炎、反流性食管炎、功能性胃腸疾病、慢性萎縮性胃炎、消化道潰瘍等的治療?，F(xiàn)代藥理研究表明左金丸具有調(diào)節(jié)中樞、抑殺幽門螺桿菌（Hp）、調(diào)節(jié)體溫、調(diào)節(jié)胃腸蠕動、抑制胃酸分泌、抗?jié)?、抗炎?zhèn)痛等作用[1]。此外，左金丸能顯著減少胃熱證大鼠胃黏膜損傷，降低其血清中白細(xì)胞介素（IL）-8、IL-2、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、血栓素B2（TXB2），前列腺素E2(PGE2)[2]和6-酮前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）的水平[3]。

在前期的研究工作中，我們利用代謝組學(xué)的方法證實(shí)左金丸可以有效干預(yù)胃熱證大鼠紊亂的糖代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝[4]。本研究旨在從抗炎、抗氧化和抗細(xì)胞凋亡三個不同角度系統(tǒng)性的探討左金丸治療胃熱證的作用及其機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗動物

雄性SD大鼠，體重200±10g，購自中山大學(xué)實(shí)驗動物中心，動物合格證號：SYXK（粵）2012-0125，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗動物中心屏障環(huán)境設(shè)施中。動物自由攝食飲水，飼養(yǎng)溫度為22℃，空氣濕度為50%左右，光照 12 h，黑暗12 h。

1.2 藥物

黃連和吳茱萸飲片購自廣州采芝林藥店，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院韓彬教授鑒定為正品。黃連和吳茱萸以6:1混合粉碎，10倍量蒸餾水浸泡1 h，煎煮2 h，雙層紗布濾過出藥汁，藥渣再加8倍水煎煮2 h，濾出藥汁，合并兩次藥汁， 加熱揮發(fā)至濃縮液（0.14 g生藥．mL-1）。辣椒粉加8倍量蒸餾水煎煮2次，每次1 h，合并提取液，濃縮成8%的煎液。

1.3 試劑

無水乙醇，天津大茂化學(xué)試劑廠，分析純，批號20150503；甲醛，天津福晨化學(xué)試劑廠，批號20150107；水合氯醛，天津大茂化學(xué)試劑廠，批號20150318。白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-6、IL-10、IL-1β、髓過氧化物酶（MPO）、還原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）和B細(xì)胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 主要儀器

UV1102II型紫外分光光度計（上海天美科學(xué)儀器有限公司），1-14型低溫離心機(jī)（德國 Sigma 公司），ELX800型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

SD大鼠24只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分成3組：正常組、模型組和左金丸給藥組。模型組與左金丸組大鼠灌胃給予辣椒煎液（10 mL．kg-1），每天2次，連續(xù)6天，禁食不禁水24 h后，第7天，灌服1mL無水乙醇，正常組灌服等量蒸餾水。從第4天開始，左金丸給藥組灌胃給予左金丸水提液（1.4 g．kg-1），每天1次，正常組和模型組灌胃給予等量蒸餾水。

2.2 樣本采集

末次給藥后1 h，各組大鼠以10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血。收集的血液樣品經(jīng)凝固（4℃,60 min）后離心（3500 r．min-1, 15 min, 4℃）得到血清，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。大鼠處死后切腹取胃，向胃?nèi)注射10%的甲醛進(jìn)行固定，10 min后沿胃大彎部剪開，沖洗干凈，展平后拍照，用ImageJ（National Institutesof Health，USA）軟件計算大鼠胃黏膜損傷面積。

2.3 胃黏膜組織病理學(xué)檢測

取代表性部位，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察。

2.4 血清炎癥因子、氧化應(yīng)激因子及凋亡因子檢測

化學(xué)比色法測定GSH、MDA、NO含量和GST、GSH-Px、CAT、SOD、MPO活性，ELISA測定IL-2、IL-6、IL-10、IL-1β、Bcl-2含量。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗結(jié)果以 ±s表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件， 組間比較采用單因素方差分析，兩兩數(shù)據(jù)比較用Turkey檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 胃黏膜損傷情況

