, ,, ,煒亮,,*,,

(1.華南農業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642;2.廣東農工商職業(yè)技術學院,廣東廣州 510507;3.廣東省疾病預防控制中心,廣東廣州 511430)

不同殺菌方式對軟質膠原蛋白凍品質及抗氧化活性的影響

吳紅1,周佺1,郭善廣1,萬俊2,吳煒亮3,蔣愛民1,*,羅碧琳1,祁焰晶1

(1.華南農業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642;2.廣東農工商職業(yè)技術學院,廣東廣州 510507;3.廣東省疾病預防控制中心,廣東廣州 511430)

以豬皮膠原蛋白酶解液為主要原料,經熱誘導凝膠制成軟質膠原蛋白凍,系統(tǒng)研究不同的殺菌方式(巴氏殺菌、常壓沸水殺菌、高壓蒸汽殺菌)對其品質及抗氧化特性的影響。研究結果表明,高壓蒸汽殺菌后軟質膠原蛋白凍的色澤變黃,硬度、彈性和咀嚼性都明顯下降(p<0.05)。不同殺菌方式處理后,經超濾分離的四個組分(>50、10～50、5～10、<5 kDa)中,分子量>50 kDa的蛋白質組分所占比例最大,常壓沸水殺菌組中分子量為5～10 kDa和<5 kDa的組分比例最大,分別為25.71%和9.48%。常壓沸水殺菌后軟質膠原蛋白凍的DPPH自由基和羥基自由基的清除能力最強,其IC50分別為0.042 g/mL和 0.093 g/mL,且色澤明亮且彈性較好。常壓沸水殺菌不僅有良好的殺菌效果,還能較好的保持軟質膠原蛋白凍的質構特性和抗氧化活性,這為新型軟質膠原蛋白的凍加工技術奠定基礎。

膠原蛋白,抗氧化,巴氏殺菌,常壓沸水殺菌

膠原蛋白中含有人體所必需的各類氨基酸[1],具有抑制細胞老化和增強細胞存活能力等抗氧化生物活性作用[2-4]。然而,膠原蛋白是一種熱敏性蛋白,在一定溫度下因化學鍵被打破而降解為分子量更小的多肽,從而影響其抗氧化活性[1]。軟質膠原蛋白凍是以豬皮為主要原料制成的膠原蛋白食品,研究表明,殺菌溫度的差異不僅會對凝膠類產品的理化性質,如色澤、質構特性和貯藏性造成影響[5-7],還會造成蛋白質分子量分布的改變[8]。

凝凍食品的殺菌方法較常用的是常壓殺菌,殺菌溫度低于100 ℃,但該殺菌條件無法達到商業(yè)無菌的要求[9]。升溫升壓處理凝凍可提高凝凍的食用安全品質[10]。殺菌溫度和壓力對膠原蛋白凍的凝膠流變學特性及抗氧化活性仍未有深入研究。

本文以豬皮為主要原料,經酶解調配后制備軟質膠原蛋白凍為研究對象,對比分析巴氏殺菌、常壓沸水殺菌和高壓蒸汽殺菌對其質構特性、流變學特性和抗氧化活性的影響,為制備高品質及具有抗氧化能力的軟質膠原蛋白凍食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮豬皮 購于華南農業(yè)大學三角市;胰蛋白酶(1∶250);無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、過氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸、抗壞血酸等 均為分析純;二苯基苦肼基(DPPH) 美國Sigma公司;其他為實驗室常用試劑。

1.2儀器與設備

UV-1800紫外可見分光光度計 日本島津有限公司;TA-XT Plus 12320質構儀 英國SMS公司;MCR301流變儀 奧地利安東帕有限公司;29751型超濾儀 美國Millipore公司;X-Rite SP62型色差儀 美國愛色麗公司;Kjeltec TM8100型凱氏定氮儀 福斯特卡公司;HH-4型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;JM-FB80型膠體磨 寧波駿豐偉業(yè)機械有限公司;其他均為實驗室常用設備。

