趙 銘，甘秋良，李俊麗，劉澤文，孫慧倫

(武漢理工大學生物技術系，湖北 武漢 430070)

納米氧化鐵對豇豆生長及其抗氧化系統(tǒng)的影響

趙 銘，甘秋良，李俊麗*，劉澤文，孫慧倫

(武漢理工大學生物技術系，湖北 武漢 430070)

研究納米氧化鐵對豇豆幼苗的生理生長的影響。以豇豆為對象，從植物生理生長、根系活力、脂質(zhì)過氧化作用以及抗氧化酶系的活力水平4個方面研究了不同濃度的納米氧化鐵對豇豆幼苗產(chǎn)生的影響，并以Fe2+處理組作為對照研究納米氧化鐵對植物生長潛在的促進效應以及劑量依賴性,同時通過熒光顯微鏡觀察熒光納米氧化鐵處理的豇豆幼苗以研究納米粒子的轉(zhuǎn)運。結(jié)果表明，不同濃度的納米氧化鐵對豇豆的生長發(fā)育有著不同的影響，低濃度的納米氧化鐵對豇豆幼苗的生長有一定的促進作用，高濃度的納米氧化鐵和Fe2+對豇豆幼苗的生長有抑制作用，呈現(xiàn)出一定的植物毒性。豇豆根部對納米氧化鐵進行了吸收并運輸?shù)紧沟那o部，并有一定含量的積累。納米氧化鐵可嘗試應用于豇豆的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動，但在此之前須進一步開展其存在的環(huán)境、生態(tài)與人體健康風險研究。

納米氧化鐵；豇豆；植物生理

納米級結(jié)構(gòu)材料簡稱為納米材料，具有與一般材料所不同的獨特理化性能，表現(xiàn)出許多優(yōu)異的性能和全新的功能，已在許多領域展示出廣闊的應用前景[1]。近些年來隨著納米科技的迅速發(fā)展，納米材料的影響已經(jīng)滲透到人類生活的各個領域，給人類的生活帶來了不容忽視的影響[2]。正是由于納米粒子的特性，使得其能夠很容易進入生物體，并且和生物體中的組織、細胞、生物大分子相互作用，對生物產(chǎn)生一定的影響。納米級污染物在環(huán)境中存在的濃度一般較低，但它們一旦被攝入后即可長期結(jié)合潛伏，不斷積累增大濃度，終致產(chǎn)生顯著毒性效應[3]。植物是自然界的生產(chǎn)者，也是生物富集的起點。通過食物鏈逐級高位富集，可導致高級生物的毒性效應。研究納米粒子對植物的影響可以幫助更好的使用納米粒子。納米顆粒(Nanoparticles,NPs)對植物生理影響的研究涉及納米顆粒對根伸長的影響居多，大部分研究發(fā)現(xiàn)金屬和金屬氧化物納米顆粒對根伸長有抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)不同表面修飾的納米氧化鋁對根伸長有不同的影響[4]。有研究結(jié)果表明高濃度的Zn和ZnO納米顆粒懸浮液分別對黑麥草和玉米發(fā)芽率有抑制作用，不同納米顆粒對不同植物根伸長抑制作用不同，2000 mg/L的Zn和ZnO納米顆粒完全抑制根的伸長[5]。也有實驗表明在濃度為2000 mg/L時,納米CeO2對植物根伸長沒有影響，而納米La2O3、Cd2O3、Yb2O3對7種植物的根伸長均有顯著抑制作用[6]。Stampoulis等研究了ZnO、Ag和Cu納米顆粒對西葫蘆發(fā)芽率的毒性作用，發(fā)現(xiàn)這些納米顆粒釋放的離子抑制了植株生長[7]。根據(jù)上述研究可見不同的納米粒子對于不同的植物有著不同程度的影響，而這種影響程度的大小與納米粒子本身的性質(zhì)和其分散在水溶液中后形成的溶液的濃度有著較高的相關性。本實驗以豇豆和納米氧化鐵為主要研究對象，并從植物生理生長、根系活力、脂質(zhì)過氧化作用以及抗氧化酶系的活力水平四個方面研究了不同濃度的納米氧化鐵對豇豆幼苗的生理生長所產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 植物幼苗的準備與處理

