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(1. 廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004;2.憑祥出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣西憑祥 532600)

生長分化因子(BMP11)重組質(zhì)粒在工程菌株中的穩(wěn)定性研究

郝丹1,尤倩倩1,郝偉1,2,梁曉琳1,袁靖琳1,李全陽1,*

(1. 廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004;2.憑祥出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣西憑祥 532600)

為了研究重組質(zhì)粒pET28a-BMP11在基因工程菌E.coliBL21(DE3)中的遺傳穩(wěn)定性,將重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-BMP11液體轉(zhuǎn)接傳至100代,每隔20代取樣觀察菌落形態(tài),檢測菌體生長量、質(zhì)粒保有率和目的蛋白表達(dá)水平,并對原代、第20代、第60代和第100代工程菌進(jìn)行了XhoⅠ和NdeⅠ雙酶切驗(yàn)證和目的基因測序。結(jié)果顯示:各代菌生長量和菌體菌落形態(tài)與原代菌株無顯著差異。在不含卡那霉素的條件下,傳代進(jìn)行到40代時,質(zhì)粒保有率和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著下降,第100代菌的質(zhì)粒保有率僅為56%。在含有卡那霉素的條件下,第80代菌仍有較高的蛋白質(zhì)表達(dá)水平,第100代菌酶切圖譜和目的基因序列仍與原代保持一致,質(zhì)粒保有率高達(dá)96%,說明利用重組大腸桿菌工業(yè)化生產(chǎn)BMP11是可行的,并且在培養(yǎng)基中添加卡那霉素能夠讓重組質(zhì)粒在傳代過程中保持穩(wěn)定,為BMP11的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和新型抗衰老食品的研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

生長分化因子11,重組質(zhì)粒,工程菌株,穩(wěn)定性

在老齡化不斷發(fā)展的今天,具有提高老年人生活質(zhì)量甚至是抗衰老作用效果的食品越發(fā)重要,生物活性肽具有成分明確、用量小、功能活性顯著等優(yōu)點(diǎn),在抗衰老食品的開發(fā)上應(yīng)該具有良好的前景[1-2],為此我們開展了有關(guān)研究。

生長分化因子11,又稱骨形態(tài)發(fā)生蛋白11(以下簡稱:BMP11),是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族的一種分泌性蛋白。TGF-β超家族分子廣泛存在于從線蟲到哺乳類動物之中,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、黏附、移行及凋亡,誘導(dǎo)軟骨形成、分化,在生物整體及各種器官的發(fā)育、損傷后修復(fù)中起著重要作用,也參與多種病理過程[3-5]。作為TGF-β超家族成員,BMP11在胚胎發(fā)育中也發(fā)揮著舉足輕重的作用[6]。目前研究發(fā)現(xiàn),BMP11能夠逆轉(zhuǎn)心肌肥大、抵抗骨骼肌衰老、改善大腦的脈管系統(tǒng)和神經(jīng)發(fā)生能力,使大腦年輕化[7-9],因此有人認(rèn)為它具有“返老還童” 的功能[10],作為一個有希望的抗衰老因子,值得深入研究,有望用于開發(fā)新型抗衰老食品。