1.3實驗方法

1.3.1 膠原蛋白凍制備流程 軟質膠原蛋白凍的制備流程[11],如圖1所示。制備要點如下:

酶解:稱取一定重量的勻漿液,調節(jié)pH至8.5后,添加0.04%的胰蛋白酶(按勻漿液中豬皮重量計),在37 ℃下水解3 h后,95 ℃水浴滅酶5 min[12]。

溶膠：稱取一定量的膠原蛋白酶解液,將卡拉膠和魔芋粉干混后加入,在室溫攪拌15 min,使膠粉充分溶脹,然后在75 ℃下煮膠15 min,并不停攪拌。

圖1 軟質膠原蛋白凍的制備流程Fig.1 Preparation of soft collagen jelly

1.3.2 殺菌方法 巴氏殺菌:85 ℃/15 min;常壓沸水殺菌[13]:100 ℃/10 min;高壓蒸汽殺菌:121 ℃/15 min[10];對照組:未經任何殺菌處理的軟質膠原蛋白凍。

1.3.3 色澤測定 在色差測定結果中,L*值為黑/白值、a*為紅/綠值、b*為藍/黃值[13]。將制備好的軟質膠原蛋白凍常溫下放置16 h后切成大小一致的,放在洗凈的培養(yǎng)皿中,測試光源為D65,測試口直徑10 mm。樣品重復測定3次,計算平均值。

1.3.4 質構的測定 將制備好的軟質膠原蛋白凍常溫下放置16 h后切成1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm的正方體,測試結果取硬度、彈性、膠黏性和咀嚼性進行主要分析。測試條件:探頭P50;測前下壓速度5.0 mm/s、測時速度1.0 mm/s、測試后回程速度5.0 mm/s;觸發(fā)力5.0 N,兩次壓縮間隔時間2.0 s,壓縮變形50%[14]。

1.3.5 流變學特性的測定 取一定量不同殺菌工藝下的軟質膠原蛋白凍進行流變學特性測定。

1.3.5.1 剪切掃描 按照Murillo-Maetinez等[15]的方法進行測定。選用PP50錐板(直徑為50 mm2),平行板間距為1 mm,剪切速率為0.01～100 s-1,進行測定。

1.3.5.2 溫度掃描 參考王元蘭[16]的方法,稍作修改。選用PP50錐板(直徑為50 mm2),平行板間距為1 mm,溫度掃描范圍為30～120 ℃,升溫速率為3 ℃/min,固定剪切速率為10 rad/s,應變?yōu)?%。測樣時用石蠟油將錐板四周密封,防止加熱過程中水分蒸發(fā)。

1.3.6 不同肽段蛋白質的分離 軟質膠原蛋白凍用一定量蒸餾水混勻后均質,離心(10000 r/min,10 min)后用雙層濾紙抽濾,收集濾液進行超濾。在室溫條件下,入口壓力30 Psi,循環(huán)口壓力10 Psi,選用截留分子量為50、10、5 kDa的超濾膜對濾液中的蛋白質進行分離[17]。

1.3.7 蛋白質含量測定 參照國家標準GB/T 5009.5-2010 《食品中蛋白質的測定》,進行測定[18]。

1.3.8 微生物檢測 菌落總數的測定參照國家標準GB 4789.2-2016《食品衛(wèi)生微生物學檢驗菌落總數測定》,進行測定[19]。

1.3.9 不同分子量多肽的抗氧化活性測定 取不同殺菌工藝下的軟質膠原蛋白凍,配制成不同的濃度梯度(0.025、0.05、0.10、0.25 g/mL)進行抗氧化活性測定。

