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(1.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,微生物技術(shù)國家重點實驗室,山東濟南 250100;2.重組蛋白基因檢測技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,山東博奧克生物科技有限公司,山東聊城 252000)

葡萄白藜蘆醇合酶基因的克隆與生物信息學(xué)分析

翟逸1,2,劉欽松2,吳永坤2,馬云2,張念強2,石黨委2,祁慶生1,*

(1.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,微生物技術(shù)國家重點實驗室,山東濟南 250100;2.重組蛋白基因檢測技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,山東博奧克生物科技有限公司,山東聊城 252000)

以葡萄總RNA為模板,利用RT-PCR的方法從葡萄中擴增獲得一條白藜蘆醇合酶基因完整的cDNA序列,命名為RS。利用生物信息學(xué)軟件對其核酸和蛋白質(zhì)序列進行分析,結(jié)果表明,該序列長1179 bp,與已報道的葡萄白藜蘆醇合酶基因的序列相似性達到94%～99%,氨基酸序列相似性為96%～99%;RS基因編碼392個氨基酸,氨基酸序列含有完整的芪合酶家族的特征序列GVLFGPGLT和活性中心序列GCYAGGTVLR;預(yù)測的分子量為42.78 kDa,理論等電點為6.57,不穩(wěn)定參數(shù)為35.92,在分類上屬于穩(wěn)定性蛋白;二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋、無規(guī)則卷曲以及β-折疊為主,其中α-螺旋含量為44.13%、無規(guī)則卷曲含量為26.53%,β-折疊含量為17.66%。

葡萄,白藜蘆醇合酶,基因克隆,序列分析

白藜蘆醇(Resveratrol,Rs),是植物受到外來生物或非生物等環(huán)境條件脅迫時產(chǎn)生的一種具有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物,可使植物抵抗機械損傷、紫外線照射、細菌與真菌等病原的侵染。白藜蘆醇主要存在于葡萄、花生、桑椹和虎杖等植物中[1],其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。白藜蘆醇最初是作為一種植物“殺菌素”為人所知,隨著研究的不斷深入,研究者發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇還具有抗衰老、抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病,抗神經(jīng)性病變及提高機體免疫力等多種生物活性,在食品、保健品、化妝品及生物制藥等行業(yè)中具有很大的應(yīng)用潛力和廣闊的發(fā)展前景[2-5]。

圖1 反式白藜蘆醇和順式白藜蘆醇結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure of transresveratrol(a)andcis resveratrol(b)

在植物體中,白藜蘆醇通過苯丙氨酸裂解酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H),4-香豆酸-CoA連接酶(4CL)和白藜蘆醇合酶(RS)四種酶來合成。RS是合成途徑中的關(guān)鍵酶,它催化1分子的對香豆酰-CoA和3分子的丙二酰-CoA生成1分子的白藜蘆醇[6-7]。目前,白藜蘆醇主要是從葡萄皮、葡萄籽和中藥虎杖等植物的組織中進行提取。但由于白藜蘆醇在植物組織中的含量較低,再加上受原料來源、植物生長的季節(jié)性與地域條件的限制以及提取工藝等諸多因素的影響,導(dǎo)致從植物中提取、分離高純度的白藜蘆醇成本過高。白藜蘆醇的化學(xué)合成又由于反應(yīng)過程較復(fù)雜,對環(huán)境易造成污染等不足而限制了其進一步的應(yīng)用。

近年來,隨著合成生物學(xué)與代謝工程的迅速發(fā)展,利用微生物合成具有重要應(yīng)用價值的植物源代謝產(chǎn)物越來越受到研究者的重視[8]。目前已有學(xué)者對生物合成白藜蘆醇進行了相關(guān)研究,但相對葡萄來源的白藜蘆醇合酶基因的研究相對較少[9-12]。本研究以葡萄總RNA為模板,利用RT-PCR擴增獲得了一條1179 bp的完整編碼序列RS,并對其進行了序列比對及生物信息學(xué)等相關(guān)分析,將其確定為葡萄的白藜蘆醇合酶基因,為下一步利用基因工程技術(shù)進行白藜蘆醇的生物合成提供了基因資源。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄(Vitisvinifera)葉片 取自山東九州生物產(chǎn)業(yè)園有限公司的葡萄種植園;DP432植物總RNA提取試劑盒、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞、分子量標準D2000 DNA Marker 天根生化科技(北京)有限公司;PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TaKaRa LA Taq?、Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、Takara pMDTM18-T Vector Cloning Kit、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0、T4 DNA Ligase 寶生物工程(大連)有限公司;LB培養(yǎng)基 蛋白胨10 g,酵母膏5 g,NaCl 10 g,蒸餾水1000 mL;其它試劑 分析純。