一般情況下,工程菌中的重組質(zhì)粒具有不穩(wěn)定性,必須進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證。質(zhì)粒不穩(wěn)定性分為結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和分裂不穩(wěn)定。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變,可使目的基因功能丟失,但對質(zhì)粒主要遺傳標(biāo)記丟失影響較小。分裂不穩(wěn)定指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象,是質(zhì)粒丟失的主要原因[11]。因此,質(zhì)粒的不穩(wěn)定性會導(dǎo)致重組菌在培養(yǎng)過程中質(zhì)粒發(fā)生突變或丟失,使重組菌無法產(chǎn)出目的產(chǎn)物[12]。包含外源基因的質(zhì)粒載體導(dǎo)入工程菌中常常會帶來一系列的生理負(fù)擔(dān),影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性[13]。工程菌的遺傳穩(wěn)定性是保證外源蛋白高效表達(dá)的必備條件,對于大規(guī)模發(fā)酵和產(chǎn)物制備至關(guān)重要,同時也是食品藥品監(jiān)督管理局對基因工程產(chǎn)物評審的一個重要內(nèi)容[14]。因此,確定工程菌株的遺傳穩(wěn)定性和有限傳代次數(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中意義重大。本實(shí)驗(yàn)室以BMP11的DNA序列為模板,構(gòu)建了重組BMP11質(zhì)粒pET28a-BMP11,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),成功構(gòu)建了表達(dá)BMP11的工程菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-BMP11,并進(jìn)行了系統(tǒng)研究。為了核查該工程菌在生產(chǎn)中的穩(wěn)定性,本文對該菌株進(jìn)行了傳代培養(yǎng),并對不同代次菌株的生長特性,遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了比較分析,為該工程菌下一步投入生產(chǎn)研發(fā)抗衰老食品進(jìn)行基礎(chǔ)性的前期工作準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

大腸桿菌原始宿主菌、表達(dá)載體pET28a 諾禾致源科技股份有限公司;重組工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-BMP11 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存;限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NdeⅠ TaKaRa公司;快速小量質(zhì)粒提取試劑盒 天根公司;卡那霉素 Amresco公司;蛋白胨、酵母粉 Oxoid公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。LB液體培養(yǎng)基(1 L):胰蛋白胨10 g,酵母浸粉5 g,氯化鈉10 g,pH調(diào)至7.0,高壓蒸汽滅菌;固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉15 g;含卡那霉素(Kan+)的LB培養(yǎng)基:在LB培養(yǎng)基中添加30 μg/mL卡那霉素。

LCT-1DC-H超凈臺 濟(jì)南綠之潔科技有限公司;DH5000B生化培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司;FE20 pH計 梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司;UV5200紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司;DSX-280B蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械有限公司;ZWYR-240 恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工程菌生長曲線測定 將凍存-80 ℃冰箱中的重組工程菌菌種劃線接種于含卡那霉素的LB固體平板上,37 ℃培養(yǎng)16～18 h后,挑取工程菌單菌落接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6左右,再按1%的接種量接種于400 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 200 r/min 振蕩培養(yǎng),每隔1 h測一次OD600值,以時間為橫坐標(biāo),OD600值為縱坐標(biāo),繪制生長曲線。

1.2.2 菌種傳代方法 將凍存的重組工程菌菌種劃線接種于含卡那霉素的LB平板上,37 ℃培養(yǎng)16～18 h后,挑取單菌落接種于含卡那霉素的液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜,第2 d按1%的接種量分別接種到含卡那霉素和不含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃連續(xù)振搖培養(yǎng),每隔6 h轉(zhuǎn)管,每傳一次記一代,間隔一定時間取樣,取得不同代數(shù)的菌液。

1.2.3 質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測 采用復(fù)制平板法,分別取第0、20、40、60、80、100代菌液。稀釋10-2～10-3倍,取100 μL涂布于不含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中,37 ℃過夜培養(yǎng)。分別挑取100個單菌落到含卡那霉素的LB平板上,37 ℃過夜培養(yǎng),統(tǒng)計菌落數(shù),計算工程菌在有無卡那霉素選擇壓力下傳代時質(zhì)粒丟失率。

質(zhì)粒穩(wěn)定性(%)=含卡那霉素LB平板上的菌落數(shù)/100×100

1.2.4 菌落形態(tài)觀察和生長量檢測 上述幾代菌,在涂布平板的同時觀察菌落形態(tài)變化。同時挑菌落按革蘭氏染色方法,鏡檢觀察。分別接種單菌落到含和不含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 200 r/min 振搖培養(yǎng)12 h,測定OD600,確定工程菌生長量的變化。