取150粒去皮的豇豆種子(種子取自湖北省農(nóng)科院)于無菌水中浸泡1.5 h，加入70 %乙醇浸泡30 s，再用無菌水洗滌3次，于5 %次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，用無菌水洗滌3次后置于珍珠巖中避光室溫下發(fā)芽，選取長勢一致的移入霍格蘭式液中。納米材料為納米磁性氧化鐵(γ-Fe2O3，于麥克林購買)、20 nm、球形、99.5 %。將納米粒子用超聲振蕩的方式分散到去離子水中形成均一穩(wěn)定的水溶液。將納米氧化鐵母液分別加入到水培盒中使其終濃度為20、50、100 mg/L，另一個空白對照，一個加入50 μmol/L硫酸亞鐵做對照；標記后放入人工氣候箱中培養(yǎng)，濕度60 %。生長至兩葉一心后進行各項生理指標測定。

1.2 各項生理指標的測定方法

超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定：采用氮藍四唑光還原法測定[8]。過氧化物酶(POD)活性的測定：采用愈創(chuàng)木酚法測定[8]。過氧化氫酶(CAT)活性的測定：參照張亞宏等的方法[9]。丙二醛(MDA)含量測定用硫代巴比妥酸(TBA)反應法[10]。采用2，2’-聯(lián)吡啶比色法[11]測定豇豆根細胞原生質(zhì)膜上Fe3+的還原酶活性。葉綠素含量的測定：取新鮮葉片，用蒸餾水洗凈、揩干，研磨成漿，采用乙醇提取、分光光度法測定?？扇苄缘鞍缀康臏y定：采用考馬斯亮藍G-250染色法[12]?？扇苄蕴呛康臏y定采用蒽酮比色法[13]。

以上所有試驗設置3個平行。采用獨立樣本t-檢驗法檢驗實驗組和對照組的差異性，可信度為95 %。

1.3 熒光切片觀察

被熒光分子修飾了的氧化鐵納米粒子在紫外光下顯青色，而豇豆本身顯藍色，通過豇豆的熒光檢測可以研究納米氧化鐵粒子是否在豇豆中運輸?shù)幕蛘呤鞘欠裨隰贵w內(nèi)發(fā)生了離子轉(zhuǎn)化。根據(jù)實驗室已建立的熒光納米粒子制備技術，制備符合要求的熒光納米氧化鐵粒子，并添加到豇豆幼苗的培養(yǎng)液中，于避光條件下培養(yǎng)一段時間。選取熒光納米氧化鐵條件下培養(yǎng)過的豇豆植株進行切片，分別取根尖、成熟區(qū)以及莖部進行橫切或縱切進行熒光觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米氧化鐵對抗氧化酶活力的影響

抗氧化酶系包括SOD，POD，CAT等多種酶的植物抗氧化應激系統(tǒng)，當植物受到外界脅迫，體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基離子時候，這些抗氧化保護酶就會清除產(chǎn)生的自由基，以減輕對植物的毒性作用，抗氧化酶的活性直接反映了植物組織或細胞受到脅迫的一個程度[14]。施加了納米氧化鐵的豇豆幼苗與對照組的SOD活性沒有明顯的差異，但50 mg/L的納米氧化鐵處理組相對于20 mg/L處理組的SOD活性要高，說明納米氧化鐵產(chǎn)生的氧化脅迫隨著其濃度的升高而增大，但當納米粒子的濃度過高，產(chǎn)生的超氧陰離子濃度過高，超過了SOD的清除能力，此時植株采取其他方式去應對這種高氧化脅迫，因此100 mg/L納米氧化鐵處理下的SOD的活力有所下降，但仍在發(fā)揮作用(圖1a)。施加了20和50 mg/L納米氧化鐵的處理組的POD的活力相對于對照組分別低42.35 %和31.01 %。100 mg/L納米氧化鐵處理組POD活性與對照組無明顯差異(圖1b)?？赡茉谶@種高濃度的納米氧化鐵的影響下，由SOD清除超氧陰離子產(chǎn)生的過氧化氫更多的是由CAT來分解，這與圖1c中所展示的相一致。Fe2+處理下POD活性比對照高(圖1b)，此時在沒有納米氧化鐵的情況下，則是由POD來分解過氧化氫。20和50 mg/L納米氧化鐵處理下CAT活性與對照組沒有明顯差異，100 mg/L時CAT活性明顯高于對照組。CAT活性的升高說明豇豆植株增強抗氧化系統(tǒng)除去多余的活性氧。Fe2+處理下CAT活性比對照低(圖1c)。在這3種酶組成的抗氧化體系中，SOD和CAT存在著協(xié)同效應[15]，可以推測POD和CAT同時在對SOD清除產(chǎn)氧陰離子產(chǎn)生的過氧化氫進行分解。