TECHNE TC-512 PCR儀 英國Bibby Scientific Ltd;DYCP水平電泳儀 北京六一儀器廠;Tanon 1600R全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng) 上海天能科技有限公司;5430R多功能臺式高速離心機 上海艾本德生物技術(shù)國際貿(mào)易有限公司;YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器、BGZ-240 電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司;DTY-5A智能恒溫循環(huán)器 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;JE203電子天平 上海浦春計量儀器有限公司;PHS-3C pH計 上海虹益儀器儀表有限公司;DTY-900 超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 葡萄葉片總RNA的提取 選取幼嫩、長勢良好的葡萄葉片,摘下后迅速放入盛有液氮的小型容器中帶回實驗室。將葡萄葉片從容器中取出,放入預(yù)先以焦碳酸二乙酯(Diethy pyrocarbonate,DEPC)水浸泡并高溫處理過的研缽中,加入適量液氮迅速研磨至粉末狀,取適量轉(zhuǎn)至無核酸酶的1.5 mL離心管中,根據(jù)植物總RNA提取試劑盒操作使用說明書提取葡萄葉片總RNA,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增引物的設(shè)計與合成 根據(jù)已報道的葡萄RS基因的序列(GenBank登錄號:NM001281044.1),利用GeneTool分別設(shè)計擴增引物,上游引物RS-1F:5′ATGGCTTCAGTCGAGGAAT3′,下游引物R:RS-1R:5′ATTTGTAACCGTAGGAATGC3′。引物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。

1.2.3 白藜蘆醇合酶基因RT-PCR擴增 以1.2.1中提取的葡萄葉片總RNA為模板,按照Prime ScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行逆轉(zhuǎn)錄,合成第一鏈cDNA;然后以合成的cDNA為模板,RS-1F:5′-ATGGCTTCAGTCGAGGAAT-3′、RS-1R:5′-ATTTGTAACCGTAGGAATGC-3′為引物,進行目的基因的PCR擴增,其反應(yīng)體系為50.0 μL,包括5.0 μL緩沖Buffer,8.0 μL的dNTPs,各5.0 μL的RS-1F、RS-1R,5.0 μL的cDNA模板,21.5 μL滅菌ddH2O和0.5 μL 的LA Taq酶;PCR擴增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性40 s、56 ℃退火40 s、72 ℃延伸110 s,35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min;反應(yīng)完畢,取適量PCR擴增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.4 目的基因的TA克隆與測序 經(jīng)電泳檢測后,以瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收目的片段。pMDTM18-T與純化片段的連接體系為:pMDTM18-T Vector 1.0 μL,純化目的片段4.0 μL,Solution I連接反應(yīng)液5 μL。將上述反應(yīng)體系緩慢混合均勻,在4 ℃條件下過夜連接。將10 μL的連接產(chǎn)物加入E.coliDH5α感受態(tài)細胞中,經(jīng)熱擊轉(zhuǎn)化后涂布氨芐抗性平板,37 ℃過夜培養(yǎng);挑取白色單克隆進行液體培養(yǎng)、質(zhì)粒提取,經(jīng)PCR擴增驗證重組質(zhì)粒中插入片段大小正確后,送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.5 RS基因序列生物信息學(xué)分析 在NCBI中利用BLAST與保守結(jié)構(gòu)域查詢(Conserved Domain Search,CD Search)在線程序等對RS基因進行序列比對及保守結(jié)構(gòu)域查詢;DNAMAN 5.22與Clustal X等生物學(xué)軟件進行多序列比對分析;RS蛋白的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)等預(yù)測通過ExPASY ProtParam Server在線服務(wù)器進行,三級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用自動建模的方式在SWISS-MODEL服務(wù)器上進行。

2 結(jié)果與分析

2.1葡萄葉片總RNA的提取

提取的葡萄葉片總RNA電泳檢測結(jié)果如圖2所示,從上往下依次為28 S、18 S和5 S的RNA。從圖中可以看出,28 S、18 S條帶完整、清晰,5 S條帶則非常暗淡。這表明提取的葡萄總RNA無降解,質(zhì)量較高,可滿足下一步目的基因擴增的實驗要求。

圖2 葡萄葉片總RNA電泳檢測Fig.2 The electrophoresis detection oftotal RNA of grape leaves

2.2白藜蘆醇合酶基因RS的克隆

將提取的葡萄葉片總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,以RS-1F和RS-1R為引物,cDNA為模板,經(jīng)PCR擴增獲得一條約1200 bp的特異性電泳條帶,如圖3所示,其大小與預(yù)期擴增產(chǎn)物(1179 bp)相符。

