何軍敏，孫 軍，余 雄，阿依達(dá)爾.霍江臺(tái)，木合依扎.熱很別克，黃錫霞*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.特克斯縣畜牧獸醫(yī)局，新疆特克斯 835500）

MC1R與Slc7a11基因多態(tài)性與哈薩克羊毛色相關(guān)的研究

何軍敏1，孫 軍2，余 雄1，阿依達(dá)爾.霍江臺(tái)2，木合依扎.熱很別克1，黃錫霞1*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.特克斯縣畜牧獸醫(yī)局，新疆特克斯 835500）

本研究采集新疆伊犁哈薩克自治州特克斯縣4種不同被毛顏色2～3周歲的220只哈薩克母羊血樣用于提取DNA，其中黑色被毛羊52只，棕色被毛羊52只，青灰色被毛羊59只，白色被毛羊57只；并采集綿羊左側(cè)肩胛皮膚樣本，每種毛色各10個(gè)，用于組織形態(tài)學(xué)觀察。本研究運(yùn)用PCR-SSCP技術(shù)及測(cè)序技術(shù)對(duì)MC1R基因及Slc7a11基因多態(tài)性及其對(duì)哈薩克羊毛色的影響進(jìn)行研究。運(yùn)用皮膚樣本制作切片用于不同毛色組織形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果表明：MC1R基因突變位點(diǎn)在白色和棕色被毛群體中，只存在BB基因型；而在黑色和青灰色被毛群體中，存在AA、AB和BB 3種基因型；且AB基因型均為優(yōu)勢(shì)基因型，A等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。由組織形態(tài)學(xué)觀察可知，黑色和青灰色被毛組織毛囊分布極為相似，毛囊分布稀疏且皮脂腺發(fā)達(dá)；棕色被毛最具特色，毛囊叢分布明顯，皮脂腺分布不發(fā)達(dá)；白色被毛毛囊分布最為密集，且皮脂腺分布密集并且最為發(fā)達(dá)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，MC1R基因的基因型頻率在4種毛色羊中的分布差異極顯著（P<0.01）。Slc7a11基因位點(diǎn)在伊犁哈薩克羊群體中發(fā)現(xiàn)其不存在多態(tài)性。

哈薩克綿羊；MC1R基因；Slc7a11基因；PCR-SSCP；遺傳多態(tài)性

哈薩克綿羊是我國(guó)3大綿羊品種之一，同時(shí)也是新疆的優(yōu)秀地方綿羊品種。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于MC1R基因?qū)_克羊毛色影響的研究報(bào)道較少，尤其本研究中哈薩克羊群體存在4種毛色，目前僅在特克斯縣發(fā)現(xiàn)第4種毛色的哈薩克羊。孫浩浩[1]研究報(bào)道了TYR基因、ASIP基因多態(tài)性在綿羊中的相關(guān)分析。毛色受TYR、ASIP、MC1R、TYRP1等多種基因控制和影響，其通過(guò)參與生物合成活性或者調(diào)節(jié)有關(guān)黑色素生成細(xì)胞的分布過(guò)程等來(lái)調(diào)控毛色[2-3]。MC1R與黑色素細(xì)胞刺激激素α結(jié)合激活腺苷酸環(huán)化酶（cAMP），最終增加了黑色素的合成[4]。當(dāng)Slc7a11基因突變后，導(dǎo)致其編碼的蛋白缺乏，使得氨基酸在轉(zhuǎn)運(yùn)載體時(shí)失去功能，導(dǎo)致細(xì)胞不能攝取到足夠的胱氨酸，因此無(wú)法還原成半胱氨酸，從而無(wú)法滿足細(xì)胞中合成偽黑色素的需要，最終導(dǎo)致毛色主要表現(xiàn)為真黑色素的黑顏色，從而缺乏由偽黑色素產(chǎn)生的黃色[5-7]。王樂(lè)等[8]總結(jié)了目前MC1R基因在各種動(dòng)物中的研究，但關(guān)于哈薩克羊存在青灰色被毛的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究特克斯縣哈薩克羊形成4種毛色的原因，從而進(jìn)一步了解哈薩克羊毛色形成的規(guī)律，完善哈薩克羊毛色基因的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究采集新疆伊犁哈薩克自治州特克斯縣4種不同被毛顏色2～3周歲的220只哈薩克母羊血樣及40個(gè)肩胛皮膚組織，所有綿羊毛色均為純色，不含有任何斑點(diǎn)或其他雜色，頭毛與蹄毛均與被毛一致，均為純色。其中黑色被毛樣本52個(gè)，棕色被毛樣本52個(gè)，青灰色被毛樣本59個(gè)，白色被毛樣本57個(gè)，血樣-20℃保存用于提取基因組DNA；采集綿羊左側(cè)肩胛皮膚組織每種毛色各10個(gè)，用福爾馬林保存用于組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.2 方法 綿羊血樣基因組DNA運(yùn)用酚-氯仿法進(jìn)行抽提。皮膚組織由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院組織切片制作室進(jìn)行切片制作。運(yùn)用PCR-SSCP技術(shù)分析MC1R基因在不同顏色被毛哈薩克羊的多態(tài)性，以提取的綿羊基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系參照Taq DNA聚合酶說(shuō)明書。運(yùn)用顯微鏡進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察并進(jìn)行圖像采集。

