張海龍，張 維，舒 楠，胡婷婷，朱可霞，杜 靜，王信斌

（1.懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南懷化 418008；2.國家糧食局武漢科學(xué)研究設(shè)計(jì)院有限公司，湖北武漢 430079）

高效液相色譜法定量分析菜籽油中的苯并芘

張海龍1，張 維1，舒 楠1，胡婷婷1，朱可霞1，*杜 靜1，王信斌2

（1.懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南懷化 418008；2.國家糧食局武漢科學(xué)研究設(shè)計(jì)院有限公司，湖北武漢 430079）

建立菜籽油中苯并芘測定的高效液相色譜方法，采用ODS反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）作為分析柱，以甲醇為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫室溫，激發(fā)波長384 nm，發(fā)射波長406 nm，進(jìn)樣量10 μL；樣品采用Cleanert BaP-3-SPE固相萃取柱處理。該方法加標(biāo)回收率在87.00%～98.50%，具有準(zhǔn)確、簡便、快速的特點(diǎn)。

高效液相色譜法；菜籽油；苯并芘

Abstract：In order to establish the determination method of benzopyrene in rape seed by high performance liquid chromatography，the C18 reverse-phase chromatographic column（ODS） （Φ4.6 mm×250 mm，5 μm） is used as analytical column.The detection conditions are that the flow rate of mobile phase（methanol）is 1.0 mL/min，the temperature is room temperature，excitation wavelength is set at 384 nm，the emission wavelength is 406 nm，the injection volume is 10 μL.The sample is treatment by solid-phase extraction column.The recovery rate of the method is between 87.00%and 98.50%.The method has the characteristics of accurate，simple，rapid.

Key words：high performance liquid chromatography；rapeseed oil；benzopyrene

苯并芘 （Benzo（a）Pyrene，B（a）P），又名 3,4- 苯并芘，是目前已知的20多種致癌多環(huán)芳烴中最具代表性的致癌物之一。多項(xiàng)研究表明，苯并芘可以誘導(dǎo)白血病、肺癌、肝癌和乳腺癌的發(fā)生，是一種很強(qiáng)的內(nèi)分泌干擾物、致畸劑和致突變劑[1]，可通過呼吸道、消化道、皮膚等途徑被人體吸收，在人體中累積，長期食用損害人體健康，是世界公認(rèn)的三大致癌物（亞硝胺、黃曲霉毒素和3,4-苯并芘） 之一[2]。由于苯并芘具有較強(qiáng)的親脂特性，可通過加工、運(yùn)輸、貯藏等途徑進(jìn)入油脂食品中[3-4]。食用油中苯并芘的形成機(jī)理研究尚未取得較大進(jìn)展，還不清楚在食用油中產(chǎn)生的原因[5-6]。

國內(nèi)外關(guān)于苯并芘的檢測方法主要是熒光分析法、高效液相色譜法、聯(lián)用技術(shù)、免疫學(xué)檢測法[7]等。食用油中苯并芘檢測主要采用高效液相色譜法，其分為樣品的預(yù)處理和檢測2個基本過程。由于食用油中苯并芘具有較強(qiáng)的親油性，含量少、穩(wěn)定差、易吸附，且分析的樣品成分復(fù)雜，存在多種潛在干擾物質(zhì)，如大量甘油三酯、脂肪物質(zhì)，直接影響其測定[8]。目前，我國檢測植物油中苯并芘的國標(biāo)（GB/T 22509—2008） 存在樣品處理復(fù)雜、耗時(shí)長、試劑耗費(fèi)量大、對試劑和人員要求高等問題。所以，如何建立一種準(zhǔn)確、簡便、快速、經(jīng)濟(jì)檢測出食用油中的苯并芘含量方法，成為定量、定性分析工作的重點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽油，購于懷化市河西糧油市場；正己烷（分析純）、四氫呋喃（分析純）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），均由天津市科密歐試劑有限公司提供；苯并芘萃取柱Cleanert BaP-3-SPE，天津博納艾杰爾科技有限公司提供；苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A型島津高效液相色譜儀，日本島津公司產(chǎn)品；氮吹儀，上海皓莊儀器有限公司產(chǎn)品；Luna C18（2） 型（4.6 mm×250 mm，5 μm） 分析柱，美國pheno-menex公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Luna C18（2） 型（4.6 mm×250 mm，5 μm） 帶保護(hù)柱；流速1.0 mL/min；柱溫25℃；流動相：甲醇；進(jìn)樣量10 μL；激發(fā)波長384 nm，發(fā)射波長406 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品用正己烷溶解定容于100 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的母液置于冰箱貯藏，取一定體積的母液用乙腈分別稀釋成 20.000，10.000，5.000，2.500，1.250，0.625 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取0.500 0 g的菜籽油樣，用正己烷混勻定容至5 mL，漩渦混合1 min，加入到預(yù)先活化（先用5 mL二氯甲烷，再用5 mL正己烷活化柱子）的苯并芘萃取柱中，用8 mL正己烷洗脫柱子，棄去洗脫液；再用8 mL二氯甲烷洗脫并收集洗脫液于玻璃管中，用吹氮儀吹干，準(zhǔn)確稱取1 mL甲醇漩渦混合1 min，過0.45 μm的濾膜，濾液供測試。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將配制好的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品溶液參照2.1中的色譜條件進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品曲線。