1.3.9.1 DPPH·清除能力測定 參考Rodrigo等[20]的方法測定。實驗時精確稱取0.0025 g DPPH,用無水乙醇溶解并定容至100 mL的棕色容量瓶中,配制成濃度為6.5×10-5mol/L DPPH·乙醇溶液。分三組進行,第一組分別吸取2 mL樣液和2 mL DPPH·乙醇溶液,搖勻,室溫下反應30 min后用分光光度計517 nm處測定吸光度值A1;第二組分別吸取2 mL無水乙醇和2 mL DPPH·乙醇溶液,其余步驟同第一組,吸光度值記為A2;第三組試管中分別吸取2 mL樣液和2 mL無水乙醇,其余步驟同第一組,吸光度值記為A3。以抗壞血酸為陽性對照,每組做三個平行。DPPH·清除率計算公式如下:

式(1)

1.3.9.2 ·OH清除率 參考Smirnoff 等[21]的方法測定。H2O2和Fe2+混合發(fā)生Fenton反應,生成具有很高反應活性的·OH,能被水楊酸有效捕捉并生成有色物質;樣液中具有清除作用的物質能與水楊酸競爭而使有色物質生成量減少。取不同濃度樣品溶液2 mL,依次加入 6 mmol/L的FeSO4溶液、6 mmol/L的H2O2溶液和6 mmol/L的水楊酸溶液2 mL,混勻后靜置30 min,用分光光度計在510 nm處測其吸光值,以抗壞血酸為對照,進行三次平行測定。

表2 殺菌方式對軟質膠原蛋白凍質構特性的影響Table 2 The effects of different sterilization methods on soft collagen jelly’s texture

式(2)

其中A0為空白對照;Ai為某質量濃度樣品溶液的吸光值;Aj為無過氧化氫時樣品溶液的吸光值。

1.3.9.3 還原力測定 參考任俊鳳[22]的方法,并稍作修改。取0.5 mL的樣品,分別加入2.5 mL的磷酸緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)和1%的鐵氰化鉀溶液,50 ℃水浴20 min后再加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL,靜置10 min后取上述反應液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和0.1%的氯化鐵溶液0.5 mL,反應10 min后用分光光度計在700 nm處測定吸光值,以抗壞血酸為對照,進行三次平行測定。

1.3.10 數據處理 實驗數據的統(tǒng)計使用Microsoft Office 2010和Origin 8.5軟件(美國Origin Lab公司);數據的顯著性差異分析使用SPSS 20.0軟件(美國SPSS公司),差異顯著性水平為p<0.05。

2 結果與分析

2.1不同殺菌方式對軟質膠原蛋白凍色澤的影響

殺菌方式對軟質膠原蛋白凍色澤的影響如表1所示。研究結果表明,殺菌方式對軟質膠原蛋白凍的色澤具有一定影響,其中對L*值和b*值影響顯著,而對a*值無顯著影響。對于L*值,高壓蒸汽殺菌組的L*值最大,顯著高于其他三組(p<0.05),且巴氏殺菌與常壓沸水殺菌組之間的L*值無顯著差異(p>0.05)。對于b*值,處理組中，高壓蒸汽殺菌組的b*值最大,顯著高于另外兩種殺菌方法(p<0.05),顏色偏黃。原因可能是,軟質膠原蛋白凍中蛋白質含量為5.28%,加工過程中有添加調味劑(白砂糖),在殺菌過程中溫度越高、反應時間越長,羰基化合物(糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質)間發(fā)生美拉德反應而使產品的顏色加深[23],但高壓蒸汽殺菌處理會加速反應的進行,使軟質膠原蛋白凍顏色偏黃。

表1 殺菌方式對軟質膠原蛋白凍色澤的影響Table 1 The effects of different sterilization methodson the color changes of soft collagen jelly

