施高翔 汪天明 吳生兵 汪云霞 邵菁 周美啟 汪長(zhǎng)中

[摘要]研究艾葉揮發(fā)油（Artemisia argyi essential oil，AAEO）誘導(dǎo)白念珠菌凋亡的活性。實(shí)驗(yàn)采用微量液基稀釋法檢測(cè)AAEO對(duì)白念珠菌（Candida albicans）SC5314的MIC；采用XTT還原法檢測(cè)AAEO對(duì)白念珠菌SC5314代謝的影響；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)AAEO對(duì)白念珠菌SC5314細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）和線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）水平的影響；采用AnnexinV/PI法測(cè)定AAEO對(duì)白念珠菌SC5314細(xì)胞凋亡率的影響；采用熒光顯微鏡觀察AAEO對(duì)白念珠菌SC5314細(xì)胞Caspase酶活性的影響；采用DAPI染色法觀察AAEO對(duì)白念珠菌SC5314細(xì)胞核固縮的影響。結(jié)果顯示，AAEO對(duì)白念珠菌SC5314的MIC為05 mL·L-1；XTT代謝活性顯示AAEO對(duì)白念珠菌SC5314代謝呈劑量依賴性的抑制；>05 mL·L-1的AAEO干預(yù)后，白念珠菌SC5314細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著升高、線粒體膜電位顯著降低、凋亡比例明顯增加、metacaspase活性顯著升高、細(xì)胞核固縮。AAEO具有誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞凋亡的活性，該作用可能與ROS積累和線粒體損傷相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]艾葉揮發(fā)油； 白念珠菌； 凋亡； 活性氧； 線粒體

Activity of essential oil extracted from Artemisia argyi in inducing

apoptosis of Candida albicans

SHI Gaoxiang1，2， WANG Tianming1，2， WU Shengbing4， WANG Yunxia1，2，

SHAO Jing1，2， ZHOU Meiqi3*， WANG Changzhong1，2*

（1. School of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230038， China；

2. Institute of Integrated Traditional and Western Medicine， Anhui Academy of Chinese Medicine， Hefei 230038， China；

3. Division of Science and Technology， Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230038， China；

4. Experimental Center of Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230038， China）

[Abstract]To explore the activity of essential oil extracted from Artemisia argyi （AAEO） in inducing the apoptosis of Candida albicans SC5314. The effect of AAEO on reactive oxygen species（ROS） and mitochondria membrane potential（MMP） of C. albicans SC5314 was detected by flow cytometry. Phosphatidylserine externalization was observed under fluorescence microscopic with AnnexinV/PI staining at the early stage of apoptosis in C. albicans. Metacaspase activity was observed under fluorescence microscopic with FITCVADFMK staining at the early stage of apoptosis in C. albicans. C. albicans morphology was observed by DAPI nuclear staining and fluorescence microscopy. After intervention with 0.5 mL·L-1 AAEO， apoptosis of C. albicans significantly increased， metacaspase activity increased， nuclear pyknosis and fragmentation， and intracellular ROS were significantly increased， and mitochondrial membrane potential decreased significantly. The certain concentrations of AAEO could induce the apoptosis of C. albicans.

[Key words]Artemisia argyi essential oil； Candida albicans； apoptosis； ROS； mitochondrial

臨床上，皮膚發(fā)生病毒、細(xì)菌或真菌等病原體感染時(shí)，除了常規(guī)的全身或局部用藥外，艾灸往往也能產(chǎn)生顯著療效[12]。艾灸具有藥物作用、溫?zé)嶙饔门c近紅外輻射作用三大作用機(jī)制，其中藥物作用與其含有的揮發(fā)油密切相關(guān)[3]。課題組前期研究表明，艾葉揮發(fā)油（Artemisia argyi essential oil，AAEO）對(duì)臨床常見皮膚致病性真菌尤其是白念珠菌具有較強(qiáng)的抗菌活性[4]，但其作用機(jī)制不詳。有研究表明，植物揮發(fā)油可以通過誘導(dǎo)真菌凋亡而發(fā)揮其抗菌作用[5]，本實(shí)驗(yàn)著重探討艾葉揮發(fā)油是否能通過凋亡方式發(fā)揮抗白念珠菌活性。endprint

1材料

11菌株和試劑 白念珠菌（Candida albicans， C albicans）SC5314由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院姜遠(yuǎn)英教授惠贈(zèng)；艾葉購(gòu)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院并經(jīng)鑒定；氟康唑（Fluconazole，F(xiàn)LC，Mr 30627，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100314）；兩性霉素B（Amphotericin B，AmB，Mr 92408，Sigma A9528）；RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；XTT[2， 3bis （2methoxy4nitro5sulfophenyl）2Htetrazolium5carboxanilide]（加拿大BBI公司）；維生素 K3 （美國(guó)Alexis公司）；AnnexinV/FITC試劑盒（上海貝博生物公司）；FITCVADFMK（Promega公司）； 活性氧檢測(cè)試劑盒（Solarbio公司）；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（Solarbio公司）。