圖1 不同處理條件下豇豆3種抗氧化酶的活性Fig.1 Activity of three kinds of antioxidant enzymes

2.2 納米氧化鐵對MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量可以表示膜脂過氧化的程度。過量的活性氧會引發(fā)或是加劇膜脂過氧化，造成細胞膜系統(tǒng)損傷，干擾植物正常的代謝過程。SOD酶，POD酶還有CAT酶在過量活性氧的堆積下，酶活和脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)被破壞，就會導致丙二醛的含量升高[16]。隨著納米氧化鐵的濃度的增大，MDA的含量明顯上升，與抗氧化酶系活力所呈現(xiàn)的結(jié)果一致，隨著納米氧化鐵濃度的增高，納米氧化鐵對豇豆產(chǎn)生的氧化脅迫也隨之相應的增大，在100 mg/L時對豇豆造成的氧化損傷最大。50 μmol/L的Fe2+產(chǎn)生的氧化損傷與50 mg/L納米氧化鐵產(chǎn)生的氧化損傷沒有明顯差異(圖2)。低濃度的納米氧化鐵所產(chǎn)生的脅迫在豇豆能抵抗的范圍之內(nèi)，所以產(chǎn)生的氧化損傷也相對較小，但當濃度過高，超過了豇豆本身的抵抗能力，就會傷害到植株。在不含鐵元素的對照組中，缺鐵的逆境也會導致豇豆幼苗產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用，而Fe2+處理組也有較高的MDA含量，這與預期不相符，其原因可能是相對于處理前的生長環(huán)境，大量的營養(yǎng)元素在短時間內(nèi)形成了一個逆境，使得MDA含量較高。

圖2 不同處理條件下豇豆MDA含量Fig.2 MDA contents of cowpea under different treatments

2.3 納米氧化鐵對Fe3+還原酶活性的影響

鐵在一系列的生理活性中扮演者重要的角色，如O2的運輸，DNA的合成，以及電位傳導；因此鐵的攝取在生命體的生命活動中是一個相當重要的環(huán)節(jié)。在正常的生理pH值和氧含量下，鐵元素一般是以可溶性的Fe(Ⅲ)的形式存在的，因此即使生命體攝取了Fe(Ⅱ)，其在正常的生理狀態(tài)下也是不穩(wěn)定的[17]。20和100 mg/L的納米氧化鐵處理組的Fe3+還原酶活性明顯高于50 mg/L的納米粒子處理組(圖3)，可能在數(shù)據(jù)測量的過程中出現(xiàn)了操作失誤導致50 mg/L處理組數(shù)據(jù)不準確，但總體來看，納米氧化鐵會使得豇豆根系Fe3+還原酶升高，說明了納米氧化鐵在缺鐵脅迫下可以起到一定的補鐵作用。對照組由于處于缺鐵的逆境下，豇豆幼苗為了獲取足夠的鐵來維持正常的生長，所以Fe3+還原酶活力比較高。在Fe2+處理組，由于能滿足豇豆生長對鐵元素的需求，并且是植株能夠直接吸收的Fe2+，所以Fe3+還原酶相對的較低。

圖3 不同處理條件下豇豆根系Fe3+還原酶活Fig.3 Fe3+ reductase contents of cowpea root under different treatments

