劉卜瑋，王 杰，陳仕毅，賈先波，賴松家

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種研究所，四川成都 611130）

AANAT基因編碼區(qū)多態(tài)性與家兔生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

劉卜瑋，王 杰，陳仕毅，賈先波，賴松家*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種研究所，四川成都 611130）

為研究五羥色胺-N-乙?；D(zhuǎn)移酶（AANAT）基因編碼區(qū)（CDS區(qū)）多態(tài)性和家兔生長性狀的關(guān)聯(lián)性，以天府黑兔、伊拉兔和新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)材料，對AANAT基因的外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，直接測序檢測家兔AANAT基因外顯子的單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果表明：在3個(gè)兔品種的CDS區(qū)上均發(fā)現(xiàn)有5個(gè)完全連鎖突變位點(diǎn)，分別是C.132 T>C、C.153T>C、C.159 A>T、C.234 A>G、C.291 A>G，形成了野生型TTTTAAAAAA、雜合型TCTCATAGAG、突變型CCCCTTGGGG 3種基因型，突變型新西蘭兔在56、70、84日齡的體重顯著高于野生型和雜合型（P＜0.05），而突變型伊拉兔和天府黑兔在70、84日齡的體重顯著高于雜合型和野生型（P＜0.05）。綜上可知，AANAT基因可作為肉兔生長性狀的候選基因。

家兔；AANAT；單核苷酸基因多態(tài)性；生長性狀

我國是養(yǎng)兔大國，也是兔肉出口大國。家兔是一種非常重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，它既可以食用，也可以作為工業(yè)原料、觀賞動(dòng)物、醫(yī)用模型等。五羥色胺-N-乙?；D(zhuǎn)移酶（AANAT）是褪黑激素（Melatonin，MT）合成過程的限速酶[1]。MT在生物體內(nèi)具有調(diào)控動(dòng)物的生長、應(yīng)激、炎癥、晝夜節(jié)律、視網(wǎng)膜信號(hào)以及發(fā)情泌乳等重要功能[2-4]。近些年來研究發(fā)現(xiàn)，在AANAT基因mRNA的5'UTR上面有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES），晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)依靠IRES的活性，在夜間，核內(nèi)不均一核糖核蛋白Q（hnRNP Q）作用于IRES，使其活性顯著增加，影響AANAT基因轉(zhuǎn)錄以及MT的合成[5]。目前，AANAT基因在家畜上面的研究比較少，但是作為MT的限速酶，其對家畜的生產(chǎn)可能起著重要作用。本研究將對家兔AANAT基因的編碼區(qū)單（CDS區(qū)）核苷酸多態(tài)性和兔的生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，從而為家兔的分子育種工作提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取四川農(nóng)業(yè)大學(xué)育種場的天府黑兔122只，成都金堂育種場的伊拉兔124只，新西蘭兔281只作為實(shí)驗(yàn)材料。在90日齡對家兔進(jìn)行耳組織采樣，樣品放在含有75%酒精的1.5 mL離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耳組織DNA的提取 將耳組織樣從-80℃冰箱中取出并解凍，從離心管中取出耳組織并用無菌濾紙擦干，用眼科剪剪去耳組織表面的兔毛，然后剪碎耳組織放入新的EP管中備用；使用TIANGEN公司的TIAN amp Genomic DNA Kit 基因組DNA提取試劑盒按照說明書步驟提取耳組織的DNA，放置在-20℃冰箱備用。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增 使用Primer Premier 6根據(jù)NCBI網(wǎng)站家兔AANAT基因（GeneID:100357535）外顯子序列設(shè)計(jì)引物，再由成都擎科生物公司合成引物，引物序列如表1所示。

確定引物退火溫度，PCR反應(yīng)體系采用10 μL體系：Mix 5 μL，ddH2O 3.2 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min，95℃30 s，55～63℃ 30 s，72℃ 1 min，39個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，72℃10 min，4℃保存。然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，選取最亮條帶對應(yīng)的溫度為引物的退火溫度。

表1 AANAT基因引物序列

混管測序，按照各個(gè)引物的退火溫度進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，每對引物選取16個(gè)條帶明亮的PCR產(chǎn)物，每個(gè)PCR產(chǎn)物取4 μL，每4個(gè)PCR產(chǎn)物混成一管送至成都擎科生物公司進(jìn)行測序。

分型，混管測序后，發(fā)現(xiàn)第1、2、3外顯子無突變，4、5、6外顯子上面有突變，把527個(gè)DNA樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，并送至成都擎科生物有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析 使用Seqman軟件查看測序結(jié)果，并和NCBI上AANAT基因序列做比較，混管測序發(fā)現(xiàn)，AANAT基因外顯子1、2、3上面沒有發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，在外顯子4、5、6的CDS區(qū)發(fā)現(xiàn)5個(gè)同義突變位點(diǎn)；再對527個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行單管測序，經(jīng)統(tǒng)計(jì)表明，CDS區(qū)的5個(gè)突變位點(diǎn)完全連鎖；利用codonw計(jì)算RSCU（同義密碼子相對使用度），結(jié)果見表2和圖1。

2.2 對AANAT基因類型和家兔生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析 由表3可知，突變型新西蘭兔在56、70、84日齡的體重顯著高于野生型和雜合型（P<0.05），而突變型伊拉兔和天府黑兔在70、84日齡的體重顯著高于雜合型和野生型（P<0.05）。各個(gè)突變位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)達(dá)到中度多態(tài)（0.250.05)。

3 討 論

圖1 AANAT基因的突變位

表2 AANAT基因CDS的突變位點(diǎn)

