周雯 張麗艷 謝立敏 丘利芳 王靜蓉 馬四補(bǔ) 姜志宏 唐靜雯

[摘要]該研究應(yīng)用超高效液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)苗藥頭花蓼醇提物與水提物的化學(xué)成分進(jìn)行分析與鑒定。采用 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（21 mm×100 mm，17 μm）；以010%甲酸水溶液（A） 010%甲酸乙腈溶液（B）為流動(dòng)相梯度洗脫；流速為035 mL·min-1；ESIMS檢測(cè)采用負(fù)離子模式。根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)合數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果顯示醇提物及水提物皆以黃酮類﹑多酚類及木脂素類成分為主，但醇提物與水提物化學(xué)成分具有明顯差異，具體為：醇提物中的可水解類鞣質(zhì)成分明顯減少，鞣花酸的缺失，花青素類化合物的新增等。該研究為闡明頭花蓼醇提物與水提物中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了重要依據(jù)。而且可以為基于“有效組分” 的中藥新藥研制提供基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]頭花蓼； 提取物； 超高效液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜； 化學(xué)成分

Analysis of alcohol extract and water extract of

Polygonum capitatum by UPLCQTOFMS

ZHOU Wen1， ZHANG Liyan1*， XIE Limin2， QIU Lifang2， WANG Jingrong2， MA Sibu1，

JIANG Zhihong2， TANG Jingwen3

（1. School of Pharmacy， Guiyang College of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550002， China；

2. State Key Laboratory of Quality of Traditional Chinese Medicine， Macao University of Science and Technology， Macau 999078， China；

3. Guizhou Weimen Pharmaceutical Co， Ltd， Guiyang 550004， China）

[Abstract]In this study， we used Ultra Performance Liquid ChromatographyTimeofFlight Mass Spectrometry（UPLCTOFMS）to identify the chemical constituents in both ethanol and water extract of Polygonum capitatum A Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column（21 mm×100 mm，17 μm） was used for separation The mobile phase was consisted of（A） 010% formic acid in water and（B）010% formic acid in acetonitrile， and the flow rate was 035 mL·min-1 ESI source in negative ion mode was used for MS detection Structural identification was carried out according to the accurate mass and matching with database The results showed that flavonoids， polyphenols and lignans were the main components in both extracts However， the chemical compositions of both extracts were different， eg there are less hydrolyzable tannins， loss of ellagic acid and more anthocyanins in ethanol extract In a conclusion， this study provides an important scientific basis for identifying the active ingredients in P capitatum， which also help to reveal the pharmacological effect of P capitatum.

[Key words]Polygonum capitatum； extract； UPLCTOFMS； chemical composition

頭花蓼為蓼科植物頭花蓼Polygonum capitatum BuchHamex DDon的干燥全草或地上部分，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003年版[1]。是貴州別具特色的苗藥。具清熱利濕、解毒止痛、活血散瘀、利尿通淋之功效，民間常用其治療泌尿系統(tǒng)感染、血尿、濕疹、腎盂腎炎、膀胱炎、尿路結(jié)石等癥[2]。目前，已有其化學(xué)成分研究報(bào)道，但不同提取方法化學(xué)成分的差異比較尚未見報(bào)道。超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLCTOFMS）分析技術(shù)，具有分離快速、靈敏度高、可提供精確分子量等優(yōu)點(diǎn)，并可以根據(jù)裂解規(guī)律對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行解析，已成為中藥活性成分研究的最有效的分析手段之一[3]?；诖?，本研究采用超高效液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLCTOFMS）方法，以頭花蓼醇提物及水提物為研究對(duì)象，利用一級(jí)﹑二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，鑒定頭花蓼醇提物及水提物中的化學(xué)成分。從化學(xué)的角度闡明頭花蓼不同提取方法所得的化學(xué)成分的差異，為該藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。endprint