12儀器24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）；Spectra Max M2e多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)公司）；流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer，Accuri C6，美國(guó)BD公司）；倒置熒光顯微鏡（Olympus IX 81， 日本）。

2方法

21AAEO的制備參照文獻(xiàn)并有所改動(dòng)[6]，將艾條燃燒后產(chǎn)生的艾煙通入玻璃冷凝器中，于10 ℃以下進(jìn)行冷凝，收集玻璃冷凝器表面產(chǎn)生的冷凝液滴，去除冷凝物中的顆粒狀沉淀，收集透明的、具有濃郁芳香氣味的液體即得。經(jīng)鑒定純度≥98%。

22菌液的配制從4 ℃保存的YPD平板上挑取白念珠菌單菌落，接種至液體沙氏培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以RPMI1640培養(yǎng)基將菌液濃度調(diào)整至2×106 CFU/mL備用。

23AAEO對(duì)白念珠菌SC5314的MIC的測(cè)定[7]取100 μL菌液（2×10

3 CFU/mL）與100 μL終濃度分別為32，16，8，4，2，1，05，025，0125，0062 5 mL·L-1的AAEO于96孔板中混合，設(shè)陽(yáng)性藥組（氟康唑1 mg·L-1）和空白組（不含藥物），37 ℃培養(yǎng)48 h后，肉眼觀察，以觀察不到白念珠菌生長(zhǎng)的最低藥物稀釋度為MIC（minimum inhibitory concentration，MIC）。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

24AAEO對(duì)白念珠菌SC5314的代謝活性的影響[8]取100 μL菌液（濃度為2×106 CFU/mL），與100 μL終濃度分別為32，16，8，4，2，1，05，025 mL·L-1AAEO于96孔板中混合，設(shè)陽(yáng)性藥組（氟康唑32 mg·L-1）和空白組（不含藥物），37 ℃培養(yǎng)24 h后，吸棄上清，每孔加入50 μL XTTVK3溶液，37 ℃避光繼續(xù)孵育2 h。以多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm處各孔的A。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

25AAEO對(duì)白念珠菌SC5314活性氧（reactive oxygen species，ROS）的影響[9]取菌懸液（2×106 CFU/mL），分別加入AAEO（1，05，025 mL·L-1）和AmB（05 mg·L-1），37 ℃作用12 h，3 000 r·min-1離心5 min收集細(xì)胞，無菌PBS緩沖液清洗3次后，重懸細(xì)胞至5×106 CFU/mL。臨用前以DMSO溶解DCFHDA（-20 ℃避光存）得10 mmol·L-1儲(chǔ)備液。加入終濃度為10 μmol·L-1的DCFHDA染液和不加DCFHDA液的對(duì)照菌液，37 ℃孵育20 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平。

26AAEO對(duì)白念珠菌SC5314線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）的影響[10]取濃度為2×106 CFU/mL菌液，分別加入不同濃度的AAEO（1，05，025 mL·L-1）和AmB（05 mg·L-1），37 ℃干預(yù)12 h，離心（3 000 r·min-1）5 min收集細(xì)胞，無菌PBS緩沖液清洗3次后，重懸細(xì)胞調(diào)整濃度至5×106 CFU/mL。按照試劑盒說明書加入熒光染料JC1染色工作液，于暗處30 ℃孵育15 min，PBS洗滌3次，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

27AAEO對(duì)白念珠菌SC5314磷脂酰絲氨酸（phosphatidyl serine，PS）外翻和凋亡率的影響[11]在C albicans SC5314細(xì)胞懸液（5×106 CFU/mL）中分別加入AAEO（終濃度為1，05，025 mL·L-1）和AmB（05 mg·L-1），設(shè)空白對(duì)照組，37 ℃孵育12 h。離心收集菌體，對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行脫壁處理，轉(zhuǎn)移至15%蝸牛酶溶液中，30 ℃，100 r·min-1搖床孵育45 min，無菌PBS洗3次后，得脫壁的原生質(zhì)體狀態(tài)的白念珠菌。

調(diào)整菌濃度為2×106 CFU/mL，用無菌PBS洗3次，以400 μL 1×Annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加5 μL Annexin VFITC染液，輕輕混勻后于4 ℃避光孵育15 min，對(duì)細(xì)胞膜上的PS進(jìn)行標(biāo)記；再加入10 μL PI染液混勻繼續(xù)孵育5 min，對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行染色。倒置熒光顯微鏡觀察PS外翻情況并拍照，同時(shí)于流式細(xì)胞儀上分析凋亡率并統(tǒng)計(jì)。