肉眼觀察，正常組動物胃黏膜光滑完整，無潰瘍面和出血點(diǎn)；模型組動物胃黏膜表面充血水腫、糜爛，有大量點(diǎn)狀或線狀出血點(diǎn)和潰瘍；左金丸給藥組動物胃黏膜光滑，表面有散在的出血點(diǎn)、潰瘍點(diǎn)，損傷面積較模型組顯著減少（P＜0.05，圖1）。

圖1 各組大鼠胃黏膜損傷面積±s，n=8）

3.2 胃黏膜組織病理學(xué)變化

正常組可見胃黏膜層由黏膜下層、肌層及漿膜層組成，結(jié)構(gòu)清晰，層次分明；模型組可見黏膜壞死脫落，潰瘍形成，間質(zhì)出現(xiàn)水腫，細(xì)胞間隙增寬明顯，炎細(xì)胞浸潤廣泛；左金丸組可見胃黏膜淺層有細(xì)胞脫落，無明顯潰瘍形成（圖2）。

圖2 左金丸對胃熱證大鼠胃黏膜組織病理學(xué)變化的影響（HE染色，×100）

3.3 左金丸對胃熱證大鼠血清炎癥因子的影響

模型組較正常組血清IL-2、IL-6、IL-1β水平和MPO活性顯著升高（P＜0.05），IL-10水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，左金丸組IL-2、IL-6、IL-1β水平和MPO活性顯著降低（P＜0.05），IL-10水平顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 左金丸對胃熱證大鼠血清IL-2、IL-6、IL-10、IL-1β含量和MPO活性的影響±s，n=8）

表1 左金丸對胃熱證大鼠血清IL-2、IL-6、IL-10、IL-1β含量和MPO活性的影響±s，n=8）

注：與正常組比較*P＜0.05；與模型組比較#P＜0.05

IL-6(pg．mL-1)組別 IL-2(pg．mL-1)IL-10(pg．mL-1)IL-1β(pg．mL-1)MPO(U．L-1)正常組 94.23±15.81 48.33±1.88 30.56±1.13 33.77±7.68 32.74±6.53模型組 237.20±43.37* 57.97±8.61* 23.38±2.68*53.74±10.68 *63.91±16.35*左金丸組 106.25±45.85# 47.24±3.81# 27.47±1.57# 39.88±5.68# 45.83±7.32#

3.4 左金丸對胃熱證大鼠氧化應(yīng)激因子的影響

如表2和3所示，與正常組相比，模型組大鼠血清GSH含量和GST、GSH-Px、CAT、SOD活性明顯降低（P＜0.05），NO含量和氧化產(chǎn)生的MDA顯著升高（P＜0.05）。左金丸組較模型組GSH含量和GST、GSH-Px、CAT、SOD活性明顯升高（P＜0.05），NO、MDA含量顯著降低（P＜0.05）。

表2 左金丸對胃熱證大鼠血清GSH含量和GST、GSH-Px、CAT、SOD活性的影響（±s，n=8）

表2 左金丸對胃熱證大鼠血清GSH含量和GST、GSH-Px、CAT、SOD活性的影響（±s，n=8）

注：與正常組比較* P＜0.05；與模型組比較# P＜0.05

SOD(U．mL-1)正常組 14.96±1.59 30.17±3.99 4584.42±298.38 7.82±0.47 354.69±6.44模型組 7.71±1.56* 19.62±1.75* 3501.30±209.70* 6.13±0.32* 289.91±4.40*左金丸組 11.46±2.66# 25.49±2.75# 4579.22±100.23# 7.14±0.71# 349.38±12.29#組別 GSH(mg．L-1)GST(U．mL-1)GSH-Px(U．0.1mL-1)CAT(U．mL-1)

