張迪夏 薇蘆瑤

【摘要】目的：比較含12%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基與含12%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG-2細胞的效果。方法：采用舍12%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基與含12%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG-2細胞，觀察細胞的生長狀態(tài)，細胞的貼壁情況，并進行細胞計數。結果：含12%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中的細胞生長狀態(tài)更好，細胞的存活率更高。結論：在對HepG-2細胞進行細胞培養(yǎng)時建議首選含12%新生牛血清的RPMI-1640。

【關鍵詞】DMEM； HepG-2；RPMI-1640

當前大部分學者在對貼壁細胞進行細胞培養(yǎng)時通常選用PRMI-1640培養(yǎng)液或DMEM培養(yǎng)液，故在對HeoG-2細胞進行細胞培養(yǎng)時也可應用PRMI-1640培養(yǎng)液或DMEM培養(yǎng)液。但已有研究發(fā)現[1]：由于PRMI-1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基中各成分不同，尤其是氨基酸，維生素和葡萄糖的含量差別很大，因此對細胞的生長速度和生長狀態(tài)產生一定影響。在體外細胞培養(yǎng)的過程中，細胞生長狀態(tài)的好壞和細胞生長速度的快慢等方面與細胞培養(yǎng)基的選擇有著密不可分的聯系。已有研究表明：在細胞培養(yǎng)基的制備過程中，需要在培養(yǎng)基中添加一定含量的生物性液體或組織提取液才能支持細胞的正常生長，由于血清中含有天然促生長因子，可以促進細胞貼壁，因此成為被廣泛采用的培養(yǎng)基添加物，最常用的為新生牛血清[2]。趙翔[3]等人在研究PRMI-1640和DMEM培養(yǎng)基中對Hep G2的影響時并沒有充分考慮到血清濃度對于HepG-2細胞的影響，選用的為濃度為10%新生牛血清并且沒有加入一定量的雙抗。但已有研究表明由于人肝癌細胞株生長緩慢，惡性程度較高，因此對于血清的要求比較嚴格，其培養(yǎng)時所需要新生牛血清的濃度要比一般的腫瘤細胞高一些。因此本實驗應用PRMI-1640和DMEM培養(yǎng)基加入12%新生牛血清和0.5%的雙抗對Hep G2人肝母細胞瘤進行培養(yǎng)。希望為選擇適合于Hep G2細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的選擇提供實驗依據。

1材料與方法

1.1材料

（1）HepG-2細胞株由北華大學提供；

（2） RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基均購自美國GIBCO公司；

（3）新生牛血清購于杭州四季青公司。

1.2方法

1.2.1細胞復蘇

從液氮箱中取出凍存管，快速轉移至細胞間，放入37攝氏度恒溫水浴箱中進行均勻搖晃，盡量讓細胞在1分鐘內解凍。解凍后使用含75%的酒精噴灑凍存管的管口和管身對凍存管進行消毒。消毒后轉移至超凈工作臺內進行復蘇。將凍存管內液體轉移至15ml離心管內，700轉/min進行離心，離心后，吸去上清。

1.2.2培養(yǎng)基的選擇

方法一：1640培養(yǎng)液

取1640培養(yǎng)粉215.6g和碳酸氫鈉39溶解于1170ml高壓滅菌的雙蒸水當中，用磁力攪拌器攪拌至其完全溶解，用1mol/1NaCl將PH調至7.2，定容至1.5L，過濾除菌后4攝氏度進行保存。吸去上清后加入30ml含12%新生牛血清和0.5雙抗的1640培養(yǎng)基，用移液槍小心吹打細胞混勻后加入細胞培養(yǎng)板，每孔5ml，共6孔，放入5%CO₂，溫箱37℃進行培養(yǎng)。

方法二：DMEM培養(yǎng)液

取DMEM培養(yǎng)粉20.1g溶解于1200ml高壓滅菌的雙蒸水當中，用磁力攪拌器攪拌至其完全溶解，向溶液中加入碳酸氫二鈉5.55g，繼續(xù)攪拌至其完全溶解，用1mol/l氯化鈉將PH調至7.2，混合均勻后，定容至1.5L，過濾除菌后4攝氏度進行保存。吸去上清后加入30ml含12%新生牛血清和0.5%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，用移液槍小心吹打細胞混勻后加入細胞培養(yǎng)板，每孔5ml，共6孔，放入5%CO₂，溫箱37℃進行培養(yǎng)。

1.2.3細胞換液

取出培養(yǎng)箱中的細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。吸棄廢液，用PBS進行洗滌三次，再用細胞液進行洗滌1次，兩組各加入含有12%的新生牛血清的1640培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液。