2.4 納米氧化鐵對葉綠素含量的影響

葉綠素是植物吸收光能進行光合的色素,在一定范圍內(nèi),光合強度隨其含量增加而加強。因此它是反映植物豐產(chǎn)性能的生理指標之一。植物葉片葉綠素含量是表征植株體內(nèi)鐵營養(yǎng)狀況的重要指標。隨著納米氧化鐵濃度的增大，葉綠素的含量有很明顯的升高，相比于50 μmol/L Fe2+的對照組也有明顯的升高(圖4)，說明納米氧化鐵對于豇豆的生長有一定的促進效應，結(jié)合之前的Fe3+還原酶活性分析，在100 mg/L納米氧化鐵處理下的豇豆的Fe3+還原酶活性比較的高，也說明納米氧化鐵促進了植物對鐵元素的吸收。另外納米氧化鐵處理的豇豆葉綠素含量高于Fe2+對照組(P<0.01)，說明同樣濃度下，納米氧化鐵可能較Fe2+對照組更有利于豇豆的生長，所具有的植物毒性也較小。

2.5 納米氧化鐵對可溶性糖含量的影響

可溶性糖是衡量植物碳素代謝的一個重要指標，當植物處于逆境時，體內(nèi)的可溶性平衡就會發(fā)生變化，以適應外界環(huán)境條件的變化[18]。50 mg/L納米氧化鐵處理的豇豆葉子中可溶性糖含量最高，在納米氧化鐵濃度較低時，隨著濃度的增加，可溶性糖含量增加，但納米氧化鐵濃度過高后對可溶性糖含量反而下降(圖5)，可能原因是過高的納米氧化鐵濃度對植物造成的膜損傷較嚴重，這一點與之前的MDA含量分析相符，即導致了葉綠體的損傷，所以在100 mg/L的納米氧化鐵處理下有著較高的葉綠素含量，但是可溶性糖的合成依舊不足，所以導致了含量的下降。

圖4 不同處理條件下的豇豆葉綠素含量Fig.4 Chlorophyll contents of cowpea under different treatments

圖5 不同處理條件下的可溶性糖含量Fig.5 Soluble sugar contents of cowpea under different treatments

2.6 納米氧化鐵對可溶性蛋白含量的影響

蛋白質(zhì)作為細胞結(jié)構(gòu)的重要組成部分，是生命的體現(xiàn)者，蛋白質(zhì)參與細胞的任何新陳代謝活動。蛋白質(zhì)含量在生物體內(nèi)維持著一定程度的代謝平衡，而當植物發(fā)育、衰老或是受到外界脅迫時，這一平衡會有所波動[19]。在低濃度下，隨著納米氧化鐵濃度的增加，可溶性蛋白質(zhì)含量減少(圖6)，可能是由于當納米氧化鐵濃度升高時，納米粒子在根表面吸附的量增大，阻礙了營養(yǎng)元素如N、S的吸收，使得蛋白質(zhì)的合成量降低，但細胞新陳代謝在合成蛋白的同時，也會消耗部分的蛋白質(zhì)，合成量減少就導致50 mg/L納米氧化鐵處理的豇豆體內(nèi)積累的蛋白質(zhì)總量比低濃度納米氧化鐵處理的豇豆體內(nèi)可溶性蛋白總量要少。但在100 mg/L處理組中，可溶性蛋白含量反而較高(圖6)，這可能是由于過高的納米粒子濃度導致的膜損傷釋放出了較多的蛋白，同時植物為了應對這種高氧化脅迫，其體內(nèi)的多種酶的含量也有所上升。因此100 mg/L納米氧化鐵處理下的可溶性蛋白含量急劇上升。