圖3 白藜蘆醇合酶基因RS的RT-PCR擴增Fig.3 RT-PCR amplification ofresveratrol synthase RS gene

2.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建與篩選

在凝膠成像系統(tǒng)下將2.2中的特異性擴增電泳條帶切下,純化回收后與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α并涂布在含有IPTG、X-gal和氨芐青霉素抗性的篩選平板上。培養(yǎng)后從平板上挑取白色單克隆轉(zhuǎn)接于含氨芐青霉素抗性的液體LB中過夜培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。以提取的質(zhì)粒為模板,RS-1F和RS-1R為引物,經(jīng)PCR擴增獲得一條與圖3中特異性條帶大小一致的電泳條帶,如圖4所示。這表明,目的片段已成功插入到克隆載體中,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖4 陽性克隆的PCR擴增驗證Fig.4 The verification of positive clone by PCR amplification

2.4RS基因的序列分析

陽性重組質(zhì)粒的測序結(jié)果表明,插入片段包含一個完整的開放閱讀框,片段的大小為1179 bp,將其命名為RS。在NCBI中BLAST(https://blast.ncbi. nlm.nih.gov)的序列比對結(jié)果表明,該序列與NCBI中已報道的葡萄白藜蘆醇合酶基因的序列相似性達到94%～99%,其中與NM_001281044僅有3個堿基的差異,氨基酸序列相似性為96%～99%。這表明所克隆片段為葡萄的白藜蘆醇合酶基因,其核酸與翻譯的氨基酸序列如圖5所示。

圖5 RS基因的核酸序列和翻譯的氨基酸序列Fig.5 The nucleic acid and translatedamino acid sequences of RS gene注：單劃線序列表示芪合酶活性部位,標星號的為保守氨基酸;方框中序列表示芪合酶家族的特征序列。

2.5RS基因的生物信息學(xué)分析

2.5.1 一級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析 葡萄白藜蘆醇合酶RS基因編碼的RS蛋白由392個氨基酸殘基組成,預(yù)測的分子量為42.78 kDa,等電點為6.57。計算的不穩(wěn)定參數(shù)為35.92,在分類上屬于穩(wěn)定性蛋白,這有利于后續(xù)進一步的研究工作。

2.5.2 RS基因結(jié)構(gòu)域分析 白藜蘆醇合酶屬于芪合酶家族,通過NCBI在線軟件對RS基因氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果如圖5所示。該氨基酸序列具有完整的芪合酶家族的特征序列GVLFGPGLT,同時具有芪合酶家族活性中心序列GCYAGGTVLR,其中Cys164為芪合酶家族中保守的催化活性氨基酸,在酶的催化作用中具有重要的功能。

2.5.3 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析 ExPASY ProtParam Server在線服務(wù)器對RS蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出,該RS蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋、無規(guī)則卷曲以及β-折疊為主,其中α-螺旋含量為44.13%、無規(guī)則卷曲含量為26.53%,β-折疊含量為17.66%。

圖6 RS蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 The predicted secondary structure of RS protein注：h:α-螺旋;c:無規(guī)則蜷曲;e:β-折疊。

2.5.4 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析 將RS蛋白序列在SWISS-MODEL服務(wù)器中經(jīng)BLAST比對搜索,獲得了一條序列相似性為96.43%的模板3tsy.1.A,如圖7所示。采用自動建模方式,以3tsy.1.A為模板預(yù)測RS蛋白的三級結(jié)構(gòu)如圖8。從圖中可以看出,在該結(jié)構(gòu)中含有較多的α-螺旋和無規(guī)則卷曲,這也與2.5.3中RS蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符合。

圖7 模板3tsy.1.A三級結(jié)構(gòu)Fig.7 Tertiary structure of template 3tsy.1.

圖8 預(yù)測的RS蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.8 Predicted tertiary structure of RS protein

3 結(jié)論

白藜蘆醇合酶(EC 2.3.1.95)又被稱為3,4,5-三羥基二苯乙烯合酶,是芪合酶(Stiibene Synthase,STS)家族中的一種,它以4-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A為底物合成白藜蘆醇[13]。本研究通過RT-PCR擴增從葡萄總RNA中獲得一條長度為1179 bp的基因片段,命名為RS,其在GenBank中的登錄號為:KX688208。該基因片段的核酸和氨基酸序列與NCBI中已報道的葡萄來源的白藜蘆醇合酶相似性分別達到94%～99%和96%～99%,并且具有典型的芪合酶家族特征序列GVLFGPGLT和活性中心序列GCYAGGTVLR。這些結(jié)果表明文中分離的RS基因為葡萄的白藜蘆醇合酶基因,為下一步利用基因工程的方法進行生物合成白藜蘆醇奠定了基礎(chǔ)。

[1]Langcake P,Pryce R. The production of resveratrol byVitisviniferaand other members of the vitaccae as a response to infection or injury[J]. Physiological and molecular plant pathology,1976,9(1):77-86.