1.2.4細胞傳代

待細胞貼壁情況達至80-90%時并且細胞生長狀態(tài)良好時可以進行細胞傳代培養(yǎng)。小心吸棄廢液，用PBS進行洗滌三次，再用細胞培養(yǎng)液進行洗滌一次。加入0.25%胰酶進行消化，放入培養(yǎng)箱中每隔2min進行鏡下觀察一次，待細胞變圓后可輕輕拍打培養(yǎng)盤，待貼壁細胞大部分下來后，加入細胞培養(yǎng)液終止消化，用尖吸頭吹打細胞并轉移至離心管中，700轉/min離心5min，小心吸棄廢液，加入一定量的細胞培養(yǎng)液進行吹打混勻，大約吹打50-100次后轉移至培養(yǎng)皿中。

1.2.5細胞形態(tài)觀察

各組細胞分別培養(yǎng)12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h后在倒置顯微鏡下進行觀察，觀察細胞貼壁情況，細胞的生長程度，有無細胞碎片或死細胞。

1.2.6細胞計數

酒精棉球擦蓋玻片，將其放在計數板的槽上。將PBS與臺盼蘭按照1：1組成混合液。取9ul細胞懸液和9ul混合液混合均勻于1.5ml離心管中，蓋上蓋玻片，取12ul混合液自血球計數盤上方加入，于10倍顯微鏡下進行觀察，活細胞不著色，著色呈藍色的為死細胞。分別計數落在計數盤上四個大方格上的細胞數量，將4個大方格上數量相加得到細胞的總數量，除以4，乘以稀釋倍數，最后乘以10000，即為每毫升細胞懸液中細胞數。

2結果

2.1細胞形態(tài)

RPMI-1640與DMEM培養(yǎng)液（含12%新生牛血清）培養(yǎng)細胞24h后，兩組細胞均部分貼壁，生長狀態(tài)良好，上層有少許未貼壁的細胞，并沒有特別大的差別。在細胞培養(yǎng)48h后，在RPMI-1640培養(yǎng)液中的細胞飽滿、細胞呈堆積生長，單個細胞形態(tài)不明顯。細胞堆積后呈梭形或多邊形，多數細胞呈分裂狀態(tài)。培養(yǎng)60h后RPMI-1640培養(yǎng)液中細胞狀態(tài)尚可，72h后出現少許黑色顆粒疑似死細胞，細胞液開始出現渾濁現象。但貼壁情況和其他細胞生長狀態(tài)良好，84h開始出現死細胞。培養(yǎng)48h后，DMEM培養(yǎng)液中開始出現黑色顆粒疑似死細胞，細胞也呈堆積生長，但堆積的貼壁細胞中有圓圓的透明顆粒，細胞液開始出現渾濁現象。72h后DMEM培養(yǎng)液中出現明顯死細胞，細胞狀態(tài)稍差。

2.2細胞數量

RPMI-1640與DMEM完全培養(yǎng)液（含12%新生牛血清）培養(yǎng)細胞生長情況以培養(yǎng)時間為橫座標，以細胞量（×10000）為縱座標進行繪圖，見圖1。

3討論

原發(fā)性肝癌具有發(fā)病率高和死亡率高等特點，其中50%發(fā)生在我國，由于治療困難，因此死亡率也一直居高不下，嚴重威脅到了我國人民群眾的生活和健康，因此對其研究勢在必行。

細胞在體外得以生長、增殖需要大量的營養(yǎng)物質和氨基酸，因此培養(yǎng)基的選擇是體外細胞培養(yǎng)能否成功的關鍵因素之一。RPMI-1640細胞培養(yǎng)基是由Moore等人于1967年研制，含21種氨基酸和維生素11種等。DMEM是由Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，DMEM含有14種氨基酸和多種維生素。其中葡萄糖含量為4500mg/L。

從細胞培養(yǎng)的情況來看，在含有12新生牛血清和0.5雙抗的DMEM培養(yǎng)液中HepG-2細胞在48 h內細胞長勢良好貼壁狀態(tài)良好，但48h后細胞開始出現死亡現象。在含有12新生牛血清和0.5雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中HepG-2細胞24h后的貼壁情況和細胞數量明顯優(yōu)于DMEM培養(yǎng)液中的細胞，并且出現死亡細胞的時間明顯長于DMEM培養(yǎng)液中的細胞。

由于DMEM中含有大量的葡萄糖，RPMI-1640含有大量的氨基酸和維生素，而氨基酸和維生素種類更多的培養(yǎng)液更有益于細胞生長，而由于腫瘤細胞惡性程度比較高，因此選用血清濃度較高的RPMI-1640培養(yǎng)液更有助于HepG-2細胞的生長。

參考文獻

[1]Zhong ZH， Yang H，Liu YH.Hunan YixueGaodengZhuankeXuexiaoXuebao，2003，5（04）：7-8.鐘志宏，楊昊，柳永和.Hep G-2細胞體外培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].湖南醫(yī)學高等?？茖W校學報，2003，5（04）：7-8.

[2]唐瑩，馮君.動物細胞培養(yǎng)基的發(fā)展及應用[J].中國臨床康復，2006（41）：146-148.

[3]趙翔，張沙，肖軍軍，林明.RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基中肝癌細胞系BEL-7402與HepG-2的生長狀態(tài)比較[J].中國組織工程研究與臨床康復，2011， 15（11）： 2002-2005.