趙 艷，劉曉鑫，翟 瑩，曹 慧， 吳 瓊

(1. 齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.中種國際種子有限公司長春分公司，吉林 長春 130113)

大豆lox2基因表達方式分析及其啟動子預測

趙 艷1，劉曉鑫2，翟 瑩1，曹 慧1， 吳 瓊1

(1. 齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.中種國際種子有限公司長春分公司，吉林 長春 130113)

在不同逆境脅迫、激素條件下,檢測大豆各器官中l(wèi)ox2基因表達方式，并對其啟動子的序列及功能進行預測。利用qPT-PCR方法，檢測大豆lox2基因表達方式；此外，通過PCR方法，克隆獲得大豆lox2基因5’端上游序列，利用啟動子在線軟件進行預測分析。結果表明，該基因受干旱誘導，誘導表達量隨處理時間增強；在鹽、低溫、ABA條件處理下，誘導表達下降，下降的表達量不隨處理時間而變化。大豆lox2基因在大豆根、莖、葉、花中的相對表達量低，而在種子中的相對表達量高。克隆獲得大豆lox2基因5’端上游2016 bp序列，命名為LP。在線軟件預測分析，表明LP序列中含有多種典型的種子特異表達元件，如SEF3motif、SEF4 motif、E-box、AACACA、ACGT、Skn-1 motif、AATAAA等；及與逆境、激素誘導相關的元件，如LTR、MBS、W-box、AAAG-motif、ABRE等。推測大豆LP啟動子具有調控下游基因大量表達在種子中的特性，同時具有受脫落酸及其它逆境誘導表達的特性。

大豆；lox2基因；啟動子；克隆

大豆是我國重要的經(jīng)濟作物，籽粒中含有豐富的蛋白質、脂類和多種營養(yǎng)元素，磷、鐵、鈣礦質比其他作物高幾十倍，并含有多種維生素, 特別是大豆中含有人體不能合成的8 種必需氨基酸，是其他谷類作物不能比擬的。自大豆基因組測序后，現(xiàn)已進入大豆功能基因組研究，主要集中在對基因及調控元件如啟動子等的研究中，對大豆中基因表達方式的研究有助于基因功能的研究；對啟動子的研究能夠從本質上揭示基因表達方式的原因，有助于啟動子功能的研究，為大豆基因工程研究提供有利工具。

脂肪氧化酶(Lipoxygenase，簡稱脂氧酶，Lox) 在動植物界中廣泛存在，在真核生物中參與不飽和脂肪酸的代謝，且在動植物不同發(fā)育階段存在著不同的類型[1]。最早在大豆種子中獲得，大豆種子中含有豐富的Lox(占種子蛋白質含量的1 %～2 %)，可催化不飽和脂肪酸的加氧反應[2]?，F(xiàn)已從大豆種子中分離出Lox1、Lox2和Lox3(包含Lox3a和Lox3b) 3種不同性質的同工酶[3]?，F(xiàn)今對Lox的研究主要集中在糧食作物、谷類作物種子研究中，如大豆種子Lox能直接與蛋白質和氨基酸結合，產(chǎn)生豆腥味、苦澀味，降低食品風味和營養(yǎng)品質[4]；在水稻種子中，Lox是稻谷陳化變質的關鍵酶，進而導致種子衰老和陳化變質[5]；在小麥中，過高的Lox活性會加快脂質的氧化反應，使籽粒氧化變質，從而使其儲存期變短，造成糧食損失，及麥類食品的營養(yǎng)價值下降[6]。為避免lox基因的表達，提高作物種子應用品質及利于貯藏，現(xiàn)已從遺傳育種的角度開展了一些缺失體品種的選育研究[7]。但lox基因在不同環(huán)境條件下或大豆器官中的表達情況如何，顏克亮等[8]，利用抑制性消減雜交技術和半定量PCR，發(fā)現(xiàn)lox2基因在種子胚中高表達，但lox基因在不同環(huán)境條件下的表達情況，未有相關報道。為更明確大豆lox2基因在逆境脅迫、激素、大豆各器官中的表達方式，本研究中根據(jù)NCBI中大豆lox2基因序列，利用qRT-PCR方法，檢測lox2基因在鹽、干旱、低溫、脫落酸(ABA)及在大豆根、莖、葉、花和種子中的相對表達量；并克隆lox2基因5’端上游序列，利用啟動子在線預測軟件對lox2基因啟動子的表達方式進行分析。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大豆品種吉豆2號為齊齊哈爾大學分子生物學實驗室保存；大腸桿菌DH 5α感受態(tài)購自北京索萊寶公司；TRIzol reagent 購自Invitrogen公司；Oligo(dT)18、M-MLV反轉錄酶、Recombinant RNase Inhibitor、ExTaq、pMD18-T克隆載體、SYBP Premix Ex TaqⅡ熒光定量試劑盒、限制性內(nèi)切酶PstI 和NcoI均購自Takara公司；DNA凝膠回收試劑盒購自維特潔公司；引物合成、測序由北京六合華大基因公司完成。