1.2.5 質(zhì)粒雙酶切圖譜鑒定 在傳代過程中,分別取第0、20、60和100代含抗生素和不含抗生素(分別記作Kna+-0、Kna--0、Kna+-20、Kna--20、Kna+-60、Kna--60、Kna+-100、Kna--100,下同)的兩種菌液,用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,并用XhoⅠ和NdeⅠ進(jìn)行雙酶切,1.5%瓊脂糖電泳鑒定酶切片段,并與已驗(yàn)證成功表達(dá)的原代菌重組質(zhì)粒的雙酶切圖譜比較。

1.2.6 插入片段DNA序列測定 取第0,20,60,100代菌株送交華大基因公司進(jìn)行目的基因測序。

1.2.7 產(chǎn)物鑒定 分別取原始宿主菌和第0、20、40、60、80、100代菌液各0.5 mL,10000 r/min離心1 min,棄上清。菌體重懸于250 μL無菌水中,充分混勻,從中取40 μL加入10 μL 5倍的電泳上樣緩沖液,100 ℃水煮10 min使菌體充分裂解,6000 r/min離心3 min。取10 μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳(濃縮膠濃度12%,分離膠濃度為5%),檢測蛋白表達(dá)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用Origin 8.5軟件作圖,SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1基因工程菌生長特性

由圖1可以看出,培養(yǎng)到6 h時,菌種處于生長對數(shù)期的中段,此時菌種質(zhì)量及生理性狀較好,生長較快,因此在后續(xù)的研究中,選擇6 h為菌種的傳代時間。

圖1 工程菌生長曲線Fig.1 Growth curve of the engineering strain

2.2質(zhì)粒穩(wěn)定性

由表1可以看出,隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加,質(zhì)粒穩(wěn)定性降低。在無篩選壓力下,傳到40代時,質(zhì)粒穩(wěn)定性已經(jīng)降低了16%,傳到100代,重組菌的質(zhì)粒保有率僅為56%,降低了44%。表明重組質(zhì)粒pET28a-BMP11在無卡那霉素條件下表現(xiàn)出一定的分裂不穩(wěn)定性。這與王宏華等[15]報道的表達(dá)雞γ-干擾素基因的第100代重組大腸桿菌69%的質(zhì)粒保有率相比,穩(wěn)定性稍差。其原因可能是由于工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性與所帶外源基因的性質(zhì)、外源基因的表達(dá)水平等多種因素有關(guān),不同的質(zhì)粒各有其特性[16]。當(dāng)培養(yǎng)基中添加卡那霉素時,第100代菌的質(zhì)粒保有率仍能夠保持在96%的水平上,該結(jié)果明顯高于陳悅等[17]報道研究了產(chǎn)乙酰鳥氨酸脫乙?；富蚬こ叹倪z傳穩(wěn)定性，研究發(fā)現(xiàn)該基因工程菌在抗生素濃度為100 μg/mL的條件下生長時，質(zhì)粒穩(wěn)定性僅為86.42%。證明抗生素正向選擇壓力可以有效保持質(zhì)粒的分裂穩(wěn)定性,從而維持重組菌的重組基因穩(wěn)定性。

表1 工程菌傳代時的質(zhì)粒穩(wěn)定性Table 1 The plasmids stability of theengineering strain during subculture

2.3菌落形態(tài)和生長觀察

原代和第100代工程菌的菌落形態(tài)見圖2。

圖2 原代和100代工程菌菌落形態(tài)Fig.2 Colonial morphology of the recombinant bacterialstrain of origin strain and 100th generation strain

各代工程菌菌落直徑為1～1.5 mm的圓形隆起,外表濕潤光滑,白色,為典型的大腸桿菌菌落,各代之間無顯著區(qū)別。對各代工程菌進(jìn)行革蘭氏染色觀察,油鏡下均為革蘭陰性,兩端呈鈍圓的短桿狀,與原代工程菌形態(tài)相同,無雜菌。

