陳瓊芳 王鋼 唐麗清++俞獻(xiàn)文

[摘要]該文主要研究吉馬酮對(duì)過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）氧化損傷的保護(hù)作用并探討其可能的作用機(jī)制。使用500 μmol·L-1H2O2誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞3 h，從而建立氧化損傷模型，再用不同濃度吉馬酮（20，40，100，150，200 μmol·L-1）保護(hù)24 h。利用MTT法檢測吉馬酮對(duì)H2O2損傷HUVECs細(xì)胞活力的影響；ELISA法檢測PGI2，TXB2，ET1，tPA，PAI1，TNFα和IL6；硝酸還原酶法檢測NO；比色法檢測NOS及GSHPx；再分別采用TBA法、WST1法和微量酶標(biāo)法檢測MDA，SOD和LDH的含量等；Hoechst 33258熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡情況；RTPCR檢測細(xì)胞中Bax，Bcl2，Caspase3 mRNA表達(dá)。結(jié)果表明500 μmol·L-1H2O2作用3 h細(xì)胞損傷率達(dá)到52%，而在20～200 μmol·L-1隨著吉馬酮濃度的增大被損傷細(xì)胞活性不斷增強(qiáng)。與正常組比較，H2O2損傷使PGI2，NO，TNOS，tPA，SOD，GSHPx和Bcl2 mRNA降低，使PAI1，ET1，IL6，TNFα，TXB2，LDH，MDA，Bax mRNA和Caspase3 mRNA增加；與模型組比較，吉馬酮（200，100，50 μmol·L-1）使PGI2，NO，TNOS，tPA，SOD，GSHPx和Bcl2 mRNA增加，使PAI1，ET1，IL6，TNFα，TXB2，LDH，MDA，Bax mRNA和Caspase3 mRNA減少。Hoechst 33258熒光染色與正常組比較，模型組細(xì)胞膜與細(xì)胞核呈濃縮致密的強(qiáng)藍(lán)色熒光，細(xì)胞數(shù)量明顯減少；與模型組比較，給藥組的藍(lán)色熒光強(qiáng)度降低等。以上研究結(jié)果表明，吉馬酮可能通過抗氧化及抑制細(xì)胞凋亡等作用，從而改善H2O2誘導(dǎo)的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用。

[關(guān)鍵詞]吉馬酮； H2O2； 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 氧化應(yīng)激； 保護(hù)作用

Effect of germacrone in alleviating HUVECs damaged by

H2O2induced oxidative stress

CHEN Qiongfang1， WANG Gang1， TANG Liqing1， YU Xianwen1， LI Zhaofei2， YANG Xiufen1*

（1. Department of Pharmacology， School of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530001， China；

2. Shaanxi Second People′s Hospital， Xi′an 710000， China）

[Abstract]This study focuses on the protective effect of germacrone on human umbilical vein endothelial cells（HUVECs） damaged by H2O2induced oxidative stress and its possible mechanisms. The oxidative damage model was established by using 500 μmol·L-1 H2O2 to treat HUVECs for 3 hours， and then protected with different concentrations of germacrone for 24 hours. The effect of germacrone on cell viability of HUVECs damaged by H2O2 was detected by MTT. The contents of PGI2， TXB2， ET1， tPA， PAI1， TNFα and IL6 were detected by ELISA. The content of NO was detected by using nitrate reductase method. Colorimetry was used to detect NOS and GSHPx. The contents of MDA， SOD and LDH were detected by TBA， WST1 and microplate respectively. Apoptosis was observed by Hoechst 33258 fluorescent staining. The mRNA expressions of Bax， Bcl2 and Caspase3 in cells were detected by RTPCR. The results showed that the cell damage rate was 52% after treated with 500 μmol·L1 H2O2 for 3 hours. The cell activity was increasing with the rise of germacrone concentration within the range of 20200 mol·L-1. Compared with normal group， the contents of PGI2， NO， TNOS， tPA， SOD， GSHPx and Bcl2 mRNA expressions were lower after damaged with H2O2. The contents of PAI1， ET1， IL6， TNFα， TXB2， LDH， MDA， Bax mRNA and Caspase3 mRNA expressions were increased. Compared with model group， the contents of PGI2， NO， TNOS， tPA， SOD， GSHPx and Bcl2 mRNA expressions were increased after treated with germacrone. The contents of PAI1， ET1， IL6， TNFα， TXB2， LDH， MDA， Bax mRNA and Caspase3 mRNA expressions were lower after treated with germacrone. According to Hoechst 33258 fluorescence staining， compared with normal group， the cell membrane and the nucleus showed strong dense blue fluorescence， and the number of cells significantly decreased in model group. Compared with model group， blue fluorescence intensity decreased in drug group. The above findings demonstrate that germacrone may improve the effect on HUVECs damaged by H2O2induced oxidative stress by resisting oxidation and inhibiting cell apoptosis.endprint