1.2 大豆材料處理

逆境及激素條件下材料處理：將大豆水培幼苗分別置于含有NaCl (200 mmol·L-1) 和PEG8000(20 %)的Hoaglands營養(yǎng)液中進行鹽和干旱脅迫處理；大豆幼苗置于4 ℃培養(yǎng)箱中進行低溫處理；對大豆水培幼苗噴施脫落酸(200 μmol·L-1，ABA)[9]。在處理0、1、2、5、10、24 h分別取樣，迅速放于液氮中，置-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

各器官的取材：分別取大豆根、莖、葉、花、未成熟種子(開花后30 d，30DAF)和成熟種子(90DAF)，迅速放于液氮中，置-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 QRT-PCR

根據(jù)RNA提取試劑盒步驟，提取大豆各種備用材料的總RNA；以總RNA為模板，按照逆轉錄的步驟分別合成cDNA的第一條鏈，進行qRT-PCR反應。以大豆持家基因β-tubulin(GMU12286)為內(nèi)參，內(nèi)參引物分別為(T1: 5’-GGAAGGCTTTCTTGCATTG GTA-3’; T2: 5’- AGTGGCATCCTGGTACTGC-3’)[10]。根據(jù)NCBI中，大豆lox2基因的核苷酸序列(L06038.1)，利用Primer Premier 5.0 軟件設計檢測該基因的引物，上游引物(QF: 5’-AAGAGGAGGAAAGCCGTGAA-3’)和下游引物(QR:5’-GAATCAAAGTGGCGAGGAGAC-3’)。利用BIO-RAD CFX96實時定量PCR儀，反應循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s。每次取樣點設3次技術重復，實驗共設3次生物學重復[11-12]。

1.4 大豆lox2 基因啟動子序列的克隆及預測分析

取大豆幼苗葉片0.1 g為材料，采用CTAB法提取大豆的基因組DNA[13]。根據(jù)大豆基因組序列(http://www.phytozome.net/soybean)和NCBI中大豆lox2基因序列，設計特異引物擴增大豆lox2基因ATG的5’ 端上游序列。PCR擴增中的上游、下游引物分別帶有PstI與NcoI酶切位點，上游引物為LF:5’-GGGCTGCAGTTATGGCTTCTTGTTTGTCTTA C-3’，下游引物為LR:5’-GGGCCATGGCTTTGCCAAAACCTACCAATAAC-3’。PCR反應條件為預變性95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃后延伸7 min。將PCR擴增片段切膠回收并連接到pMD18-T克隆載體上，獲得重組質粒，鑒定后進行測序。利用DNAMAN軟件進行同源性比對。在線啟動子分析軟件PlantCARE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.htmL)分析啟動子序列中存在的順式作用元件。

2 結果與分析

2.1 大豆lox2基因的誘導表達分析

利用qRT-PCR方法，在干旱(PEG)、鹽(NaCl)、低溫(4 ℃)和激素(ABA)不同條件時間處理下，對大豆lox2基因的相對表達量進行分析。結果顯示：大豆lox2基因在干旱脅迫下，相對于對照，表達量先降低，5 h后，隨著處理時間的延長，表達量逐漸升高，當處理24 h，相對表達量為7.47，說明大豆lox2基因受干旱誘導，且誘導表達量隨處理時間增強(圖1)。