各代菌株在兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h的生長情況見表2。

表2 工程菌在不同傳代次數(shù)時的生長量Table 2 The biomass of the engineering strainduring different generations(±s,n=3)

注:*:與同代含卡那霉素組相比,p<0.05。

由表2可知,含卡那霉素和不含卡那霉素兩種條件下的第0代和20代菌,有顯著差異(p<0.05)。其余各代菌兩種條件下培養(yǎng)12 h的OD600 mm均無顯著差異(p>0.05),說明卡那霉素的施加對工程菌的長勢沒有明顯影響。

2.4質(zhì)粒雙酶切圖譜鑒定

由圖3和圖4可以看出,第20代菌重組質(zhì)粒的酶切圖譜與原代并無差異,DNA序列測定結(jié)果為:

圖3 原代菌重組質(zhì)粒限制性酶切圖譜Fig.3 Restriction enzyme map ofrecombinant expression vector of origin

圖4 重組質(zhì)粒的限制性酶切圖譜Fig.4 Restriction enzyme map of recombinant expression vector 注:M-DNA Marker(DL10000);1,3,5分別為不添加抗生素的第100代、60代和20代工程菌;2,4,6分別為添加抗生素的的第100代、60代和20代工程菌。

這和原代菌序列一致。

在不含抗生素條件的情況下,傳到第60代時,酶切圖譜在342 bp的位置無條帶出現(xiàn),同時DNA序列測定顯示信號弱無法成功測序,說明隨著傳代次數(shù)的增加質(zhì)粒已經(jīng)出現(xiàn)了丟失,使得剩余的拷貝數(shù)太少以致于無法在電泳圖譜中表現(xiàn)出來。

在含有抗生素壓力的情況下,傳代進(jìn)行到第100代時(2泳道),重組質(zhì)粒的酶切圖譜和與原代幾乎保持一致,DNA序列測定結(jié)果也完全一致。這說明該工程菌在卡那霉素抗性選擇壓力下,連續(xù)傳代 100代后,質(zhì)粒幾乎沒有丟失,并且目的基因片斷blast對比與插入的目的基因片段完全一致,沒有突變。

由此可知,該工程菌具有結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性,而抗生素的壓力能夠有效地強(qiáng)化重組工程菌在傳代過程的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。因此在下一步的大規(guī)模制備中可以采用添加抗生素制備種子菌,用無抗發(fā)酵液進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的模式來降低成本同時提高安全性。

2.5產(chǎn)物鑒定

圖5中的1、2泳道分別是在含抗生素和不含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未導(dǎo)入重組質(zhì)粒的原始宿主菌E.coliBL21(DE3),3、4泳道分別是含抗生素和不含抗生素的原代工程菌液,對比1～4泳道,可以看出在相對分子量14.75 kDa處有目標(biāo)條帶出現(xiàn)。再對比5～14泳道,發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白表達(dá)水平隨著代數(shù)的增加而降低,培養(yǎng)基中添加抗生素的菌液(3、5、7、9、11、13泳道)比同代不含抗生素壓力的菌液(4、6、8、10、12、14泳道)蛋白表達(dá)水平高。在含有抗生素壓力下,第80代菌(11泳道)仍有較高的目的蛋白表達(dá)水平,采用復(fù)制平板法,發(fā)現(xiàn)此時質(zhì)粒的穩(wěn)定性為96%。無抗生素壓力下,傳代進(jìn)行到第40代菌(8泳道)時,目標(biāo)條帶掃描光密度顯著降低,暗示目的蛋白的表達(dá)水平已經(jīng)顯著降低。傳代進(jìn)行到第100代(14泳道)時,蛋白表達(dá)水平已經(jīng)很低,此時的質(zhì)粒穩(wěn)定性為56%。上述結(jié)果顯示,當(dāng)不用抗生素時,隨著傳代次數(shù)的增加,重組菌的蛋白質(zhì)表達(dá)水平和質(zhì)粒穩(wěn)定性均明顯降低,當(dāng)采用抗生素時,重組菌的蛋白質(zhì)表達(dá)水平和質(zhì)粒穩(wěn)定性在傳代過程中能夠保持穩(wěn)定,因此在進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵和產(chǎn)物制備的過程中,應(yīng)添加抗生素維持菌株的目的蛋白表達(dá)水平。