[Key words]germacrone； H2O2； human umbilical vein endothelial cell（HUVEC）； oxidative stress； protective effect

血管內(nèi)皮細(xì)胞與血管生理學(xué)的血管舒張、再生、炎癥和屏障功能等許多方面密切相關(guān)，同樣內(nèi)皮細(xì)胞損傷也是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓等疾病的重要因素之一[1]，其中氧化應(yīng)激引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是引起血管內(nèi)皮功能障礙的重要因素[2]。因此，保護(hù)和改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能是預(yù)防和治療疾病的重要手段，從而利用天然藥用植物有效成分預(yù)防血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷來研究治療心血管疾病形成熱潮。

氧化應(yīng)激是由潛在的活性氧生成與清除活性之間不平衡而導(dǎo)致的代謝狀態(tài)[3]。氧化應(yīng)激損傷還可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，及機(jī)體存在的一些抗氧化酶的變化，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）、過氧化氫酶（CAT）等。因此認(rèn)為其是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)比較重要的因素。本研究通過過氧化氫（H2O2）損傷HUVECs 細(xì)胞從而建立氧化應(yīng)激體外模型，用于探討吉馬酮對(duì)HUVECs細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用和機(jī)制，為吉馬酮的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供有益的依據(jù)。

1材料

11藥物及配置吉馬酮（純度≥98%，購自中國科學(xué)院成都生物研究所，Lot No MUST15012414）。吉馬酮的配制：精密稱取吉馬酮，加入DMSO吹打數(shù)次使其溶解完全（DMSO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為01%），再加入DMEM/F12培養(yǎng)液充分混勻，再經(jīng)025 μm微孔濾膜過濾除菌，即得。

12試劑30%H2O2（成都市科龍化工試劑廠）；DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液（Hyclone，Lot No AAL209346）；四季青胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；1×PBS（Gibco，Lot No 8116251）；025%胰蛋白酶EDTA消化液（Gibco，Lot No 1665735）；MTT（Sigma，Lot No M2128）；DMSO（Sigma，Lot No 520C031）；4%多聚甲醛（Solarbio，Lot No 20160711）；Hoechst 33258染色液（生物工程，E6073010005）；NO試劑盒、TNOS試劑盒、LDH測試盒、GSHPx測試盒、SOD測定試劑盒和微量MDA測試盒（南京建成生物工程研究所）；PGI2，TXB2，ET1，tPA，PAI1，TNFα和IL6酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；DEPC水（生物工程上海有限公司，Lot No C612BA0013）；RNAiso plus（TAKARA）；異丙醇、無水乙醇和氯仿（AR，成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo，Lot No 00310953）；Taq MasterMix（康為，Lot No 00461511）；內(nèi)參GAPDH（生物工程購買）；引物（寶生物公司合成）。

13儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱（Sanyo，MCO18AIC）；TECAN全波長酶標(biāo)儀（Infinite M200PRO）；高速多用離心機(jī)（Thermo Fisher）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海鴻都電子科技有限公司，DHG9140A）；倒置熒光顯微鏡（Leica，DMI3000B）；通用電泳儀（PowerPac Universal）；低溫離心機(jī)（Eppenderf，Centrifuge 5430R）；PCR儀（BIO RAO T100TMThermal Cycler）；凝膠成像儀（BIORAD）。

2方法

21氧化損傷模型的建立及MTT比色法檢測吉馬酮對(duì)H2O2損傷HUVECs活性的影響參考相關(guān)文獻(xiàn)[45]，消化離心制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋使細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL待用，96孔板每孔加入150 μL細(xì)胞懸液（每孔約75×103個(gè)細(xì)胞），貼壁24 h，吸出培養(yǎng)液，1×PBS洗滌2遍，每孔加入150 μL的500 μmol·L-1 H2O2孵育3 h，即得H2O2氧化損傷模型。吸出損傷液，1×PBS洗滌2遍，正常組與模型組分別加入150 μL培養(yǎng)液，給藥組分別加入150 μL含不同濃度吉馬酮（分別為20，40，100，150，200 μmol·L-1）的培養(yǎng)液，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再采用MTT法在490 nm檢測A。每組設(shè)計(jì)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。抑制率=[（A正常值-A空白組）-（A模型組-A空白組）]/（A正常值-A空白組）×100%。

22實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液的制備實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組（500 μmol·L-1H2O2）、吉馬酮高劑量組（200 μmol·L-1 ）、吉馬酮中劑量組（100 μmol·L-1 ）、吉馬酮低劑量組（50 μmol·L-1），n=6。消化離心制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，稀釋使細(xì)胞濃度為2×105 個(gè)/mL待用，6孔板每孔加入2 mL細(xì)胞懸液（每孔約4×105個(gè)細(xì)胞），貼壁24 h，造模方法與給藥同21中所述，孵育24 h后取細(xì)胞培養(yǎng)液高速離心取上清，即得細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分裝，-20 ℃保持，待用。

將上述處理后的細(xì)胞放置在冰上，用4～5 mL冰1×PBS洗滌2遍，加入2 mL 1×PBS用細(xì)胞刮刷把細(xì)胞從瓶底刮下，吸入離心管，重復(fù)2次，盡量在冰上進(jìn)行操作。1 000 r·min-1離心3 min，去除上清液，加1×PBS（pH 74左右）將細(xì)胞稀釋至1×108個(gè)/mL，-20 ℃過夜，反復(fù)凍融3次破壞細(xì)胞膜后，于4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min取上清液，即得細(xì)胞裂解液，分裝，-20 ℃保持，待用。

23利用Hoechst 33258熒光染色法觀察吉馬酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞的凋亡情況的影響參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]，消化離心制備細(xì)胞懸浮液，計(jì)數(shù)，稀釋使細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL待用，24孔板每孔加入1 mL細(xì)胞懸液（每孔約1×105個(gè)細(xì)胞），貼壁24 h，造模方法同21中所述，設(shè)對(duì)照組（正常組和模型組）與給藥組，對(duì)照組加入正常培養(yǎng)液、給藥組不同濃度吉馬酮（200，100，50 μmol·L-1）孵育24 h。棄上清液，1×PBS洗滌2次，2 min 1次；再加每孔1 mL 4%多聚甲醛固定30 min；1×PBS洗滌3次，2 min 1次；每孔加05 mL稀釋10倍的Hoechst染色液避光染色20 min；在激發(fā)波長350 nm、發(fā)射波長460 nm的熒光顯微鏡下觀察并拍照。嚴(yán)格按照細(xì)胞凋亡熒光Hoechst 33258 檢測試劑盒說明書操作流程進(jìn)行。endprint