1材料

超高效液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀[美國Waters公司Acquity超高效液相色譜系統(tǒng)、高壓二元梯度泵、恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、電噴霧接口、四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（QTOFMS， Bruker公司）、Hystar工作站﹔美國Agilent公司1290 Infinity液相色譜系統(tǒng)、6550 iFunnel四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、MassHunter工作站]。TGL16G離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、超聲處理器（100HZ，北京創(chuàng)新德超電子研究所）。

頭花蓼醇提取物和水提取物樣品均由貴州威門藥業(yè)股份有限公司提供（樣品編號(hào)分別為10246和10246）。頭花蓼醇提物制備：取頭花蓼藥材，分別加7倍量70%乙醇回流提取2次，每次15 h，濾過，合并濾液，回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度為120～125（60 ℃測(cè)）的稠膏，減壓干燥、粉碎成細(xì)粉，即得。頭花蓼水提物制備：取頭花蓼藥材，加水煎煮2次（第一次加8倍量水，第二次加6倍量水），每次15 h，煎液濾過，濾液合并，濃縮至適量，濾過，噴霧干燥，即得。頭花蓼藥材由貴州威門藥業(yè)股份有限公司貴州施秉頭花蓼GAP 種植基地提供，由貴陽中醫(yī)學(xué)院魏升華教授鑒定為蓼科植物頭花蓼P capitatum的干燥全草。對(duì)照品quercitrin（槲皮苷）， gallic acid（沒食子酸）， ellagic acid（鞣花酸）購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純（ACS公司），MilliQ水由Millipak20 Filter Unit處理，其他試劑均為分析純。

2方法

21色譜條件液相色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（21 mm×100 mm， 17 μm）；以01%甲酸水溶液為流動(dòng)相（A），01 %甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相（B），梯度洗脫為0～05 min，5% B；05～20 min，5%～185% B；20～28 min，185%～100% B；28～30 min；100%B；30～301 min，100%～5% B；301～32 min，5% B， 流速035 mL·min-1；自動(dòng)進(jìn)樣2 μL；柱溫40 ℃。

22質(zhì)譜條件利用Bruker QTOF采集一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)：ESI離子源，離子源溫度180 ℃，毛細(xì)管電壓4 500 eV；負(fù)離子檢測(cè)模式；噴霧壓力25 bar；干燥氮?dú)饬魉?0 L·min-1；掃描范圍100～2 000。利用Agilent QTOF采集二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)ESI離子源，離子源溫度250 ℃，干燥氮?dú)饬魉?3 L·min-1，鞘氣（氮?dú)猓囟?00 ℃，鞘氣流速11 L·min-1；負(fù)離子檢測(cè)模式；掃描范圍m/z 100～2 000，碰撞能量10～40 eV。

23供試品的制備稱取適量頭花蓼醇提取物粉末，加入70 %甲醇使?jié)舛冗_(dá)5 g·L-1，超聲處理使盡量溶解，混懸液稀釋10倍，搖勻，過濾，備用。

稱取適量頭花蓼水提取物粉末，加入水使?jié)舛葹? g·L-1，超聲處理使完全溶解，用甲醇稀釋1倍，搖勻，濾過，續(xù)濾液過022 μm微孔濾膜，備用。

24數(shù)據(jù)庫的建立與數(shù)據(jù)分析通過檢索數(shù)據(jù)庫Dictionary of Natural Products中頭花蓼的化學(xué)成分以及關(guān)于頭花蓼化學(xué)成分研究的相關(guān)文獻(xiàn)[47]，首先建立頭花蓼化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，其中包括各化學(xué)成分的化學(xué)分子式﹑相對(duì)分子質(zhì)量等信息。再根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜所提供的精確相對(duì)分子質(zhì)量﹑同位素豐度和同位素間距等信息與數(shù)據(jù)庫中的化學(xué)成分進(jìn)行匹配，并進(jìn)一步利用二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，根據(jù)所得的碎片信息來對(duì)各色譜峰進(jìn)行鑒定。同時(shí)利用與對(duì)照品比對(duì)出峰時(shí)間﹑精確分子量和二級(jí)碎片來確認(rèn)部分色譜峰。