表1 PCR擴(kuò)增的引物序列

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 本研究MC1R基因（GenBank登錄號(hào)為FN600553）引用李洪濤[9]的引物序列，Slc7a11基因（GenBank登錄號(hào)為JQ085938）采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工合成，引物序列如表1所示。

1.2.2 PCR擴(kuò)增程序的建立 PCR擴(kuò)增條件：經(jīng)94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，MC1R基因61℃、Slc7a11基因59℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。于低溫保存待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系的建立 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL，其中 10 μL 2× PCR Master Mix，1 μL DNA 模板，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，8 μL ddH2O 。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序 經(jīng)過(guò)普通PCR擴(kuò)增及2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，將PCR產(chǎn)物送到上海生工進(jìn)行單向測(cè)序。

1.2.5 PCR-SSCP過(guò)程 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，取3 μL的PCR產(chǎn)物，加入7 μL 上樣緩沖液（9.8 mL甲酰胺，10 mg 溴酚藍(lán)，10 mg二甲苯青， 0.5 mol/LEDTA 0.2 mL）混合，98℃變性10 min，立即冰浴15 min，并用12%聚丙烯酰胺凝膠（高板）進(jìn)行電泳檢測(cè)。300 V 預(yù)電泳5 min 使樣品快速入膠，然后室溫恒壓180 V 電泳16～18 h。銀染液顯色后拍照，統(tǒng)計(jì)各基因型的個(gè)體數(shù)。

1.2.6 組織切片制作 皮膚組織送往蘭州軍區(qū)總醫(yī)院組織切片制作室進(jìn)行切片制作，對(duì)皮膚組織進(jìn)行橫切后制成切片，運(yùn)用顯微鏡進(jìn)行觀察并采集圖片。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)，并進(jìn)行多態(tài)信息含量（PIC）、遺傳純合度（Ho）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne）的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織形態(tài)學(xué)觀察 由圖1可知，在白色被毛組織中，毛囊分布密集但并未形成明顯的毛囊叢，毛囊分布均勻。皮脂腺分布密集較為發(fā)達(dá)。由圖2可知，在黑色被毛皮膚組織中，毛囊分布較白色稀疏，同樣未有明顯的毛囊叢存在，皮脂腺發(fā)達(dá)并且分布均勻。由圖3可知，在青灰色皮膚組織中，與黑色皮膚組織極為相似，毛囊分布稀疏，皮脂腺發(fā)達(dá)，分布均勻。由圖4可知，在棕色皮膚組織中，形成了明顯的毛囊叢，單一的毛囊叢中毛囊分布密集，毛囊叢之間分布較為離散，皮脂腺不發(fā)達(dá)。