2.7 豇豆對納米氧化鐵的吸收蓄積

被熒光分子修飾了的氧化鐵納米粒子在紫外光激發(fā)下顯青色，而豇豆自身則顯藍色，熒光納米氧化鐵主要存在于細胞間隙(圖7a、圖7b)，說明熒光納米氧化鐵能夠進入根里面，同時從上皮層運輸?shù)狡べ|(zhì)層主要是通過質(zhì)外體途徑。部分熒光納米氧化鐵經(jīng)過根運輸?shù)搅唆沟那o，沿質(zhì)外體途徑運輸?shù)角o以后主要通過莖的維管束繼續(xù)往上運輸(圖7c)，熒光納米氧化鐵在莖中連續(xù)運輸，且含量較高(圖7c’)，當納米氧化鐵運輸?shù)角o的上部分，主要分布在細胞間隙(圖7d)，說明熒光納米氧化鐵主要通過質(zhì)外體途徑繼續(xù)往上運輸。根部熒光顯微觀察說明熒光納米氧化鐵通過豇豆的根尖部分進入植株體內(nèi)，通過質(zhì)外體途徑不斷向上運輸，運輸?shù)角o時已有大量熒光納米氧化鐵的積累。

圖6 不同處理條件下的可溶性蛋白含量Fig.6 Soluble protein contents of cowpea under different treatments

圖7 根部熒光顯微觀察Fig.7 Fluorescence microscopic observation of the root

3 討 論

通過對豇豆幼苗Fe3+還原酶活、葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)和糖含量及SOD、POD、CAT酶活性等生理指標的測定，結(jié)果顯示相同低濃度下，納米氧化鐵較Fe2+更有利于豇豆幼苗的生長，而隨著納米氧化鐵濃度的增加，產(chǎn)生了劑量相關的不同程度的氧化損傷，高濃度時可抑制植物的生長，呈現(xiàn)一定的植物毒性。熒光顯微實驗也表明納米氧化鐵處理后的豇豆莖以及根尖的細胞結(jié)構(gòu)變化，納米氧化鐵可以通過豇豆的根部進行吸收并連續(xù)的運輸?shù)紧沟那o甚至一直往上運輸，并且在根部沒有納米氧化鐵的積累，而在莖會發(fā)生納米氧化鐵的積累。

4 結(jié) 論

低濃度的納米氧化鐵可嘗試運用于豇豆的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，尤其在缺鐵的環(huán)境時可以用作鐵肥。但考慮到納米顆粒對人體健康和環(huán)境存在的風險，將來必須進一步開展氧化鐵納米物質(zhì)存在的人體健康、生態(tài)、環(huán)境的風險研究。

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(責任編輯 李山云)

EffectofNano-ironOxideonGrowthofCowpeaSeedlingsandRelevantAntioxidantResponse

ZHAO Ming，GAN Qiu-liang，LI Jun-li*，LIU Ze-wen，SUN Hui-lun
(Wuhan University of Technology department of Biotechnology，Hubei Wuhan 430070,China)

In order to study the effects of iron oxide nanoparticles on the physiological growth of cowpea seedlings,taken a cowpea as tested objects,the effects of different contents of iron oxide nanoparticles on the production of cowpea seedlings in plant physiological growth, root activity,lipid peroxidation and the activity of antioxide enzyme were studied,Fe2+treatment was set as a positive control to research the effect of iron oxide nanoparticles on the potential promotion of cowpea seedling growth and its dose dependent,meanwhile cowpea seedlings treated with fluorescent iron oxide nanoparticle were observed by the fluorescent microscope. The result showed that the cowpea seedlings had different responses to iron oxide nanoparticles under various concentrations,the low concentration of iron oxide nanoparticles had some positive effects on cowpea seedlings, and the high concentration of iron oxide nanoparticles and Fe2+partly inhibited the growth of cowpea seedlings and indicated a certain toxicity to plants. The iron oxide nanoparticle absorbed by the roots of cowpea and then transported to the stem of cowpea which subsequently accumulated to certain contents was found.It is possible that iron oxide nanoparticles are used as iron fertilizer in agricultural industry, but the risk of nanoparticles to the environment, ecology and human health must be studied first.

Iron oxide nanoparticles；Cowpea；Plant physiology

1001-4829(2017)3-0547-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.011

S643.4

A

2016-03-10

國家自然科學基金青年基金項目(31301735)；國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(20161049720006)

趙 銘(1995-)，男，湖北宜昌人，主要研究方向為生物技術，E-mail:940970188@qq.com，Tel：15629030259，*為通訊作者：李俊麗(1980-)，女，湖北武漢人，博士，納米生物效應，E-mail:lijunli0424@sina.com，Tel：18971243840。