3結(jié)果

31頭花蓼醇提物與水提物的化學(xué)成分鑒定按21及22項(xiàng)色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，頭花蓼醇提物所得的總離子流色譜圖見圖1A，頭花蓼水提物所得的總離子流色譜圖見圖1B。對(duì)各色譜峰的鑒定，首先利用一級(jí)質(zhì)譜分析，獲得各色譜峰的精確分子量﹑同位素豐度和同位素間距等訊息，再與本課題組建立的頭花蓼數(shù)據(jù)庫中的化學(xué)成分進(jìn)行匹配，獲得初步的鑒定結(jié)果。接著，進(jìn)一步利用二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。以頭花蓼醇提物總離子流色譜圖中的主要色譜峰（峰33）作為例子，根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜，該色譜的質(zhì)荷比m/z 937092 2，根據(jù)其同位素豐度和同位素間距推測(cè)為單電荷離子。經(jīng)檢索頭花蓼的數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)化學(xué)成分davidiin（化學(xué)分子式為C41H30O26，理論m/z 937095 3）的相對(duì)分子質(zhì)量與其匹配，誤差為-33，因此初步確定該峰為davidiin。二級(jí)質(zhì)譜顯示3個(gè)主要碎片：m/z 785085 3[M-C6H5O3CO-H]-，741092 9[M-C6H5O3CO-CO2-H]-， 589081 7[M-2C6H5O3CO-CO2-H]-。最后鑒定峰33為davidiin。此外，比對(duì)樣品與對(duì)照品出峰時(shí)間﹑精確相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)碎片。，沒食子酸對(duì)照品的出峰時(shí)間為12 min，其精確相對(duì)分子質(zhì)量為m/z 169013 7，二級(jí)碎片主要為m/z 125025 1，見圖2。而峰1（同時(shí)出現(xiàn)于醇提物及水提物中）的出峰時(shí)間為12 min，其精確相對(duì)分子質(zhì)量為m/z 169015 1（醇提物），169014 4（水提物），二級(jí)碎片主要為m/z 125025 5（醇提物），125026 1（水提物）﹔其出峰時(shí)間﹑精確相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)碎片均與沒食子酸對(duì)照品非常匹配，因此確定峰1為gallic acid（沒食子酸）。以同樣方法，確定峰34為ellagic acid（鞣花酸），見圖3，峰46為quercitrin（槲皮苷），見圖4。采用上述分析手段，最后于頭花蓼醇提物及水提物中共鑒定出53個(gè)化合物，其鑒定結(jié)果見表1。頭花蓼醇提物及水提物中的成分以黃酮類和多酚類成分為主，包括：①黃酮及黃酮苷類化合物（其中以黃酮為苷元，單糖或雙糖苷，部分還有沒食子?；虎诙喾宇惓煞?，包括沒食子可水解鞣質(zhì)，兒茶素及其聚合體；③木脂素及其苷類化合物等。endprint

32頭花蓼醇提物與水提物的化學(xué)成分對(duì)比分析頭花蓼醇提物與水提物的成分具有明顯的差異，見圖1。兩者只有11個(gè)共有成分，分別為峰1（gallic acid，沒食子酸），峰5，11，22（trigalloylglucose，三沒食子酰葡萄糖或異構(gòu)體），峰33（davidiin），峰36，38（quercetin3OβDglucopyranoside，槲皮素3OβD葡萄糖苷或異構(gòu)體），峰39（nudiposide），峰46（quercitrin，槲皮苷），峰49（2″Ogalloyl quercetin），峰52（6acetyl3′，6′diferuloylsucrose）。當(dāng)中，沒食子酸﹑三沒食子酰葡萄糖﹑nudiposid于水提物的含量明顯高于醇提物﹔反之，davidiin醇提物的含量則明顯高于水提物。