圖1 白色被毛皮膚組織（100×）

圖2 黑色被毛皮膚組織（100×）

圖3 青灰色被毛皮膚組織（100×）

圖4 棕色被毛皮膚組織（100×）

2.2 DNA完整性檢測(cè)結(jié)果 將提取的基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)提取的基因組DNA模板質(zhì)量良好、純度高、不需要純化，可直接用作模板DNA。

2.3 MC1R基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，可知MC1R與Slc7a11基因引物PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為169 bp和237 bp，與生物公司提供片段符合。結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增特異性良好，片段長(zhǎng)度一致，引物的片段長(zhǎng)度符合預(yù)期大小，可直接用于PCR-SSCP的分析。

2.4 MC1R和Slc7a11基因的PCR-SSCP多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果 如圖5、6所示，MC1R基因存在3種不同的帶型，將其命名為AA、AB、BB型；Slc7a11基因均為AA基因型，不存在多態(tài)性。

圖5 MC1R的SSCP

圖6 Slc7a11基因的SSCP產(chǎn)物

2.5 MC1R序列分析 由測(cè)序結(jié)果分析可知，在哈薩克羊群體中發(fā)現(xiàn)此序列在91 bp處發(fā)生突變（圖7）。由AA基因型突變?yōu)锽B基因型，AB為雜合子。通過(guò)對(duì)氨基酸序列的分析發(fā)現(xiàn)，其A91T突變點(diǎn)為非同義突變，由甲硫氨酸突變?yōu)橘嚢彼帷?/p>

2.6 MC1R的遺傳多態(tài)性分析 由表2可知，MC1R基因在不同毛色中均有差異。在白色和棕色被毛群體中，只存在BB基因型；在黑色被毛群體中，存在AA、AB和BB 3種基因型，其基因型頻率分別為0.27、0.71和0.02，且BB基因型頻率所占比例極小。由此可知，AB基因型為優(yōu)勢(shì)基因型；其A和B等位基因頻率分別為0.63和0.37，可知A等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因；而在青灰色被毛群體中，存在AA、AB和BB 3種基因型，其基因型頻率分別為0.32、0.54和0.14，由此可知AB基因型為優(yōu)勢(shì)基因型；其A和B等位基因頻率分別為0.59和0.41，可知A等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，MC1R基因的基因型頻率在4種毛色羊中的分布差異極顯著（P<0.01）。

圖7 MC1R突變點(diǎn)不同基因型測(cè)序峰圖

表3 哈薩克羊MC1R基因遺傳參數(shù)

2.7 MC1R基因遺傳參數(shù)分析 由表3可知，MC1R基因在該哈薩克羊群體中黑色與青灰色均處于中度多態(tài)（0.25

3 討 論

大量研究表明，多數(shù)脊椎動(dòng)物MC1R基因的突變能夠引起毛色的變化，如小鼠、牛、馬、雞、狐貍、豬、綿羊、山羊和狗，均發(fā)現(xiàn)毛色由淺變深；對(duì)人的研究亦是如此[10]。對(duì)小鼠進(jìn)行遺傳學(xué)研究表明 ，MCIR是一種獨(dú)特的具有雙功能控制的受體。對(duì)豬的 MC1R 基因已經(jīng)定位 ，并且已建立了PCR-RFLP技術(shù)來(lái)檢測(cè)不同豬種的等位基因的多肽。研究發(fā)現(xiàn)綿羊中的extension 等位基因?yàn)镋D， 從而導(dǎo)致顯性的黑色毛色。Vage等[11]分析了黑色被毛綿羊的MC1R基因，發(fā)現(xiàn)其存在2個(gè)突變即Asp121Asn 與Met73Lys。而對(duì)引進(jìn)鼠的相對(duì)應(yīng)的MC1R 基因進(jìn)行藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Met73Lys突變點(diǎn)是組成型活性的MC1R，其可能是導(dǎo)致綿羊的黑色毛色的主要原因[8]。姜俊兵等[12]實(shí)驗(yàn)證明，羊駝MC1R基因中存在著單鏈構(gòu)象多態(tài)性，存在AA和AB 2種基因型。

表2 MC1R基因頻率和基因型頻率的分布以及Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗(yàn)