24RTPCR檢測細(xì)胞中Bax，Bcl2，Caspase3 mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理同21與22，再提取RNA：每孔加入RNAiso plus 1 mL，吹打使細(xì)胞溶解，吸入15 mL無酶EP管中；再加300 μL氯仿，振蕩混勻，12 000 r·min-1 4 ℃低溫離心10 min，取上清液；加入等量異丙醇，混勻，-20 ℃靜置30 min，12 000 r·min-1 4 ℃低溫離心10 min，棄上清液；分別加入750 μL無水乙醇和250 μL DEPC水，12 000 r·min-1 4 ℃低溫離心10 min，棄上清液；晾干，約10 min，然后加入20 μL DEPC水，混勻，檢測RNA濃度。再把所有組稀釋至02 g·L-1。最后分別嚴(yán)格按照試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增等。

引物：Bax 上游：GACGAACTGGACAGTAACATGGA，下游：GCAAAGTAGAAAAGGGCGACA，產(chǎn)物長度149 bp，退火溫度61 ℃；Bcl2 上游： ACTTCGCCGAGATGTCCAG，下游：ACCCCACCGAACTCAAAGAA，產(chǎn)物長度136 bp，退火溫度61 ℃；Caspase3 上游：AAGGCAGAGCCATGGACCAC，下游：CTGGCAGCATCATCCACACATAC，產(chǎn)物長度81 bp，退火溫度64 ℃。

25數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)RTPCR圖像采用Image J軟件分析，數(shù)據(jù)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 220進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，各組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間數(shù)據(jù)多重比較采用LSD法，并結(jié)合Dunnett′s T3檢驗(yàn)，以P<005為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

31吉馬酮對(duì)H2O2損傷的HUVECs活性的影響設(shè)正常組的抑制率為0，則與正常組比較500 μmol·L-1H2O2組抑制率達(dá)50%以上，而H2O2損傷后用吉馬酮保護(hù)24 h，發(fā)現(xiàn)在較低濃度時(shí)影響不大，而隨著濃度的增大細(xì)胞的損傷程度減輕，見表1。形態(tài)學(xué)結(jié)果見圖1，與正常組比較，模型組細(xì)胞數(shù)目明顯減少，且細(xì)胞形態(tài)變圓；與模型組比較，給藥組的細(xì)胞明顯增加，并有一定的劑量差異。

1正常組；2模型組；3吉馬酮高劑量組（200 μmol·L-1）；4吉馬酮中劑量組（100 μmol·L-1）；5吉馬酮低劑量組（50 μmol·L-1）（圖2同）。

32吉馬酮對(duì)H2O2損傷的HUVECs細(xì)胞上清液中PGI2，TXB2，ET1，NO和TNOS含量的影響模型組與正常組比較，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGI2和總一氧化氮合酶（TNOS）含量減少（P<005），且NO釋放量也顯著減少（P<001）；而細(xì)胞培養(yǎng)液中TXB2和ET1的含量顯著增加（P<001）。與模型組比較，只有吉馬酮高劑量組使PGI2含量增加（P<005），而吉馬酮中劑量和高劑量組增加不明顯沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；200，100 μmol·L-1吉馬酮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNOS的含量顯著增加（P<001），NO的含量增加（P<005）；200，100，50 μmol·L-1吉馬酮都可以使TXB2含量減少（P<005），且高劑量變化明顯；200，100 μmol·L-1吉馬酮組細(xì)胞中的ET1含量顯著減少（P<001），而50 μmol·L-1組則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

33吉馬酮對(duì)H2O2損傷的HUVECs細(xì)胞裂解液中tPA和PAI1的影響與正常組比較，H2O2誘導(dǎo)后使tPA顯著減少（P<001），使PAI1顯著增加（P<001），tPA/PAI1的比值減少；與模型組比較，200，100 μmol·L-1吉馬酮組使tPA顯著增加（P<001），而50 μmol·L-1吉馬酮組幾乎沒有變化，200，100 μmol·L-1吉馬酮可抑制細(xì)胞中PAI1的生成（P<005），而低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