注:同列不同字母代表差異顯著(p<0.05)。2.2殺菌方式對軟質膠原蛋白凍質構特性的影響

殺菌方式對軟質膠原蛋白凍質構的影響如表2所示。對于硬度,巴氏殺菌和常壓沸水殺菌后的軟質膠原蛋白凍硬度顯著高于對照組(p<0.05),且常壓沸水殺菌組的軟質膠原蛋白凍硬度最大,而高壓蒸汽殺菌后的軟質膠原蛋白凍硬度明顯下降(p<0.05)。對于凝膠性,經過不同殺菌方式后,軟質膠原蛋白凍的凝膠性大小依次為:高壓蒸汽殺菌<對照<巴氏殺菌<常壓沸水殺菌,且常壓沸水殺菌組的軟質膠原蛋白凍凝膠性最顯著大于其他三組(p<0.05)。殺菌過程中,溫度在75～100 ℃內,軟質膠原蛋白凍的彈性和咀嚼性等質構特性隨著溫度的上升而增大,在殺菌溫度高于110 ℃時,凝膠性果凍的硬度、咀嚼性和彈性等質構特性下降[13],當溫度達到高壓蒸汽殺菌所需溫度(121 ℃)后,軟質膠原蛋白凍的質構特性顯著下降(p<0.05),因此可得常壓沸水殺菌能較好的提升并減少溫度對軟質膠原蛋白凍質構特性的影響。

2.3殺菌方式對流變學特性的影響

粘性能夠反映破壞凝膠內部結構的難易程度[24]。圖2所示為30 ℃時不同殺菌組的表觀粘度隨剪切速率的變化。由圖可知,剪切速率在0.01～80 s-1內,隨著剪切速率的增加,表觀粘度逐漸下降,呈現假塑性,具有剪切稀化的特點。剪切速率達到80 s-1時,出現曲線平臺。在0.01～100 s-1內,表觀粘度大小依次為:巴氏殺菌<常壓沸水殺菌<高壓蒸汽殺菌。隨著剪切速率的增加,蛋白質分子在流動方向上逐漸定向,摩擦阻力下降,蛋白質中的氫鍵和其他弱的作用鍵斷裂導致蛋白質的聚集或網絡結構的解體,使其粘性下降[25]。隨著殺菌溫度的越高,軟質膠原蛋白凍的粘度下降越慢,粘度越大。這可能是由于高溫處理導致凝膠體系遭到破壞,網絡結構穩(wěn)定性降低而導致粘度下降[9]。

圖2 剪切速率對軟質膠原蛋白凍表觀粘度的影響Fig.2 The effect of different sterilization methodson the apparent viscosity of soft collagen jelly

在流變學中,儲能模量(G′)和損失模量(G″)分別表示被測樣品的彈性行為和粘性行為。軟質膠原蛋白凍溫度掃描結果如圖3所示。經不同殺菌方式處理后,軟質膠原蛋白凍體系中的G′和G″具有相似的變化趨勢,在30～65 ℃范圍內,隨著溫度的升高,G′和G″快速下降,65 ℃后,G′和G″達到平臺區(qū),基本保持穩(wěn)定。在溫度掃描范圍內,G′與G″大小順序為:對照組>巴氏殺菌>常壓沸水殺菌>高壓蒸汽殺菌,其中高壓蒸汽殺菌組彈性模量和粘性模量都顯著降低(p<0.05)。在30～65 ℃內,各處理組G′大于G″,即彈性行為高于粘性行為。經高溫處理后膠體大分子解離,分子間纏繞減少,由有序狀態(tài)變成無序狀態(tài),粘性下降[26,28],高壓蒸汽殺菌會降低軟質膠原蛋白凍的彈性模量和粘性模量。

圖3 溫度對軟質膠原蛋白凍儲能模量和損失模量的影響Fig.3 The effect of different sterilization methodson the G′ and G″ of soft collagen jelly