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MC1R基因突變的AB基因型與黑色被毛極顯著相關(guān)，說(shuō)明該位點(diǎn)對(duì)黑色被毛有顯性作用，這與Vage等[11]報(bào)道的顯性黑等位基因（ED）控制黑色被毛的結(jié)果相一致。本研究發(fā)現(xiàn)，哈薩克羊被毛的顏色與MC1R基因有密切聯(lián)系，它的突變決定著黑色和青灰色被毛的性狀，且在黑色與青灰色被毛中AB基因型所占頻率大。MC1R基因的基因型頻率在4種毛色羊中的分布差異極顯著。黑色與青灰色被毛中存在AA、AB和BB 3種基因型，與李洪濤等[9]的結(jié)果有一定差異；而在白色和棕色群體中僅存在BB基因型，與李洪濤等[9]的結(jié)果有一定的相似性。李洪濤等[9]將MC1R和ASIP進(jìn)行基因型聯(lián)合分析時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)毛色有互補(bǔ)效應(yīng)，說(shuō)明控制哈薩克綿羊黑色被毛的主要基因是MC1R。對(duì)于綿羊的白色和棕色可能存在著其他位點(diǎn)的調(diào)控。有報(bào)道稱，Spotting位點(diǎn)決定著綿羊的白色被毛[13]，Slc7a11 位點(diǎn)與綿羊的棕色被毛相關(guān)。而本研究Slc7a11基因位點(diǎn)在本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用PCR-SSCP技術(shù)并未檢測(cè)到其多態(tài)性，有待進(jìn)一步研究。

經(jīng)皮膚組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)在白色被毛組織中，毛囊分布密集且均勻；皮脂腺分布密集較為發(fā)達(dá)[14]。在黑色被毛皮膚組織中，毛囊分布較白色分布稀疏，皮脂腺發(fā)達(dá)并且分布均勻。在青灰色皮膚組織中，與黑色皮膚組織極為相似，毛囊分布稀疏，皮脂腺發(fā)達(dá)，分布均勻。在棕色皮膚組織中，形成了明顯的毛囊叢，單一的毛囊叢中毛囊分布密集，毛囊叢之間分布較為離散，皮脂腺不發(fā)達(dá)[15]。黑色與青灰色皮膚組織觀察極為相近，而白色與棕色各具特色，白色毛囊密集或許因白色毛發(fā)吸收光的能力較弱因而保暖更為密集，而其他顏色相對(duì)白色對(duì)光的吸收能力強(qiáng)，棕色形成了明顯的毛囊叢，此原因有待進(jìn)一步研究。棕色皮脂腺較其他顏色不發(fā)達(dá)，也許與毛囊叢的形成在組織學(xué)中有一定的關(guān)系，有待專業(yè)人士進(jìn)一步分析。

4 結(jié) 論

本研究分析了MC1R和 Slc7a11基因多態(tài)性與哈薩克綿羊被毛顏色之間的關(guān)系。結(jié)果表明，哈薩克羊被毛顏色與MC1R基因有密切聯(lián)系，且在黑色與青灰色被毛中AB基因型所占頻率大。MC1R基因的基因型頻率在4種毛色羊中的分布差異極顯著。Slc7a11基因位點(diǎn)在此群體中運(yùn)用PCR-SSCP技術(shù)未檢測(cè)到多態(tài)性。由組織形態(tài)學(xué)可知，黑色與青灰色被毛組織毛囊分布極為相似；棕色被毛最具特色，毛囊叢分布明顯，皮脂腺分布不發(fā)達(dá)；白色被毛毛囊分布最為密集，且皮脂腺分布密集并且最為發(fā)達(dá)。

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S826.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-10-039

2017-03-31；

2017-04-05

農(nóng)業(yè)部體系項(xiàng)目（CARS-40）；疆農(nóng)業(yè)大學(xué)產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合培養(yǎng)研究生示范基地項(xiàng)目（xjaucxy-yjs-20152011）

何軍敏（1991-），女，新疆烏蘇人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物遺傳育種的研究，E-mail: 1415230131@qq.com

*通訊作者：黃錫霞（1963-），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種的研究，E- mail：au- huangxixia@163.com