[2]Whitlock N C,Baek S J. The anticancer effects of resveratrol:modulation of transcription factors[J]. Nutrition and cancer,2012,64(4):493-502.

[3]Sun A Y,Wang Q,Simonyi A,et al. Resveratrol as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases[J]. Molecular neurobiology,2010,41:375-83.

[4]Li W,Xiaoqian Ma X Q,Li N,et al. Resveratrol inhibits Hexokinases II mediated glycolysis in non-small cell lung cancer via targeting Akt signaling pathway[J]. Experimental Cell Research,2016,349(2):320-327.

[5]Ozcan P,Ficicioglu C,Kizikale Q,et al. Protective effect of resveratrol against oxidative damage to ovarian reserve in female Sprague-Dawley rats[J]. Reproductive biomedicine,2015,31(3):404-410.

[6]Vogt T. Phenylpropanoid biosynthesis[J]. Molecular Plant,2010,(3):2-20.

[7]Ferrer J L,Austin M B,Stewart J C,et al. Structure and function of enzymes involved in the biosynthesis of phenylpropanoids[J]. Plant physiology and biochemistry,2008,46:356-70.

[8]戴住波,朱欣娜,張學(xué)禮. 合成生物學(xué)在微生物細胞工廠構(gòu)建中的應(yīng)用[J]. 生命科學(xué),2013,25(10):943-949.

[9]Watts K,Lee P,Schmidt D C. Biosynthesis of plant specific stilbene polyketides in metabolically engineeriedEschrichinacoli[J]. BMC Biotechnology,2006,6(22):1-12.

[10]梁景龍,郭麗瓊,孫萍,等. 產(chǎn)白藜蘆醇大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(23):138-141.

[11]汪建峰,張嗣良,王勇. 大腸桿菌中從頭合成白藜蘆醇途徑的設(shè)計及優(yōu)化[J]. 中國生物工程雜志,2014,34(2):71-77.

[12]Schwekendiek A,Pfeffer G,Kindl H. Pine stilbene synthase cDNA,a tool for probing environmental stress[J]. Febs Letters,1992,13,301(1):41-44.

CloningandsequenceanalysisofaresveratrolsynthasegenefromVitisvinifera

ZHAIYi1,2,LIUQin-song2,WUYong-kun2,MAYun2,ZHANGNian-qiang2,SHIDang-wei2,QIQing-sheng1,*

(1.State Key Laboratory of Microbial Technology,College of Life Science,Shandong University,Jinan 250100,China;2.State and Local Joint Engineering Laboratory of Recombinant Protein and Gene Detection Technology,Shan dong Boaoke Biotechnology Co.,Ltd.,Liaocheng 252000,China)

A complete cDNA sequence of resveratrol synthase gene was obtained fromVitisviniferatotal RNA by RT-PCR method,named RS. The results of multiple sequence alignment showed that RS was of 1179 bp with 94%～99% nucleic acid sequence similarity and 96%～99% amino acid sequence similarity to the reportedVitisviniferaresveratrol synthase,respectively. Domain analysis results revealed that the characteristics sequences GVLFGPGLT and the active site sequences GCYAGGTVLR of stilbene synthase family were found in cloned RS amino acids sequence. The predicted molecular weight was of 42.78 kDa and the theoretical isoelectric point was of 6.57. The calculated instability parameter was of 35.92,which indicated that this protein was s
Table in classification. The secondary structure of resveratrol synthase mainly containedα-helix,random curling andβ-sheet,which content was of 44.13%,26.53% and 17.66%,respectively.

Vitisvinifera;resveratrol synthase;gene clone;sequence analysis

TS201.3

A

1002-0306(2017)19-0096-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.018

2017-04-14

翟逸(1980-)，男，博士，研究方向：微生物分子生物學(xué)與基因工程，E-mail:zhaiyi1218@163.com。

*通訊作者:祁慶生(1966-)，男，博士，教授，研究方向：微生物合成與代謝調(diào)控，E-mail:qiqingsheng@sdu.edu.cn。