2.4殺菌方式對蛋白質分子量分布的影響

殺菌后軟質膠原蛋白凍中蛋白質分子量分布變化如圖4所示。從圖4中可知,經三種殺菌方式處理后,各蛋白質分子量仍以大于50 kDa為主,分別占(62.23%±0.21%)、(51.87%±0.47%)和(56.25%±0.11%),但10～50 kDa之間的蛋白質占比在高壓蒸汽殺菌和巴氏殺菌后有所增大,處理組間存在顯著性差異(p<0.05)。常壓沸水殺菌后軟質膠原蛋白凍中的小分子蛋白(10～5 kDa之間和小于5 kDa)占比最大,分別為(25.71%±0.24%)和(9.48%±0.24%),顯著高于其他兩個滅菌組(p<0.05)。在升溫過程中(15～100 ℃)膠原蛋白三股肽鏈間的氫鍵減少,伸展的肽鏈結構增加[13,26],大分子水解成小分子;隨著溫度的繼續(xù)升高,膠原蛋白肽鏈進一步水解,使游離氨基酸和可溶性氮含量增加[27],而高溫會促使蛋白質和白砂糖發(fā)生非酶促褐變,隨著時間的延長,氨基酸含量的減少呈指數變化[29-31],因此高壓蒸汽殺菌可能會加速氨基酸的損失,導致小分子蛋白含量降低。

圖4 不同殺菌方式蛋白質分子量的分布Fig.4 The molecular weight distribution ofdifferent sterilization methods

2.5菌落總數測定結果

菌落總數檢測結果如圖5所示,高壓蒸汽殺菌滅菌率可達97.33%,滅菌最徹底;常壓沸水殺菌和巴氏殺菌的滅菌率分別為74.08%、80.00%;三種殺菌效果均存在顯著性差異(p<0.05)。

圖5 不同殺菌方式對軟質膠原蛋白凍菌落總數的影響Fig.5 The effect of different sterilization methodson the main facilities of soft collagen jelly

2.6殺菌方式對抗氧化活性的影響

2.6.1 DPPH·清除能力 由圖6可知,殺菌后的軟質膠原蛋白凍對DPPH·清除能力呈現一定的量效關系。隨著測試樣液中膠原蛋白濃度的增大,DPPH·清除能力增強,DPPH·清除能力大小依次為常壓沸水殺菌為0.042 g/mL)>巴氏殺菌(IC50為0.048 g/mL)>高壓蒸汽殺菌(IC50為0.049 g/mL)>對照組(IC50=0.051 g/mL),巴氏殺菌后軟質膠原蛋白凍對DPPH·的清除能力最高。在80 ℃下加熱膠原蛋白,會使膠原肽鏈收縮、聚集,溫度超過100 ℃時,膠原蛋白的一級結構被嚴重破壞[8],促使膠原蛋白熱水解成小分子多肽[28],高壓蒸汽殺菌處理會破壞維持膠原蛋白活性肽空間結構的化學鍵,導致活性下降或喪失[30]。任嬌艷[31]研究發(fā)現,高壓蒸汽殺菌會使草魚膠原蛋白肽的活性顯著低于巴氏殺菌,會破壞維持活性肽空間結構的化學鍵,導致活性喪失,因此高溫處理會降低豬皮膠原蛋白的DPPH·清除能力。

圖6 不同殺菌方式DPPH·清除能力的比較Fig.6 The scavenging DPPH· activity ofdifferent sterilization methods

2.6.2 ·OH清除能力 從圖7可知,不同殺菌方式處理后,軟質膠原蛋白凍仍具有一定的·OH清除能力,隨著樣品濃度的增加,清除能力增強,呈現一定的量效關系。常壓沸水殺菌后軟質膠原蛋白凍對·OH清除能力最強,IC50為0.09 g/mL,其次是高壓蒸汽殺菌組(0.10 g/mL)、巴氏殺菌組(0.11 g/mL)和對照組(0.12 g/mL)。常壓沸水殺菌處理后,軟質膠原蛋白凍中小分子量蛋白(5～10 kDa之間和<5 kDa)含量最高,小分子膠原蛋白多肽對·OH有較好的清除能力[32]。

圖7 不同殺菌方式·OH清除能力比較Fig.7 The scavenging ·OH activity ofdifferent sterilization methods