有21個(gè)成分只存在于醇提物中，分別為峰7，16，28（procyanidin B1/B2/B3/B4，原花青素或異構(gòu)體），峰10[（+）catechin，兒茶素]，峰12，15，27（procyanidin C1/C2，原花青素或異構(gòu)體），峰14（1，3diOgalloyl4，6O（S）hexahydroxydiphenoylβDglucose），峰20，23，30（3galloylprocyanidin B1/B2/B3 /B4，沒食子酰前矢車菊素或異構(gòu)體），峰21（trigalloylglucose，三沒食子酰葡萄糖或異構(gòu)體），峰24，31，40，42（granatin B/carpinusin或異構(gòu)體），峰26（diOgalloylHHDPβDglucose），峰37[（-）epicatechin3Ogallate，表兒茶素3O沒食子酸酯]，峰41（2″Ogalloyl hirsutrin），峰47（3，3′digalloylprocyanidin B2），峰51（viviparum B）。

有21個(gè)成分只存在于水提物中，分別為：峰2～4，6，8，9，13（3，6digalloylglucose； Dpyranoseform，3，6二沒食子?；咸烟腔虍悩?gòu)體），峰17～19，25，29，32（trigalloylglucose，三沒食子酰葡萄糖或異構(gòu)體），峰34（ellagic acid，鞣花酸），峰35[（+）lyoniresinol2αOβglucopyranoside]，峰43（2″Ogalloyl hirsutrin），峰44，45（schizandriside），峰48（helonioside A），峰50（2″Ogalloyl quercetin），峰53（3，8diOmethylellagic acid）。

總括而言，花青素類化合物只存在于醇提物中，而水解鞣質(zhì)類化合物（二沒食子酰葡萄糖﹑三沒食子酰葡萄糖）﹑槲皮素類化合物和鞣花酸等于水提物中的含量則明顯高于醇提物。由此可見，使用不用溶劑提取頭花蓼對(duì)其所得的提取物中的化學(xué)成分具有重要的影響。

4討論

本研究對(duì)頭花蓼以不同方法提取后所得的化學(xué)成分進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)頭花蓼醇提物與水提物中的化學(xué)成分皆以黃酮類和多酚類成分為主。包括：①黃酮及黃酮苷類化合物以黃酮為苷元，單糖或雙糖苷，部分連有沒食子酰基；②多酚類成分，包括沒食子可水解鞣質(zhì)，兒茶素及其聚合體；③木脂素及其苷類化合物等，這些化合物很有可能是頭花蓼的活性成分。

頭花蓼醇提與水提物所含的化學(xué)成分具有顯著的差異，兩者只有11個(gè)共有成分。當(dāng)中花青素類化合物，如原花青素B1～B4只存在于醇提物中，這可能是因?yàn)檫@類化合物在水煎煮過程中發(fā)生了進(jìn)一步的聚合或氧化反應(yīng)，但有關(guān)這方面的解釋還有待進(jìn)一步研究。水解鞣質(zhì)類化合物﹑槲皮素類化合物和鞣花酸等于水提物中的含量則明顯高于醇提物，這可能與不同化學(xué)物的溶解度有關(guān)。貴州威門藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的發(fā)熱淋清顆粒為水提制劑，這些化學(xué)成分是否其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)還有待進(jìn)一步研究。

頭花蓼有較好的體外抗氧化活性，其甲醇提取物具有很強(qiáng)的清除DPPH自由基、ABTS自由基及還原Fe3+的能力，總抗氧化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過BHT的作用，頭花蓼具有較好的抗氧化作用，其強(qiáng)弱程度取決于提取溶劑[8]。而水提是其制劑熱淋清顆粒的提取方法，其具清熱解毒、利尿通淋的功效，用于濕熱蘊(yùn)結(jié)、小便黃赤、淋漓澀痛之證和尿路感染、腎盂腎炎見上述癥候者[9]。本文為闡明頭花蓼醇提物與水提物中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的提供了重要依據(jù)。

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[責(zé)任編輯丁廣治]endprint