3.5 左金丸對胃熱證大鼠凋亡因子的影響

模型組較正常組大鼠血清中Bcl-2含量顯著降低（P＜0.05），左金丸組較模型組大鼠血清Bcl-2含量顯著升高（P＜0.05）。見表3。

表3 左金丸對胃熱證大鼠血清MDA、NO和Bcl-2含量的影響（±s，n=8）

表3 左金丸對胃熱證大鼠血清MDA、NO和Bcl-2含量的影響（±s，n=8）

注：與正常組比較* P＜0.05；與模型組比較# P＜0.05

組別 MDA(nmol．mL-1)NO(μmol．L-1)Bcl-2(pg．mL-1)正常組 7.36±0.43 5.38±2.11 26.76±4.39模型組 14.51±0.74* 8.20±0.93* 16.84±3.78*左金丸組 7.59±0.36# 5.53±1.76 # 25.31±4.46#

4 討論

大鼠胃熱證胃黏膜的損傷主要表現(xiàn)為胃黏膜充血、炎性滲出、潰瘍等病理改變，炎性因子的水平變化與大鼠胃熱證密切相關(guān)。炎性因子中MPO活性是評價中性粒細(xì)胞在組織中浸潤程度的可靠指標(biāo)，IL-2，IL-6和IL-1β促炎因子的增多，將加重炎癥的發(fā)展，抗炎因子IL-10在炎癥消除過程中發(fā)揮重要作用，IL-2，IL-6和IL-1β等促炎因子同時能促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）產(chǎn)生大量NO導(dǎo)致組織損傷。在炎癥反應(yīng)過程中，炎癥介質(zhì)起著復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)級聯(lián)作用，因而某一種炎癥介質(zhì)被拮抗或抑制，整個炎癥反應(yīng)過程將被減輕或阻斷，本實(shí)驗中，模型組大鼠血清中MPO的活性，IL-2，IL-6，IL-1β和NO的含量與正常組大鼠相比有明顯增高，IL-10明顯降低。而左金丸組大鼠血清中MPO的活性，IL-2，IL-6，IL-1β和NO的含量與模型組大鼠相比有明顯降低，IL-10含量明顯升高。說明左金丸通過抑制促炎因子和促進(jìn)抗炎因子釋放達(dá)到減輕炎癥反應(yīng)的效果。

大鼠胃熱證主要表現(xiàn)為胃黏膜的組織損傷，而活性氧（reactive oxygen specie，ROS）會造成生物膜過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，甚至變性壞死。MDA在血清中含量高低提示機(jī)體膜系統(tǒng)損害程度及脂質(zhì)過氧化程度，SOD和CAT是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的要成員，能使自由基引起的組織損傷減輕，其活力大小間接反應(yīng)了機(jī)體抗氧能力。GSH，GST和GSHPx含量是衡量機(jī)體抗氧化效果的重要指標(biāo)。本試驗?zāi)Ｐ徒M大鼠與正常組大鼠相比，血清中MDA的含量明顯增高，SOD，CAT，GSH-Px，GST活性和GSH含量明顯降低，表明胃熱證大鼠體內(nèi)產(chǎn)生了大量的ROS，而體內(nèi)的抗氧化酶不足以消除過量的ROS。左金丸組大鼠與模型組大鼠相比，血清中MDA顯著下降，SOD、GSH-Px、CAT、GST活性和的GSH含量明顯升高，這表明左金丸可以通過干擾ROS連鎖反應(yīng)的啟動和蔓延過程，有效清除大鼠除體內(nèi)過量的ROS，在抗氧化方面來治療胃熱證。