34吉馬酮對(duì)H2O2損傷的HUVECs細(xì)胞上清液中MDA，SOD，LDH和GSHPx的影響與正常組比較，H2O2損傷的HUVECs細(xì)胞釋放MDA和LDH的量明顯增加（P<005，P<001），細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD和GSHPx的含量減少（P<005）；與模型組比較，200，100 μmol·L-1吉馬酮組顯著抑制MDA 和LDH（P<001），200 μmol·L-1吉馬酮使細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD及GSHPx增加（P<005），吉馬酮中劑量和低劑量組中SOD及GSHPx的含量變化不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

35吉馬酮對(duì)H2O2損傷的HUVECs細(xì)胞裂解液中IL6和TNFα變化的影響與正常組比較，H2O2損傷的HUVECs細(xì)胞裂解液中IL6和TNFα的含量顯著性增加（P<001）。與模型組比較，200，100 μmol·L-1吉馬酮使H2O2損傷的HUVECs細(xì)胞裂解液中IL6的含量顯著性減少（P<001），同時(shí)細(xì)胞裂解液中TNFα的含量也明顯減少（P<001），而50 μmol·L-1吉馬酮組幾乎無變化，并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5。

36Hoechst 33258熒光染色觀察不同濃度吉馬酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞的凋亡情況的影響細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞核濃縮及細(xì)胞核碎裂等典型改變。熒光顯微鏡觀察可見Hoechst 33258熒光染色，對(duì)照組細(xì)胞呈均勻微弱的熒光，500 μmol·L-1H2O2作用HUVECs細(xì)胞后，細(xì)胞的體積、形態(tài)及細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)均發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞膜與細(xì)胞核呈濃縮致密的強(qiáng)藍(lán)色熒光，顯微鏡下可見大量的細(xì)胞碎片，并且細(xì)胞的死亡數(shù)量增加，細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。再用不同濃度吉馬酮（200，100，50 μmol·L-1）培養(yǎng)24 h后，與模型組比較，細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，細(xì)胞藍(lán)色熒光強(qiáng)度減弱，而且凋亡細(xì)胞的數(shù)量隨著藥物濃度的升高而減少，見圖2。

37不同濃度吉馬酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞中Bax，Bcl2，Caspase3 mRNA表達(dá)情況的影響與正常組比較，H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞后使HUVECs細(xì)胞中Bax mRNA和Caspase3 mRNA的表達(dá)增加，而Bcl2 mRNA的表達(dá)減少；與模型組比較，HUVECs細(xì)胞中Bax mRNA和Caspase3 mRNA的表達(dá)減少，而Bcl2 mRNA的表達(dá)增加，見表6，圖3。因此可知，一定劑量的吉馬酮具有改善H2O2所致HUVECs細(xì)胞氧化損傷所致細(xì)胞凋亡的能力。endprint

4小結(jié)與討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能非常復(fù)雜，是血液與組織間進(jìn)行物質(zhì)交換的屏障，其不但可以調(diào)節(jié)血小板的功能、激活促凝因子、清除活化后凝血因子和纖溶過程，還可以通過產(chǎn)生血管活性物質(zhì)從而調(diào)節(jié)血管張力[7]，其結(jié)構(gòu)和功能損傷與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[8]，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的因素很多，其中氧化應(yīng)激是造成血管內(nèi)皮損傷的主要原因之一。H2O2是體內(nèi)常見的活性氧，可促進(jìn)自由基生成，如生物體內(nèi)的H2O2沒有及時(shí)清除則可透過細(xì)胞膜，會(huì)造成脂質(zhì)過氧化而導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。氧化應(yīng)激水平的提高不僅可以導(dǎo)致細(xì)胞損傷、甚至可致死細(xì)胞，氧化損傷還是一些神經(jīng)退行性疾病、艾滋病和腦病重要的發(fā)病機(jī)制[9]。因此抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷對(duì)一些血管性病變的防治具有重要意義[10]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞的代謝與增殖情況可以提高其活性程度來反映[11]，利用MTT測定結(jié)果可以反映細(xì)胞的活性程度[12]。本實(shí)驗(yàn)通過建立H2O2損傷HUVECs細(xì)胞模型，從而模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷，再利用吉馬酮對(duì)H2O2損傷HUVECs細(xì)胞的相關(guān)作用進(jìn)行研究。MTT 法檢測發(fā)現(xiàn)，吉馬酮能夠增強(qiáng)H2O2損傷所致HUVECs細(xì)胞的細(xì)胞活力，在顯微鏡下觀察可知，與正常組比較，模型組細(xì)胞數(shù)目明顯減少，且細(xì)胞形態(tài)變圓；與模型組比較，給藥組的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并且在高劑量時(shí)細(xì)胞的數(shù)量最多。