大豆lox2基因在鹽條件處理下，相對于對照，當處理為1 h，相對表達量下降30 倍左右，以后的2、5、10 和24 h 處理時間下，相對表達量與處理1 h的表達量變化不大(圖2)。大豆lox2基因在低溫、ABA條件處理下，表現(xiàn)出與鹽處理條件下相似的規(guī)律(圖3～4)。說明大豆lox2基因受鹽、低溫、ABA誘導，誘導表達下降，下降的表達量不隨處理時間而變化。

圖1 干旱脅迫下lox2基因的表達Fig.1 Expression of lox2 gene under drought stress

圖2 鹽脅迫下lox2基因的表達Fig.2 Expression of lox2 gene under salt stress

圖3 低溫脅迫下lox2基因的表達Fig.3 Expression of lox2 gene under cold stress

圖4 ABA誘導lox2基因的表達Fig.4 Expression of lox2 gene under ABA induction

2.2 大豆lox2基因的器官表達分析

利用qRT-PCR方法，大豆持家基因β-tubulin為內(nèi)參，對大豆根、莖、葉、花、未成熟種子和成熟種子中l(wèi)ox2基因的相對表達量進行分析。結果顯示(圖5)：大豆lox2基因在大豆根、莖、葉、花中的表達低，相對于葉中的表達量，大豆lox2基因在根、莖、花中表達活性分別為5.48，0.12，0.46；而在大豆種子中，尤其是未成熟種子中的相對表達活性高，相對于葉中的表達量，大豆lox2基因在未成熟種子和成熟種子中的表達活性分別為125.54 和26.84。

圖5 大豆lox2基因在大豆各器官中的表達Fig.5 Expression of soybean lox2gene in different soybean organs

M.2000 bp DNA marker; 1.PCR產(chǎn)物 M. 2000 bp DNA marker; 1.PCR amplification of LP圖6 LP 的擴增產(chǎn)物Fig.6 PCR amplification of LP

M.2000 bp DNA marker；1～2. Pst I和Nco I雙酶切片段 M.2000 bp DNA marker；1-2.Pst I and Nco I digestion of pMD18-T-LP圖7 pMD18-T-LP酶切鑒定Fig.7 Restriction enzyme digestion identification of pMD18-T-LP

圖8 大豆lox2基因啟動子序列中的順式作用元件Fig.8 Cis-elements of lox2 gene promoter

2.3 大豆lox2基因啟動子序列的克隆

根據(jù)NCBI中大豆lox2基因的序列，及大豆基因組序列，設計引物，PCR擴增大豆lox2基因ATG上游序列，獲得長度為2016 bp的序列，命名為LP(圖6)。將該片段連接到pMD18-T載體上，獲得重組質粒pMD18-T-LP。從大腸桿菌菌液中提取質粒，用PstI和NcoI雙酶切鑒定，結果得到與預期相符的片段(圖7)。利用DNAMAN軟件，將測序結果與大豆基因組中該段序列進行同源性比對，同源性達到100 %，說明該段序列在不同大豆品種間無差別。

2.4 大豆LP啟動子的序列分析

啟動子在線預測軟件分析結果表明，LP啟動子中含有多種典型的種子特異表達元件(圖8)，與胚高表達相關的順式作用元件(SEF3 motif和SEF4 motif)[14]，常出現(xiàn)在參與三?；视秃铣珊椭参锓N子特異表達基因的啟動子中的元件(E-box)[15]，種子特異表達的順式作用元件(AACACA、ACGT、Skn-1 motif、AATAAA)[16-19]；及與激素、逆境誘導相關元件，如ABRE(脫落素響應元件)[20]，LTR(低溫應答元件)[21]，MBS(參與干旱反應，是MYB的結合位點)[22]，W-box(WRKY轉錄因子的結合位點)[23]，AAAG-motif(DOF轉錄因子的結合位點)[24]。