2.6.3 Fe3+還原力 抗氧化劑能在一定的條件下將Fe3+還原成Fe2+,使體系顏色發(fā)生變化,用分光光度計在700 nm處測定體系的吸光度值,即可反映待測物質還原能力的強弱,吸光度值越大,還原能力越強。不同殺菌方式處理軟質膠原蛋白凍后其Fe3+還原力結果如圖8所示。由圖中可以看出,殺菌后軟質膠原蛋白凍具有一定的Fe3+還原能力;各處理組還原力大小依次為:高壓蒸汽殺菌(0.369±0.004)>常壓沸水殺菌(0.368±0.012)>巴氏殺菌(0.292±0.002)>對照組(0.287±0.006),常壓沸水殺菌和高壓蒸汽殺菌處理組間無明顯差異(p>0.05)。

圖8 不同殺菌方式的還原能力比較Fig.8 The reducing ability of different sterilization methods

3 結論

通過對比軟質膠原蛋白凍的品質及抗氧化能力變化得出:不同殺菌方式對軟質膠原蛋白凍的質構及色澤影響較大,常壓沸水殺菌后軟質膠原蛋白凍色澤明亮,咀嚼性和彈性等質構特性與市售果凍最接近,高壓蒸汽殺菌后硬度、彈性和咀嚼性都顯著下降;常壓沸水殺菌組的·OH清除能力最強,Fe3+還原力較好,其中小分子蛋白(5000～10000 Da和<5000 Da)占比為35.19%。常壓沸水殺菌不僅有良好的殺菌效果,還能在維持軟質膠原蛋白凍質構特性的同時提高其抗氧化活性,是較適合軟質膠原蛋白凍的一種殺菌方式,值得在軟質膠原蛋白凍領域推廣應用。

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Effectsofdifferentsterilizationmethodsonthequalityandantioxidantactivityofsoftcollagenjelly

WUHong1,ZHOUQuan1,GUOShan-guang1,WANJun2,WUWei-liang3,JIANGAi-min1,*,LUOBi-lin1,QIYan-jing1

(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.Guangdong Agr Ind Business Polytechnic College,Guangzhou 510507,China;3.Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention,Guangzhou 511430,China)

In this research,pigskin collagen enzyme solution was used as main raw material to make a soft collagen jelly,on the basis of this,the effects of different sterilization methods(pasteurization,atmospheric pressure boiling water sterilization,high pressure steam sterilization)on the quality and antioxidant activity of soft collagen gel were investigated. Results showed that the color of soft collagen jelly with high pressure steam sterilization was yellow,the hardness,flexibility and chewiness were decreased significantly(p<0.05). After different sterilization process,there were four protein components separated by ultrafiltration(>50,10～50,5～10,<5 kDa),and macromolecular protein(>50 kDa)accounted for the biggest percentage,the content of protein which were 5～10 kDa and<5 kDa of atmospheric pressure boiling water sterilization were highest,accounted for 25.71% and 9.48%,the scavenging activity of DPPH· and ·OH was strongest in atmospheric pressure boiling water sterilization group,IC50were 0.042 g/mL and 0.093 g/mL,and the soft collagen jelly showed a bright colour and good elasticity. In conclusion,atmospheric pressure boiling water sterilization not only has good sterilization effect,also can keep soft collagen jelly’s texture and antioxidant activity better,which lay the foundation for the new soft collagen jelly’s processing technology.

collagen;antioxidant;pasteurization;atmospheric pressure boiling water sterilization

TS251

A

1002-0306(2017)19-0052-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.010

2017-04-11

吳紅(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：食品工程，E-mail：m13422056632@163.com。

*通訊作者:蔣愛民(1957-)，男，博士，教授，研究方向：畜產品加工， E-mail：amjiang@scau.edu.cn。

廣東省畜禽產品加工工程技術研究開發(fā)中心建設項目/畜禽產品精準加工與安全國家地方聯合工程研究中心建設項目。