28AAEO對(duì)白念珠菌SC5314細(xì)胞metacaspase活性的影響[12]取C albicans SC5314（濃度為5×106 CFU/mL），向菌液中加入AAEO（1，05，025 mL·L-1）和AmB（5 mg·L-1），設(shè)空白對(duì)照組，于37 ℃，100 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h。離心收集細(xì)胞，無菌PBS緩沖液洗3遍，加100 μL的10 μmol·L-1的FITCVADFMK于30 ℃避光染色l h，均勻涂抹在含有多聚賴氨酸的載玻片上，置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。endprint

29DAPI法檢測(cè)白念珠菌SC5314細(xì)胞核碎裂[13]將經(jīng)AAEO（1，05，025 mL·L-1）和AmB（5 mg·L-1）干預(yù)后的C albicans SC5314菌細(xì)胞以70%乙醇固定滲透10 min，3 000 r·min-1離心5 min收集菌體，無菌PBS緩沖液洗3次后加入10 mg·L-1的DAPI染液，室溫避光染色20 min。取菌懸液涂抹于含有多聚賴氨酸的載玻片上，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

3結(jié)果

31AAEO對(duì)白念珠菌SC5314的MIC的判定根據(jù)M27A方案，艾葉揮發(fā)油對(duì)白念珠菌SC5314的MIC為05 mL·L-1。

32AAEO抑制白念珠菌SC5314的代謝活性通過XTT還原法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同濃度AAEO作用后白念珠菌SC5314的代謝活性呈劑量依賴性降低，其中16 mL·L-1的AAEO能抑制50%白念珠菌的代謝活性（P<001），見圖1。

33AAEO促進(jìn)白念珠菌SC5314胞內(nèi)ROS的累積實(shí)驗(yàn)以DCFHDA染料檢測(cè)白念珠菌SC5314胞內(nèi)ROS的累積，無熒光的DCFH可以自由穿過細(xì)胞膜，被超氧陰離子和過氧化氫等ROS氧化生成發(fā)熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白組（0 mL·L-1AAEO）的熒光強(qiáng)度較弱（17%），不同濃度AAEO干預(yù)后，熒光強(qiáng)度呈劑量依賴性增強(qiáng)，其中05 mg·L-1AmB和02，05，1 mL·L-1AAEO能顯著提高其胞內(nèi)ROS水平，分別提升91%，48%，65%，88%的活性氧水平。

34AAEO降低白念珠菌SC5314胞內(nèi)MMP水平在線粒體膜電位較高時(shí)，JC1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，產(chǎn)生綠色熒光。通過JC1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變（FL2/FL1的比值）可檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組（0 mL·L-1AAEO）FL2/FL1值（233）相比較，05 mg·L-1AmB使FL2/FL1降低為0492， 025，05，1 mL·L-1的AAEO能劑量依賴性的降低白念珠菌的膜電位，F(xiàn)L2/FL1值分別為223，165，138（P<005），見圖2。

35AAEO誘導(dǎo)白念珠菌SC5314 PS外翻，增加凋亡率PS外翻是真菌凋亡的典型表現(xiàn)之一。PS在細(xì)胞凋亡的早期，可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面。AnnexinV（膜聯(lián)蛋白）可以與暴露在膜外側(cè)的PS特異性結(jié)合，PI可標(biāo)記死亡細(xì)胞?？瞻讓?duì)照組的細(xì)胞有少量的綠色熒光，且有紅色的熒光，陽(yáng)性對(duì)照藥AmB組綠色熒光細(xì)胞最多。經(jīng)不同濃度AAEO處理后，隨著藥物濃度的升高，綠色熒光細(xì)胞數(shù)量越多，表明PS從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，提示AAEO可誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)AAEO對(duì)白念珠菌凋亡率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于空白組（0 mL·L-1AAEO）凋亡率（37%），05 mg·L-1 AmB 和025，05，1 mL·L-1AAEO可引起388%和48%，88%，105%的白念珠菌細(xì)胞凋亡（P<005），見圖3。

36AAEO激活白念珠菌SC5314細(xì)胞metacaspase活性在C albicans細(xì)胞中，存在Caspase同源結(jié)構(gòu)類似物metacaspase，負(fù)責(zé)選擇性的切割某些蛋白質(zhì)，從而造成細(xì)胞凋亡。因此，本實(shí)驗(yàn)中選用FITCVADFMK在原位檢測(cè)metacaspase的活性。空白組（0 mL·L-1AAEO）中見有少量微弱熒光的細(xì)胞，AAEO處理后的細(xì)胞，多數(shù)細(xì)胞被標(biāo)記上明亮的綠色熒光，陽(yáng)性對(duì)照藥AmB的熒光亮度最為明顯，說明AAEO可激活C albicans SC5314細(xì)胞內(nèi)的metacaspase活性，見圖4。