3 討 論

本研究中對大豆lox2基因在不同逆境脅迫和激素處理下的表達情況進行分析。大豆lox2基因在干旱處理下，表達呈上調趨勢，表達量在24 h達到最大值，是對照表達量的7.47倍，說明lox2基因受干旱上調誘導明顯。在鹽、低溫和ABA處理條件下，lox2基因的表達量均下降，說明lox2基因受鹽、低溫和ABA的下調誘導。因此推測，大豆種子在鹽、低溫和ABA處理條件下，可降低豆腥味、苦澀味產(chǎn)生。此外，lox2基因在不同逆境脅迫和激素處理下的表達情況，很可能與大豆lox2基因啟動子中存在逆境、激素誘導相關順式元件，及其位置有關。

本研究對大豆lox2基因在各器官中的差異表達情況進行分析。lox2基因在大豆種子中，尤其是未成熟種子(30DAF)的相對表達活性很高，是根、莖、葉、花中表達量的23～1000倍，這與大豆種子中含有豐富的Lox的密切相關。根據(jù)大豆lox2基因在各器官中的表達情況看，該基因為種子特異表達基因。進一步克隆lox2基因上游的啟動子序列，基因的5’端上游調控序列中包含大量的順式調控元件，往往可能位于距離ATG5’端上游更遠端，所以本研究中在不明確有效啟動子序列時，克隆了ATG上游2016 bp的序列，能夠盡可能的包含了較多的調控元件(或是增強子)。克隆的LP啟動子序列中序列中包含多種與種子特異表達相關的順式元件，因此，該基因的啟動子很可能具有調控下游基因在大豆種子中大量表達的活性，仍需進一步實驗驗證。

4 結 論

利用qPT-PCR方法檢測表明大豆lox2基因受干旱、鹽、低溫、ABA誘導，且該基因在大豆種子中的相對表達量高；其啟動子序列LP中含有多種典型逆境、激素誘導相關元件及種子特異表達元件，推測大豆LP啟動子具有調控下游基因大量表達在種子中的特性，同時具有受脫落酸及其它逆境誘導表達的特性。

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(責任編輯 李山云)

ExpressionPatternAnalysisofSoybeanlox2GeneandPredictionofPromoter

ZHAO Yan1, LIU Xiao-xin2, ZHAI Ying1, CAO Hui1, WU Qiong1

(1.College of Life Science and Agroforestry, Qiqihaer University, Heilongjiang Qiqihaer 161006, China; 2.China Seed International Seed Co., LTD.Changchun Branch, Jilin Changchun 130113, China)

The expression patterns of soybeanlox2 gene in soybean organs under different adversity stress and hormone were detected, and the sequence and function oflox2 gene promoter were predicted. The expression pattern of soybeanlox2 gene was detected by qRT-PCR. Moreover, the 5’-flanking upstream sequence of soybeanlox2 gene by PCR method was isolated, which was analyzed by online software. The result showed that the activity oflox2 gene was increased by drought with time; the activity oflox2gene was decreased under salt, low temperature and ABA treatment, which were not related to the time. There was a little activity in roots, stems, leaves and flowers, but there was highest activity in seeds. Moreover, the 5’-flanking upstream sequence of soybeanlox2 gene, named LP, was isolated by PCR method, and the length was 2016 bp. Sequence analysis revealed that this fragment contained a series of motifs related to seed-specific promoters, hormone and stress-inducible promoters, such as SEF3 motif, SEF4 motif, E-box, AACACA, ACGT, Skn-1 motif, AATAAA, LTR, MBS, W-box, AAAG-motif, ABRE and so on.It was inferred that LP promoter possess the function of driving downstream gene expression abundantly in seeds and inducing by abscisic acid and other adversity.

Soybean;lox2 gene; Promoter; Cloning

1001-4829(2017)3-0505-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.004

S643

A

2016-03-15

黑龍江省自然科學基金項目(C201458)；黑龍江省普通本科高等學校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃(UNPYSCT_2016090)

趙 艷(1981-)，女，吉林吉林人，博士，副教授，研究方向植物分子生物學，E-mail:zhaoyan3053877@163.com。