圖5 工程菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE profile of expressedproducts in recombinant E.coli注:(M-蛋白質(zhì) Marker;1、2:分別為Kan+-空菌、Kan--空菌;3～14:分別為Kan+-0、Kan--0、Kan+-20、Kan--20、Kan+-40、Kan--40、Kan+-60、Kan--60、Kan+-80、Kan--80、Kan+-100、Kan--100)。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-BMP11在傳代過程中形態(tài)特征和生長速度穩(wěn)定,在不含抗生素壓力下,傳代進(jìn)行到第40代時,質(zhì)粒穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)表達(dá)水平即顯著下降,傳至第100代時,質(zhì)粒保有率降低到56%。在添加抗生素的條件下,能夠讓該菌第80代菌仍有較高的蛋白質(zhì)表達(dá)水平,第100代菌的酶切圖譜和DNA序列與原代保持一致,質(zhì)粒保有率高達(dá)96%。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建保存的工程菌雖然具有一定的遺傳不穩(wěn)定性,但它在無抗生素選擇壓力下,連續(xù)傳代20代保持100%的分裂穩(wěn)定性,可以滿足擴(kuò)大生產(chǎn)的需要,并且可以添加抗生素來控制其重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性。該成果為下一步建立BMP11基因原核表達(dá)體系和今后的規(guī)模化生產(chǎn)提供參考,為新型抗衰老保健食品的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

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Studyonthestabilityofgrowthdifferentiationfactor(BMP11)recombinantplasmidinEscherichiacoli

HAODan1,YOUQian-qian1,HAOWei1,2,LIANGXiao-lin1,YUANJing-lin1，LIQuan-yang1,*

(1.College of Light Industry and Food Engineering,Guangxi University,Nanning 530004,China；2.Pingxiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Pingxiang 532600,China)

To investigate the hereditary stability of recombinant plasmid(pET-BMP11)in host cell(EscherichiacoliBL21(DE3)). The recombinantE.coliwas subcultured for 100 generation,samples were collected every 20 generations. Bacterial morphology,bacteria growth,plasmid stability,the target protein expressing level were analyzed. TheXhoⅠ andNdeⅠ double enzyme validation and determination of target sequence were performed on the origin,20th,60th,100thgeneration strain. The results showed that the growth characteristics and the morphology of the cultures did not show differences among the generations,in the absence of kanamycin.The plasmid stability and protein expression of 40thgeneration strain decreased significantly,and the plasmid retention rate of 100thgenerations was only 56%. In the presence of kanamycin,the 80thgeneration strain still had a high level of protein expression. The restriction enzyme map and target gene sequence of 100thwere consistent with the original ones,and the rate of plasmid retention was up to 96%. These results showed that the use of recombinantE.colito produce BMP11 was feasible,the addition of kanamycin in the medium kept the recombinant plasmid s
Table during passage,this study could provide a theoretical basis for the industrial production of BMP11 and the development of new anti-aging foods.

growth differentiation factor 11;recombinant plasmid;engineering strain;stability

TS201.3

A

1002-0306(2017)19-0114-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.022

2017-03-08

郝丹(1992-),女,碩士,研究方向:食品營養(yǎng)與健康長壽,E-mail:haodan0905@163.com。

*通訊作者:李全陽(1964-),男,博士,教授,研究方向:食品營養(yǎng)與健康長壽,E-mail:liquanyang@gxu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31371762)。