MDA是氧自由基的攻擊細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量可以反映氧自由基的水平及脂質(zhì)過氧化的程度，MDA還可與核酸或蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)現(xiàn)象，而發(fā)生損傷，MDA不僅是細(xì)胞損傷的代謝產(chǎn)物，而且是導(dǎo)致細(xì)胞損傷的原因之一[13]。LDH是內(nèi)皮細(xì)胞損傷后的代謝產(chǎn)物，它的活力強(qiáng)弱可以用來反映細(xì)胞的損傷程度。因此，本實(shí)驗(yàn)通過測定LDH和MDA含量來反映內(nèi)皮細(xì)胞損傷的情況和程度。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，H2O2損傷后HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和MDA含量增加，加入吉馬酮培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)，HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和MDA含量明顯減少，由此可知吉馬酮可能具有增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化及抑制脂質(zhì)的過氧化作用。SOD和GSHPx等屬于內(nèi)源性抗氧化酶，能夠清除氧自由基，從而保護(hù)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷沒有特別嚴(yán)重時(shí)還可對(duì)其進(jìn)行修復(fù)[14]。為研究吉馬酮的抗氧化作用，本實(shí)驗(yàn)檢測了吉馬酮對(duì)H2O2損傷的HUVECs細(xì)胞SOD和GSHPx的釋放影響。試驗(yàn)結(jié)果說明，吉馬酮保護(hù)培養(yǎng)24 h后細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD和GSHPx活性明顯增強(qiáng)，則吉馬酮具有緩解BMECs細(xì)胞損傷的作用，從而保持其完整性。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是合成前列環(huán)素（PGI2）的主要場所，PGI2可以舒張血管平滑肌、擴(kuò)張血管，同NO都具有抑制血小板聚集；血栓素（TXA2）具有血小板凝聚和血管收縮作用，其與PGI2兩者動(dòng)態(tài)平衡以維持血管收縮功能及血小板聚集作用，而TXA2生物半衰期非常之短，迅速轉(zhuǎn)化為無活性的血栓素B2（TXB2），因此常檢測TXB2的含量[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2O2誘導(dǎo)使HUVECs 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGI2的含量降低，而TXB2的生成量顯著增加，TNOS的含量減少，NO的含量也相隨減少；吉馬酮在較大劑量時(shí)可致?lián)p傷后HUVECs細(xì)胞PGI2的分泌量增加，TXB2的生成減少，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNOS和NO的含量也增加。從而維持血管收縮功能及血小板聚集作用。ET1是如今以來作用最強(qiáng)的血管收縮物。而PAI1和tPA主要由VEC合成和分泌，分別纖溶酶原激活抑制物和纖溶酶原的激活物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吉馬酮可以明顯減少H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ET1含量增加；H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞裂解液中tPA含量顯著性降低，PAI1含量顯著增加，可見H2O2可導(dǎo)致HUVECs細(xì)胞纖溶功能出現(xiàn)異常，加入吉馬酮可明顯抑制細(xì)胞產(chǎn)生PAI1，促進(jìn)tPA的生成，改善tPA/PAI1，從而保護(hù)HUVECs細(xì)胞和使其纖溶功能恢復(fù)正常。