2.5 準(zhǔn)確度與精密度評價(jià)

加入適量的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品于油樣中，超聲混勻，按2.3樣品處理方法進(jìn)行回收率和精密度測試，通過測定加標(biāo)回收率對方法準(zhǔn)確度進(jìn)行評價(jià)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相對偏差對方法精密度與重現(xiàn)性進(jìn)行評價(jià)。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶劑的選擇

考查對苯并芘有較大溶解度的正己烷、甲苯、乙酸乙酯有機(jī)溶劑，參照2.1中的色譜條件，分別進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)甲苯、乙酸乙酯在出峰時(shí)間6.45 min左右時(shí)，具有較大響應(yīng)值，峰面積較大，所以選擇正己烷作為溶解標(biāo)準(zhǔn)品苯并芘和樣品的溶劑。

甲苯液相色譜見圖1，乙酸乙酯液相色譜見圖2。

圖1 甲苯液相色譜

圖2 乙酸乙酯液相色譜

3.2 液相色譜條件的確定

試驗(yàn)比較了甲醇-水體系作流動相時(shí)苯并芘的反相色譜行為，結(jié)果表明，甲醇體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，表現(xiàn)出更佳的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，柱壓更低、安全性好。所以，試驗(yàn)采用甲醇作流動相，苯并芘進(jìn)行了等度洗脫分析。

苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜見圖3，樣品液相色譜見圖4。

圖3 苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜

圖4 樣品液相色譜

由圖4可以看出，在該洗脫條件下，苯并芘保留時(shí)間約為6.4 min，峰形對稱，柱效較高，既保證了定性定量的準(zhǔn)確性，又同時(shí)兼顧了分析效率的要求。

3.3 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

參照2.1中的色譜條件對系列不同質(zhì)量濃度苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣分析，分別以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的峰面積為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為Y=79 394X+18 244，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，苯并芘的峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，該方法的檢出限為0.625 ng/mL。

3.4 方法的準(zhǔn)確度與精密度

稱取適量食用油，加入適量苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品，參照2.3中的方法處理，進(jìn)行回收率試驗(yàn)，測得不同苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品添加量的回收率和相對偏差。

方法的準(zhǔn)確度與精密度評價(jià)見表1。

表1 方法的準(zhǔn)確度與精密度評價(jià)

由表1可以看出，加標(biāo)樣品回收率在87.00%～98.50%，平均回收率為95.21%；9次重復(fù)測定的相對偏差在6.78%～0.10%。由此可見，試驗(yàn)確定測定菜籽油中苯并芘含量的高效液相色譜法具有較高的準(zhǔn)確度和精確度。

4 結(jié)論

建立反相高效液相色譜法定量測定菜籽油中苯并芘含量的方法，采用ODS反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 作為分析柱；流速1.0 mL/min；柱溫室溫；激發(fā)波長384 nm，發(fā)射波長406 nm；以甲醇為流動相，樣品采用Cleanert BaP-3-SPE固相萃取。在該色譜分析條件下，苯并芘峰形對稱，保留時(shí)間合適，雜峰和苯并芘峰分離度高。該方法簡單、快速、高效，為食用油中苯并芘的定性、定量分析提供了一種重要途徑。

[1]Gelhaussl， Gilado， Hwanwt， et al．Multidrug resistance protein （MRP） 4 attenuates benzo[a]pyrene－mediated DNA－adduct formation in human bron-choalveolar H358 cells[J].Toxicol Lett，2012 （9）：58－66．

[2]徐文俊.致癌物質(zhì)對食物的污染及預(yù)防 [J].成都大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999，18（2）：40－44.

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[4]段小麗，魏復(fù)盛.苯并（a）芘的環(huán)境污染、健康危害及研究熱點(diǎn)問題 [J].世界科技研究與發(fā)展，2002，24（1）：11－17.

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[8]石全英，劉香軍，杜雅榮.大豆油中苯并（a） 芘檢測方法的優(yōu)化研究 [J].綠色科技，2015（6）：266-270.◇

Quantitative Determination of Benzopyrene in Rapeseed Oil by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Hailong1，ZHANG Wei1，SHU Nan1，HU Tingting1，ZHU Kexia1，*DU Jing1，WANG Xinbin2
（1.Key Laboratory of Hu'nan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources，College of Biological and Food Engineering，Huaihua University，Huaihua，Hu'nan 418008，China；2.Wuhan Science Research&Design Institute，State Administration of Grain，Wuhan，Hubei 430079，China）

TS229

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.09.034

1671-9646（2017） 09b-0026-03

2017-07-23

2016年地方高校國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610548009）。

張海龍（1985— ），男，碩士，講師，研究方向?yàn)橛土细碑a(chǎn)品加工與利用。

*通訊作者：杜 靜（1989— ），女，碩士，講師，研究方向?yàn)橛妥魑锔碑a(chǎn)物的應(yīng)用。