表3 AANAT基因類型和家兔生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析

動(dòng)物的生長受很多基因控制，這種現(xiàn)象稱為微效多基因現(xiàn)象，如FTO[6]、IGFBP-5[7]、TBC1D1[8]等，這些基因?qū)彝玫纳L都起著調(diào)控作用。在動(dòng)物的松果體中，AANAT基因編碼1個(gè)乙酰轉(zhuǎn)移酶超家族蛋白[9]，對MT的合成起著重要的調(diào)控作用，是MT合成過程的限速酶[10]。MT合成是以色氨酸為原料，通過羥化、脫羧、乙?；⒀跫谆詈蠛铣蒑T，在脊椎動(dòng)物中MT的主要作用有調(diào)節(jié)生物節(jié)律[11]、促進(jìn)褐色脂肪生成[12]、抑制促性腺激素釋放激素（GnRH）的釋放[13]等，從而調(diào)控動(dòng)物的生長以及性成熟[14-15]。在家畜中，Kashani等[16]研究發(fā)現(xiàn)，AANAT基因的表達(dá)跟脂肪代謝有直接關(guān)系，在山羊的日糧中添加螺旋藻提取物，使AANAT基因mRNA的表達(dá)量上升，提高了不飽和脂肪酸的含量，不利于山羊肌間脂肪的沉積。郝園麗[17]研究發(fā)現(xiàn)，AANAT基因的多態(tài)性對雞的產(chǎn)蛋和開產(chǎn)日齡有顯著影響，-708和-615位點(diǎn)連鎖，單倍型TA使母雞開產(chǎn)日齡延后10.3 d，-619和-595位點(diǎn)連鎖，GC單倍型使母雞的中期產(chǎn)蛋提高10.6枚。郭振剛等[18]研究發(fā)現(xiàn)，AANAT基因的第1個(gè)外顯子129 bp處G>C、132 bp處C>T、141 bp處C>T，AA基因型對產(chǎn)絨量和絨長度有極顯著的正效應(yīng)，第2個(gè)外顯子590 bp處C>T也對產(chǎn)絨量、絨長度和褪黑素含量有極顯著正效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)在伊拉兔、天府黑兔和新西蘭兔基因的CDS區(qū)中均發(fā)現(xiàn)5個(gè)完全連鎖的同義突變多態(tài)位點(diǎn)，分別是C.132T>C、C.153 T>C、C. 159 A>T、C.234 A>G、C.291A>G，同義突變雖然沒有改變蛋白質(zhì)中氨基酸的組成，但是近年來的研究也表明，編碼同一種氨基酸的不同密碼子存在著使用偏好，這可以對基因的轉(zhuǎn)錄效率、mRNA的剪切以及空間結(jié)構(gòu)、翻譯效率等產(chǎn)生影響，從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能以及合成效率[19-21]。本實(shí)驗(yàn)僅研究了AANAT基因CDS區(qū)上面的突變位點(diǎn)和家兔生長性狀的相關(guān)性，突變位點(diǎn)對AANAT基因的mRNA、蛋白質(zhì)以及MT的表達(dá)量影響有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，突變型新西蘭兔在56、70、84日齡的體重顯著高于野生型和雜合型，而突變型伊拉兔和天府黑兔在70日齡和84日齡的體重顯著高于雜合型和野生型，伊拉兔、天府黑兔和新西蘭兔群體AANAT基因的CDS突變屬于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），AANAT基因可以作為家兔生長性狀的候選基因，AANAT基因CDS區(qū)上面的突變對家兔的生長有調(diào)節(jié)作用，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究家兔育種提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，家兔AANAT基因編CDS區(qū)的C.132 T>C、C.153 T>C、C. 159 A>T、C.234 A>G、C.291 A>G位點(diǎn)的多態(tài)性與家兔的生長性狀顯著相關(guān)。

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Association Analysis between Polymorphism of Coding Sequence of AANAT Gene and Growth Traits of Rabbits

LIU Bu-wei, WANG Jie, CHEN Shi-yi, JIA Xian-bo, LAI Song-jia*

(Institute of Animal Genetics and Breeding, Sichuan Agricultural University, Sichuan Chengdu 611130, China)

To study the association between Coding sequence(CDS)of five HT -N- acetyltransferase gene ( AANAT )polymorphism and growth traits in rabbits. In the study we used direct sequencing method to detect single nucleotide polymorphism of exons of AANAT gene region with Tianfu black rabbit, IRA rabbit and New Zealand rabbit as experimental materials. There were 5 complete linkage mutation sites(C.132 T＞C, C.153T＞C, C. 159 A＞T, C.234 A＞G, C.291A＞G) in the CDS of AANAT gene in the three rabbit breeds. 3 genetypes(wild type: TTTTAAAAAA, heterozygous: TCTCATAGAG mutant type: CCCCTTGGGG ) were formed. In New Zealand, the 56, 70 and 84 days body weight of mutant type was significantly higher than those of other types rabbits and in the IRA rabbit and Tianfu black rabbit (P＜0.05),70 and 84 days body weight were higher (P＜0.05). The AANAT gene can be used as a candidate gene for growth traits in rabbit.

Rabbit ; AANAT gene; SNP; Growth performance

S829.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-10-025

2017-03-23；

2017-04-26

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2016NYZ0046、2016NYZ0050）

劉卜瑋（1993-），男，四川南充人，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖，E-mail：liubuwei@yeah.net

*通訊作者：賴松家，教授，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)與兔遺傳育種，E-mail: laisj5794@gmail.com