Bcl-2能抵抗多種形式的細(xì)胞凋亡，通過干擾細(xì)胞色素C的釋放而阻斷上游caspase 蛋白酶的激活，抑制細(xì)胞的凋亡，本實(shí)驗中，模型組大鼠與正常組大鼠相比，血清中Bcl-2明顯降低，說明胃熱證大鼠體內(nèi)細(xì)胞凋亡加重，Bcl-2與激活的促凋亡蛋白發(fā)生相互作用后 ,便喪失了對細(xì)胞凋亡的抑制作用，造成線粒體等細(xì)胞器的功能喪失和細(xì)胞器內(nèi)促凋亡因子的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。左金丸組和模型組相比，大鼠血清中Bcl-2明顯增多，說明左金丸可有效提升左金丸組大鼠血清中的Bcl-2含量，通過抑制細(xì)胞凋亡來治療胃熱證。

綜上所述，左金丸可有效治療大鼠胃熱證，可能是經(jīng)過降低炎癥反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激狀態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡三個不同途徑干預(yù)胃熱證的發(fā)生和發(fā)展。

[1] 趙平,許浚,張鐵軍,等.“病-證-方-藥”結(jié)合探析左金丸配伍的科學(xué)內(nèi)涵[J].中國中藥雜志,2011,36(23):3380.

[2] 陳艷芬,陳蔚文,李茹柳,等.左金丸與反左金對寒熱型胃粘膜損傷炎因子和保護(hù)因子的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志, 2003, 11(3):133.

[3] 山麗梅,趙艷玲,孔維軍,等.左金丸及其類方對胃熱證大鼠胃黏膜損傷及相關(guān)因子的影響[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報, 2010,26(2):99.

[4] Zou Z, Han B, Gong M, et al. NMR-Based Metabonomic Studies on Stomach Heat and Cold Syndromes and Intervention Effects of the Corresponding Formulas[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2014, doi:10.1155/2014/528396.

(責(zé)任編輯：陳思敏)

Effect of Zuojin pill on in fl ammatory factors, oxidative stress factors and apoptosis factors in rats with stomach heat syndrome/

ZHOU Xiang-yu1,2,3, YUE He1,2,3, LI Chun-yuan1,2,3, GONG Meng-juan1,2,3, WANG Shu-mei1,2,3, LIANG Sheng-wang1,2,3, ZOU Zhong-jie1,2,3//(1. School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006,Guangdong; 2.Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong; 3. Engineering . Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universities of Guangdong Province, Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006, Guangdong)

Objective:To explore the mechanisms of action of Zuojin Pill on stomach heat syndrome in rats.Method:The rats were randomly divided into normal group, model group and Zuojin pill group. Rat model of stomach heat syndrome was established by gavage of decoction of pepper and absolute ethanol. The contents or activities of in fl ammatory factors such as interleukin (IL)-2, IL-6, IL-10, IL-1β and myeloperoxidase (MPO) and oxidative stress factors such as glutathione (GSH),glutathione-S-transferase (GST), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), nitric oxide(NO) and malondialdehyde (MDA) as well as apoptotic factors such as B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) in rat serum were detected by chemical colorimetry and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Result:Zuojin pill can signi fi cantly reduce gastric mucosal lesion areas of rat with stomach heat syndrome. Furthermore, Zuojin pill signi fi cantly increased the activities of GST,GSH-Px, CAT, SOD and the contents of GSH, IL-10, Bcl-2, as well as reduced the activity of MPO and the contents of IL-2, IL-6,IL-1β, MDA in serum of rats with stomach heat syndrome.Conclusion:Zuojin pill exerts its intervention effects on stomach heat syndrome by adjustment of in fl ammatory mediators and apoptotic markers and increasing the ability of anti-oxidative stress.

Zuojin Pill; stomach heat syndrome; anti-in fl ammatory; antioxidant; anti-apoptotic

] A

1674-926X(2017)02-014-04

國家自然科學(xué)基金青年基金項目（81403075）；廣東省科技計劃項目（2012B060300031）

1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點(diǎn)研究室, 廣東 廣州 510006；3. 廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006

周祥羽，在讀碩士研究生，主要從事中藥活性成分及中藥新藥研究與開發(fā)Tel:15318566601 Email:305700713@qq.com

鄒忠杰，教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究Tel:13533709258 Email:zouzhongjie@139.com

2016-08-09