37AAEO誘導(dǎo)白念珠菌SC5314細(xì)胞核碎裂DAPI能穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈結(jié)合產(chǎn)生藍(lán)色熒光?？瞻捉M（0 mL·L-1AAEO）的白念珠菌呈彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光，經(jīng)AAEO處理過的細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的核固縮或顆粒狀熒光。提示AAEO導(dǎo)致白念珠菌細(xì)胞核固縮或碎裂，見圖5。

4討論

細(xì)胞凋亡（apoptosis）是細(xì)胞普遍存在的一種生命過程。目前以細(xì)胞凋亡為研究手段，可深層次探討和揭示疾病的發(fā)生機(jī)制，尋找新的治療藥物和方法[14]。近年來發(fā)現(xiàn)，引起常見真菌感染的白念珠菌在環(huán)境刺激或脅迫下，生長(zhǎng)代謝受到抑制，引發(fā)細(xì)胞ROS累積、metacaspase 酶活性激活、MMP改變、核固縮或裂解、膜磷脂酰絲氨酸（PS）外翻等典型凋亡特征的變化，發(fā)生凋亡[15]。文獻(xiàn)報(bào)道，乙酸、AmB等藥物在適當(dāng)濃度下可誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞凋亡[1617]。

艾葉為菊科多年生植物艾蒿的干燥葉，是我國(guó)的常用中藥。文獻(xiàn)表明艾葉及其揮發(fā)油具有殺蟲止癢、抑菌、抗炎等作用[18]。課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)艾葉揮發(fā)油具有良好的抗真菌效果，尤其對(duì)白念珠菌的效果最明顯。本實(shí)驗(yàn)采用微量液基稀釋法檢測(cè)了AAEO對(duì)白念珠菌SC5314的MIC為05 mL·L-1且對(duì)白念珠菌SC5314的生物膜代謝活性有顯著影響，可劑量依賴性的下調(diào)其代謝活性，其中16 mL·L-1的AAEO可抑制50%生物膜代謝。

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)的能量產(chǎn)生中心場(chǎng)所，對(duì)維持細(xì)胞能量代謝和正常功能活動(dòng)起重要作用。在凋亡信號(hào)的刺激條件下，線粒體膜通透性增加，會(huì)引發(fā)線粒體產(chǎn)生一系列的變化[19]。本實(shí)驗(yàn)采用DCFHDA和JC1熒光試劑，檢測(cè)白念珠菌胞內(nèi)ROS和MMP水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度AAEO干預(yù)后，胞內(nèi)ROS大量累積，線粒體膜電位卻顯著下降，該結(jié)果提示AAEO誘導(dǎo)白念珠菌凋亡的過程可能與線粒體損傷相關(guān)。另外，實(shí)驗(yàn)以AnnexinV/PI染料染色白念珠菌后，熒光顯微鏡觀察到白念珠菌細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）出現(xiàn)外翻現(xiàn)象，提示AAEO可誘導(dǎo)白念珠菌PS從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，引發(fā)菌體凋亡。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)，AAEO可顯著提高白念珠菌的凋亡率。endprint

有文獻(xiàn)表明，約40%的真菌凋亡由metacaspase介導(dǎo)[20]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AAEO可顯著提升胞內(nèi)ROS累積，而ROS不僅可以氧化細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，引起細(xì)胞損傷，而且可以激活metacaspase活性，導(dǎo)致真菌凋亡。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定AAEO對(duì)白念珠菌metacaspase活性的影響，結(jié)果表明AAEO可激活metacaspase活性。實(shí)驗(yàn)還以DAPI染料染色后，觀察到AAEO可導(dǎo)致白念珠菌染色質(zhì)凝集和細(xì)胞核濃縮。

綜上所述，AAEO導(dǎo)致白念珠菌SC5314的細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出典型的凋亡特征，包括PS外翻、染色質(zhì)凝集、細(xì)胞核固縮，另外使其胞內(nèi)ROS大量累積、MMP下降，激活了metacaspase活性，隨之啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。本研究首次報(bào)道AAEO可誘導(dǎo)白念珠菌凋亡，凋亡進(jìn)程可能與線粒體損傷有關(guān)。通過藥物（包括中藥及有效成分）誘導(dǎo)白念珠菌的凋亡是當(dāng)前抗真菌的新策略，本研究為AAEO治療皮膚常見真菌感染的作用機(jī)制研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并進(jìn)一步豐富了中醫(yī)藥抗真菌的科學(xué)理論。

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[責(zé)任編輯張寧寧]endprint