臨床上診斷炎癥反應(yīng)的常用指標(biāo)是炎癥因子的含量：腫瘤壞死因子α（TNFα） 是體內(nèi)非常重要的一種炎癥細(xì)胞因子，在炎癥過程中發(fā)揮著重要的作用，其含量水平可以反映H2O2損傷HUVECs細(xì)胞的炎癥損傷程度；IL6為另外一種主要的炎癥因子，其自身不僅能夠介導(dǎo)炎癥的發(fā)生，還能夠促進(jìn)TNFα的生成[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2損傷后HUVECs細(xì)胞中IL6和TNFα的含量顯著增加；加入吉馬酮保護(hù)24 h后，HUVECs細(xì)胞中IL6和TNFα的生成量的以緩解。以上結(jié)果可以看出，吉馬酮可以抑制H2O2損傷后HUVECs細(xì)胞中IL6和TNFα的生成，從而緩解H2O2損傷導(dǎo)致的HUVECs細(xì)胞的炎癥。

細(xì)胞凋亡是一種有多種基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡的過程，主要表現(xiàn)為細(xì)胞核濃縮及細(xì)胞核碎裂等典型改變。其中Bcl2基因家族發(fā)揮重要作用，基因Bcl2和Bax都屬于Bcl2基因家族，Bcl2基因抑制細(xì)胞凋亡、Bax基因促細(xì)胞凋亡，二者相互作用、共同協(xié)調(diào)細(xì)胞凋亡過程，Bcl2不但可以通過控制細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)來保護(hù)細(xì)胞生存，其還可以和Bax蛋白結(jié)合，從而抑制細(xì)胞凋亡。因此Bcl2/Bax越小，細(xì)胞凋亡情況越嚴(yán)重[17]。細(xì)胞凋亡途徑有細(xì)胞表面死亡受體途徑和線粒體引發(fā)途徑2種，2種途徑都能激活處于細(xì)胞凋亡途徑下游的Caspase3及其他下游的Caspase效應(yīng)子，激活的Caspase3能裂解大量底物使細(xì)胞凋亡[18]。本實(shí)驗(yàn)通過Hoechst 33258熒光染色觀察后可知，H2O2作用HUVECs細(xì)胞后，細(xì)胞的體積、形態(tài)及細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)均發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞膜與細(xì)胞核呈濃縮致密的強(qiáng)藍(lán)色熒光，顯微鏡下可見大量的細(xì)胞核碎片，并且細(xì)胞的死亡數(shù)量增加，細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。再用吉馬酮培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，細(xì)胞藍(lán)色熒光強(qiáng)度減弱，細(xì)胞碎片也減少，而且凋亡細(xì)胞的數(shù)量隨著藥物濃度的升高而減少。再利用RTPCR法檢測可知，H2O2誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞后使HUVECs細(xì)胞中Bax mRNA和Caspase3 mRNA的表達(dá)增加，而Bcl2 mRNA的表達(dá)減少；吉馬酮保護(hù)培養(yǎng)24 h后HUVECs細(xì)胞中各相關(guān)基因的生成趨于正常。endprint

綜上所述，吉馬酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HUVECs細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制可能與以下作用相關(guān)：①吉馬酮可以改善細(xì)胞的形態(tài)和生長、增殖率；②吉馬酮可以緩解H2O2誘導(dǎo)損傷HUVECs細(xì)胞后LDH和MDA含量釋放，且可增加SOD和GSHPX活性，而提高抗氧化能力，清除自由基對(duì)HUVECs細(xì)胞的損害；③增加血管活性物質(zhì)PGI2和NO等生成，減少血管收縮物TXB2和ET1的生成；④抑制炎癥因子的釋放；⑤抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。

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[責(zé)任編輯張寧寧]endprint